이 연구에서는 기능화 된 엘라스토머 캔틸레버 암을 갖춘 생물학적 액추에이터와 자체 안정화 수영 biorobot에 심근 세포를 뿌리고 배양하여 시간에 따른 생화학 및 생체 역학 특성을 분석했습니다.
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방법 논문
심장 근육 세포 기반 액츄에이터 및 자체 안정화 바이오 오봇 - 제 2 부
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
최근에는 합성 기계적 백본과 통합 된 살아있는 세포 또는 조직 구성 요소로 구성된 하이브리드 장치가 개발되었습니다. 비 오로봇 (biorobots)이라고 불리는이 장치는 살아있는 구성 요소의 수축 활동에서 생성 된 힘에 의해서만 구동되며, 많은 고유 한 이점으로 인해 기존의 완전 인공 로봇의 대안이 될 수 있습니다. 여기서는이 두 부분으로 구성된 기사의 첫 번째 부분에서 설계, 제작 및 기능화 된 생물학적 액추에이터와 바이오 오봇을 시드하고 특성화하는 방법을 설명합니다. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 염기 및 박막 캔틸레버로 구성된 조작 된 생물학적 액추에이터 및 바이오 오봇 장치를 피브로넥틴으로 세포 부착을 위해 작용 화시켰다. 기능화 후에, 신생아 쥐의 심근 세포를 고밀도로 PDMS 캔틸레버 팔에 파종하여 합류 세포 시트를 얻었다. 장치는 매일 이미지화되었고 캔티 (canti)의 움직임레버 암이 분석되었다. 파종 후 2 일째에, 우리는 자발적 수축 중에 세포에 의해 가해지는 힘으로 인한 외팔보의 굽힘을 관찰했다. 캔틸레버 벤딩 (cantilever bending)의 정량 분석에서, 세포가 시간에 따라 성숙함에 따라 표면 스트레스가 점진적으로 증가하는 것이 관찰되었다. 마찬가지로, 우리는 지느러미 역할을하는 PDMS 외팔보 암 (cantilever arm)의 작동으로 인해 생체 로봇의 움직임을 관찰했다. 장치의 수영 프로파일을 정량화함에 따라, 핀의 정지 각도에 의해 영향을받는 다양한 추진 모드가 관찰되었다. 운동 방향과 고동 주파수는 지느러미의 정지 각도에 의해서도 결정되었고, 142μm / s의 최대 수영 속도가 관찰되었다. 이 원고에서 우리는 조작 된 장치를 심근 세포로 채우는 과정과 생물학적 액추에이터 및 바이오로봇 활동을 평가하는 절차를 설명합니다.
서론
바이오 오봇 (Biorobots)은 일반적으로 PDMS 나 하이드로 겔 (hydrogels)과 같은 부드럽고 신축성있는 물질로 구성된 기계적 백본에 통합 된 살아있는 세포를 기반으로 한 장치입니다. 세포는 자발적으로 또는 자극에 반응하여 리듬 수축을 겪고, 따라서 액츄에이터로서 기능한다. 세포 수축으로부터 생성 된 힘은 다양한 바이오 오봇 (biorobot)을 유도합니다. 포유 동물의 심장 세포 (cardiomyocytes)와 골격 근육 세포는 수축 특성으로 인해 비오 로봇의 작동에 종종 사용됩니다. 심근 세포와 골격근 세포 외에 곤충 근육 조직 2 와 외과 근육 조직 3 과 같은 다른 세포 유형이 사용되었습니다. 곤충 근육 조직은 실온에서 생물학적 액추에이터의 작동을 가능하게합니다.
biorobot의 기능과 성능은 주로 생물학적 액추에이터의 강도와 일관성에 의해 결정됩니다 ( 즉,. 근육 세포), 기계적 백본 구조는 주로 운동, 안정성 및 힘의 메커니즘을 결정합니다. 이러한 장치는 전지에서 발생하는 힘에 의해서만 구동되기 때문에 화학적 오염 물질이나 작동 소음이 없습니다. 따라서 다른 기존 로봇에 비해 에너지 효율적인 대안을 형성합니다.....
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 절차는 승인 된 프로토콜을 사용하여 수행되었으며 Notre Dame 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 세포 배양 및 배양
- 시작하기 전에 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 1 % 페니실린 항생제 (DMEM 완결)가 첨가 된 작은 깔때기, 피펫 및 따뜻한 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)을 준비하십시오.
- 기능화 된 장치 (생물 학적 액추에이터 또는 biorobot)와 함께 T - 25 플라스크를 가져 가라. 세포 배양에 앞서 장치 준비, 기능화 및 보관에 대한 자세한 내용은이 두 부분으로 된 원고의 1 부 4 절을 참조하십시오.
- 작고 정사각형 인 플라스틱 시트를 굴려서 깔때기를 준비하십시오. T-25 플라스크 안의 생물학적 액츄에이터 또는 바이오 오봇 위에 놓습니다. 넓은 장치의 직경을 장치 전체에 맞게 조정하십시오.플라스크의 상단이 단단히 조여 질 때 높이가 맞아야합니다.
- biorobots 들어, 자장 과정을 통해 플라스크의 바닥에 장치를 개최 자석을 사용합니다.
참고 : 여기에는 하나의 네오디뮴 디스크 자석 (직경 1.26 ")이 ....
- biorobots 들어, 자장 과정을 통해 플라스크의 바닥에 장치를 개최 자석을 사용합니다.
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결과
얇은 PDMS 캔틸레버 (두께 25 μm)와 심근 세포로 만들어진 생물학적 액추에이터는 그림 1 의 장치의 개략도와 스크린 샷에서 볼 수 있듯이 수영 biorobot의 핵심을 구성합니다. 세포는 배양에서 24 시간 후에 수축을 나타 내기 시작하고, 외팔보의 굽힘은 날 2에 의해 관찰되었다. 장치의 측면 프로필은 매일 기록되었고, 표면 스트레스는 칸틸 레버 암을 사용하여 캔틸레버 팔의 굽힘으로부터 정량화되었다 맞춤 이미지 분석 스크립트 7 . 정적 및 동적 응력은 매일의 표면 응력으로부터 추출되었다 ( 그림 2a ). 정적 응력 (세포 견인력)은 세포가 휴식 상태에서 표면 상에 나타나는 수축 응력이고 동적 응력 (세포 수축력)은 최대 수축시 세포에 의해 생성 된 응력이다.
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토론
여기에 설명 된 절차는 PDMS 기반 액추에이터 및 biorobots에 대한 성공적인 시딩 방법을 설명하며, 이는 심근 세포의 부착을 용이하게합니다. 또한, 세포의 행동과 장치의 성능을 특징 짓는 이미지 수집 및 후속 분석 프로세스가 설명되었습니다.
우리는 24 시간 후 cantilever arms에서 세포의 자발적 수축을 관찰했다. 수축의 강도는 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가하여 6 일째에 최대 값에 도달했다. 그 후 강도는 천천히 감소했다. 생물학적 액츄에이터의 캔틸레버 암은 길이가 4mm 밖에되지 않았지만, 특히 배양 6 일 후에 최대 2.5mm의 큰 처짐이 관찰되었습니다. 낮은 영률 (750 kPa)과 캔틸레버의 극도로 낮은 두께 (25 μm)는 이러한 큰 처짐을 허용하여 비 오로봇의 강력한 추진력을 이끌어 냈습니다. 기계적 특성을 평가하기 위해우리는 매일 세포 수축과 견인력을 측정했습니다. 박막 캔틸레버는 cardiomyocytes 또는 기타 근육 세포에 의해 유도.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
MT Holley는 Louisiana Board of Regents의 Graduate Fellows 프로그램에서 지원하고 C. Danielson은 Howard Hughes Medical Institute 교수 프로그램의 지원을받습니다. 이 연구는 NSF 보조금 번호 : 1530884에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Chemicals and reagents | |||
| Cardiomyocytes (primary cardiac cells) | Charles River | NA | Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats |
| Dulbecco' s 변형된 독수리' s 매체 (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate |
| Fetalclone III serum | Hyclone industries, GE | 16777-240 | Fetal bovin serum (FBS) |
| Dulbecco' s 인산염 완충액(PBS) | 시그마-알드리치 | D1408-100ML | |
| 페니실린-G 나트륨염 | 시그마-알드리치 | P3032 | |
| 염소 혈청 | 시그마-알드리치 | G9023 | |
| 4,6-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로콜라이드 분말(DAPI) | 시그마-알드리치 | D9542 | |
| 소 혈장에서 추출한 피브로넥틴 | 시그마-알드리치 | F1141 | 용액(1 mg/ ml) |
| Calcein-AM 및 ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay) | Molecular Probes | L3224 | |
| Calcium Fluo-4, AM | Molecular Probes | F14217 | 칼슘 지시약 염료 |
| Tyrodes 염 용액 | Sigma-Aldrich | T2397 | 완충 용액 |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P3000MP | 디메틸실록산(DMSO) 내 비이온성 계면활성제-20% 용액 |
| 16% 파라포말데히드 | 전자 현미경 | 15710 | 주의: 자극성 및 가연성 |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | x-100 100mL | 세포 용해 세제, (4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜, t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르) |
| ProLong 금 퇴색 방지 시약 | 분자 프로브 | P10144 | 장착제 |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Molecular Probes | A12381 | Actin 필라멘트 마커 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | A-11012 | |
| pha | Molecular Probes | A-11001 | |
| Anti-connexin 43 항체 | Abcam | ab11370 | 갭 접합 마커 |
| Anti-cardiac troponin I 항체 | Abcam | ab10231 | 수축 단백질 |
| 16% EM 등급 파라포름알데히드 용액 | 전자 현미경 | 100503-916 | |
| 폴리디메틸실록산(PDMS) | 엘세비어 | 실가드 184 | |
| 재료 및 장비 | |||
| Camera | Thor Labs | DCC1545M | |
| LED 조명 스트립 | NA | NA | 스펙트럼 방출이 없는 모든 백색 LED |
| 컨포칼 현미경 | Nikkon C2 | NA | 3개의 필터 세트가 있는 컨포칼 현미경. |
| 줌 렌즈 | 인피니티 | 모델# 252120 | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks | NA | 섹션 4에서 사용됨) 생물학적 액추에이터 분석용. |
| 이미지: J | National Institute of Health | NA | Java 기반 이미지 처리 소프트웨어. 섹션 5)에서 바이오 로봇 분석을 위해 사용됩니다 . Java의 무료 이미지 처리 및 분석 소프트웨어. (https://imagej.nih.gov/ij/) |
| Thor Cam | Thor Labs | NA | 카메라 운영 소프트웨어 |
참고문헌
- Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
- Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274(2012).
- Herr, H....
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재인쇄 및 허가
