조직학 분석 및 대사 프로 파일링에 대 한 마우스 췌의 해 부

요약

이 비디오 문서는 조직학 분석 및 대사 프로 파일링에 대 한 해 부는 마우스에서 췌를 성공적으로 제거 하는 데 필요한 절차의 상세한 데모를 제공 합니다.

초록

우리는 조사 하 고 췌 특정 전사 인자, 1a cre-recombinase; lox 그만 lox-순 영 쥐 육, aspartic 산 12 codon에 글리신 (Ptf1a^{cre / +}; LSL-Kras^{G12D / +}) 인간 췌장암의 모델로 스트레인 마우스. 우리의 현재 연구의 목표는 췌장암 진행의 소설 대사 생체 식별 하입니다. 우리는 소변, 대변, 혈액, 그리고 췌 장 조직 추출, 뿐만 아니라 암 진행을 췌 장의 조직학 분석의 대사 프로 파일링을 수행 했습니다. 마우스 췌 하지 인간, 같은 잘 정의 된 고체 기관 이지만 오히려 마우스 내부 해부학에 익숙하지 않은 개인 또는 개인 거의 또는 전혀 경험 수행에 의해 쉽게 식별 되지 않으면 만들어진다 분산된 부드러운 조직 마우스 장기 해입니다. 이 문서의 목적은 현명한 상세한 제공 하는 시각적 데모 해 부에 의해 마우스 췌 장의 제거에 초보자 가이드. 이 문서는 특히 학생과 새로운 조사 대사 프로 파일링 또는 조직학 분석에 대 한 해 부에 의해 마우스 췌의 수확 필요로 하는 연구에 귀중 한 해야 합니다.

서론

마우스는 인간 췌장암^1,2의 중요 한 동물 모델로 떠오르고 있다. Ptf1a에서^{cre / +}; LSL Kra^{G12D / +} 마우스 모델, 쥐 육 (K-Ras) oncogene은 췌 장, 췌 장, 췌 장 intraepithelial 형성 (PanINs), 그 진행으로 알려져 있는 전 암 병 변의 결과에서 독점적으로 활성화 하는 순 영 췌 장 ductal adenocarcinomas로 일반적으로 불린다 PDACs³. 이 마우스 모델 시스템은 인간의 췌장암^4,5는 PanINs 삶과 자주 내 PDAC 진행의 첫 5 개월 이내 등장 추가 이용에 대 한 최상의 사용 가능한 동물 모델 중 하나는 반면 췌장암 가장 자주 발생 인 간에 있는 나이의 60-70 년 년^4,5, 단일.

Ptf1a에서 해 부에 의해 췌 장의 추출^{cre / +}; LSL Kra^{G12D / +} , 췌 장의 암 개발의 자세한 경도 조직학 시험에 대 한 다양 한 연령대에서 쥐 수 까지의 초기 PanIN 단계에서 진행 PDAC^{3,4 , 5}. 15 개월에 5에서 배열 하는 나가에 수확 하는 췌도 사용할 수 있습니다 준비 조직 질병 조직 ^{건강 한에서 전환 하는 동안 발생 하는 췌 장4 물질 대사에 글로벌 변화 특징을 추출 하 6,7}.

이 문서는 마우스 췌 장 추출 하는 데 필요한 단계의 완전 한 시각적 가이드를 제공 하 고 추가 분석을 위해 췌의 저장에 대 한 지침을 제공 합니다. 이 가이드는 개인 연구를 포함 한 다른 췌 장 질환에 유형 I 당뇨병, 그리고 학생과 새로운 사용 하 여 마우스 췌의 수확과 관련 된 연구 조사에 특히 유용 해야 한다 동등 하 게 가치가 있을 것입니다. 신진 대사 프로 파일링 또는 조직학 분석에 대 한 해 부입니다.

프로토콜

비디오에서 실행 하 고 아래에 설명 된 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 마이애미 대학에 의해 승인.

1. 준비 및 자극 테스트

수술 절차, 수술 및 사후 작업 테이블에 대 한

1. 구축 두 가지 영역. 모든 재료와 필요한 기구 두 영역을 무대. 배기 후드
   1. 무대 운영 테이블. 절차의 지속적이 고 한 시 빨리 벗어나게 성능을 하는 방식으로 장비와 테이블 정렬.
   2. 같은 방에 있는 작업의 주요 테이블 근처 수술 후 테이블을 설정합니다. 절차를 통해 메 마른 환경으로 두 테이블을 유지.
2. 장소 다음 운영 테이블에 공급: 한 유리 항아리 뚜껑, 한 15 mL 튜브, 수술가 위, 70% 에탄올, 두 거품 보드, 두 집게, 두 개의 1 mL 21 게이지 주사기, 두 50 mL 튜브, 1 개의 원심 분리기 튜브의 한 짜기 병의 한 쌍 하나의 극저온 유리병, 4 외과 패드, 10 핀, 살 균 물티슈, 디스펜서 및 sharps 컨테이너.
3. 후 작업 테이블에는 다음 공급 장소: 액체 질소, 얕은 넓은의 4 L dewar dewar, 부동 microtube 랙, 수술가 위 한 쌍, 두 집게, 4 극저온 튜브, 및의 디스펜서 입 하나 하나 분석 균형 살 균 물티슈.
4. 하나 50 mL 및 75% 볼륨 한 15 mL 튜브 포 르 말린에 채울.
5. 한 외과 패드 절 개 보드로 봉사 하는 대략 30 cm x 30 cm 폼 보드 부착 각 모서리에는 핀을 사용 하 여. 나머지 4 개의 핀을 사용 하 여 작업 하는 동안. 수술 패드 장기 수술 테이블에 전송 하는 작은 폼 보드 준비.
   주의: Isoflurane (99.9%)는 독성 화학, 그리고 폐기물 마 취 가스 ⁸의 청소에서 안전의 최대 수준을 보장 하기 위해 환기 후드에서 사용 해야 합니다. 테일러와 묵 ⁸ 기사에 연구자 isoflurane를 사용 하 여 오픈-드롭 방법의 사용과 관련 된 위험에 대 한 추가 정보를 찾을 수 있습니다.
6. 유리 항아리에 담가 isoflurane (99.9%)의 몇 방울과 한 외과 패드를 배치 하 고 마우스는 isoflurane와의 직접 접촉을 방지 하기 위해 정상 종이 타월 장소. 마찬가지로, 외과 패드를 사용 하 여 나머지 튜브 라인 및 isoflurane의 몇 방울으로 적시고 마우스와는 isoflurane 간의 직접 접촉을 방지 하기 위해 정상 추가 패드를 배치 하.
7. Dewar 최대 입력 라인까지 도달 얕은 넓은 입으로 액체 질소를 부 어.
8. 장소 마 취로 해 부에 대 한 선택 마우스 챔버, 즉 몇 가지 젖은 패드와 유리 항아리 방울 isoflurane (99.9%) ~ 1 분에 대 한 뚜껑으로 덮여
   참고:이 시간은 마우스 마우스에서 다릅니다. 일단 마우스를 의식이 없는 상공에서 제거 하 고 운영 위원회에 그것을 배치.
9. 고 과학자에서 지적 하는 그것의 머리와 복 부 측 거짓말 그것 있도록 마우스를 방향을 정합니다. 외과 패드 isoflurane (99.9%)의 몇 방울과 젖 줄지어 튜브 안에 머리 놓고 마우스 자극에 응답 하지 않는 되도록 발 핀치에 의해 자극 테스트를 수행 합니다.
   1. 이 테스트가 실패 하는 경우 마우스 응답 발 핀치 테스트 하 반복 단계 1.8.

2. 초기 절 개, 심장 펑크, 및 안락사

1. 외과 폼 보드를 마우스의 사지를 고정 하 고 젖은 70% 에탄올과 마우스의 복 부 측.
2. 집게와 요도 개통 근처 모피/피부를 꼬 집 고 약간 위쪽으로 당겨. 절 개 통해 복 부 구멍 요도 개방은 중간에서 시작 하 고 턱 끝 수술가 위 확인 합니다.
   1. 초기 절 개의 시작 지점 근처는 집게와 모피/피부의 한쪽을 잡아 하 고 만들고 다른 절 개는가 위 아래로 대각선 쪽으로 다시 발.
   2. 반대편에 같은 방식으로이 반복.
      참고: 모피/피부 만들 넓은 개방을 고정 수 있습니다 하지만 필요 하지 않습니다.
3. 마음 찾아서 주사기 바늘의 막힘을 방지 하기 위해 심장 주위 sac는 심 낭을 제거.
4. 는 집게와 심 낭을 파악 하 고는 위로 잘라. 신중 하 게 뛰는 심장에 주사기 바늘을 삽입 하 여 심장 펑크를 수행 하 고 철회 플런저를 천천히 시작.
   1. 최적의 혈액 컬렉션 사용 하 여 바늘의 플런저 심장의 펌핑 작업을 모방 하 고 너무 빨리 그리기 방지.
      참고: 일반적으로 약 1 mL의 혈액 수집 될 수 있습니다.
   2. 원심 분리기 튜브 및 sharps 용기에 주사기의 dispose에 혈액 혈액 컬렉션을 마친 후 불식.
   3. 심장 찔린 수행 된 후 마음을 연결 하는 첨부 파일을 제거 하 여 안락사를 실시.
      참고: 헤 파 린, 항 응고 제는 혈 청이 특정 연구에 컬렉션에 대 한 응고 혈액을 있도록 심장 찔린 전에이 절차에서 주사기에 추가 되지 않았습니다. 그러나, 경우 연구원 플라즈마를 수집 혈액 응고를 방지 하 고 싶 었, 헤 파 린에 추가할 수 있는 심장 찔린 이전 주사기.
5. 연구는 마우스의 유전형을 포함 하는 경우는 위는 귀 부분을 싹 둑 하 고 유전자 확인에 대 한 원심 분리기 튜브.

3. 췌 장 추출

1. 찾기 마우스의 왼쪽에 위. 시작은 부드럽게 (피하기 찢 어) 두 개의 집게를 사용 하 여 위장 및 십이지 장 췌 분리.
   참고: 위 및 내장에서 췌를 분리 하는 경우 매우 중요 하다는 집게 장기에서 췌 장 조직 안내 하 고 하지 분쇄는 집게와 췌 눈물 부드럽게 사용 됩니다.
   1. 소장 공장 및 회장 섹션에서 췌 구분 하 고 마지막으로 장 caecum에서.
2. Caecum에 집게를 재배치 하 고 계속 항문 쪽으로 나머지 결 따라 췌의 분리.
   참고:이 시점에서 그것은 편리 잘라내어 콜론 항문 바로 앞의 지역에서 위 부분을 제거.
3. 췌 찾아서 비장을 첨부 합니다. 마우스의 오른쪽을 향해 췌를 밉니다. 췌 장 및 인접된 비장 완전히 분리 집게 췌와 흉 강 사이 나머지 연결 구분.
4. 췌를 제거 하 고 시험을 위해 그것을 밖으로 확산. 식별 용 췌에 연결 된 비장을 둡니다.
   1. 제거 모든 결합 조직, 지방과 mesenteric 조직에서 췌 장.
      참고:이 조직의 색깔에 하얀 이며 따라서 컬러로 pinker는 췌 장 조직에서 쉽게 구분할 수 있습니다. 이것은 췌 장 전체를 제거 해야 하는 경우에 특히 중요 하다입니다. 예를 들어, 췌 장의 무게와 몸 무게에 또는 동물의 그룹 사이 비교 하는 경우. Ptf1a에서 ^{cre / +}; LSL Kra ^{G12D / +} 마우스 모델 이전 달에서 특히 하드 섬유 췌 장 조직 있을 수 있습니다. 이 경우에, 장내 종양 조직에 인터레이스 수로 췌의 주의 제거를 실시 해야 합니다. 고급의 경우에서 비정상적인 비장 및 간 조직 또한 존재할 수 있습니다.
5. 원하는 경우이 시점에서 다른 장기를 제거.

4. 데이터 수집 및 저장

1. 장기의 적 출, 후 보존을 위한 수술 후 영역에 샘플 이동.
2. 각 장기의 무게 및 그들의 각각 극저온 유리병에 넣어.
   참고: 따라 위트h 질량 각 샘플의 부정은 나중에 참조할에 기록 되어야 합니다.
3. 장기 무게는 일단 스냅 동결에 액체 질소에 그들을 배치.
4. 스냅 동결 후 장기 저장을 위한-80 ° C에서 장기 저장.
5. 벤치 위에 하룻밤 말린 저장 샘플을 배치 하 고 다음날 아침 그들의 솔루션 포 르 말린에서 70% 에탄올으로 변경.
   참고: 이러한 샘플은 장기 저장을 위한 4 ° C에 저장 되어야 합니다.
6. 장기 저장용 고정-80 ° c.에 혈액과 귀 펀치. 혈액에서 혈 청 수집, 30 분 동안 응고 후 그것을 원심 혈액을 수 있습니다. 피 펫을 사용 하 여 혈 청 부분을 제거 하 고 다음-80에 저장 ° c.

5. Clean Up

1. Sanitize 모든 해 부 도구 살 균 물티슈. 모자는 isoflurane 늘어서 튜브 수술 패드를 젖 었. 신선한 외과 패드에 폼 보드에 외과 패드를 바꿉니다. 처분 시설 당 하지 수집 된 마우스의 부분 ' s 동물 처리 정책.

결과

그림 2 는 게시물 작업 영역 및 그림 1 운영 환경 영역에 대 한 개요를 보여준다. 이 설정은 최소한의 장비를 제공 하는 동안 준비, 개인에 가장 개인적인 필요에 맞게이 변경 하도록 선택할 수 있습니다. 프로토콜은 실험의 특정 요구에 따라 최적화 되어야 합니다. 이 절차는 필요 적절 한 euthanization⁹, 마우스의 생활을 종료 하는 방식으로 실시 됩니다. 연구원은 준비, 마우스 isoflurane 젖은 패드 (그림 3)와 함께 마 취 챔버에 배치 됩니다.

마우스 의식이 일단 마우스를 제거 하 고 보드에 등 쪽을 놓습니다. 발가락-핀치 절차 마우스 통증 ...

토론

기존의 방법에 관하여 의미
마우스 해의 다른 비공식적인 동영상 존재 하는 동안이 비디오 문서에서는 첫 번째 전문 품질, 피어 검토, 자세한 단계를 추출에 필요한 해^{10 부에 의해 마우스 췌의 수확의 모든 시각적 데모} . 신진 대사 활동 및 인슐린에 대 한 주요 기관 되 고 췌와 생산, 해 부와 췌의 수확 생리 특성¹¹의 보존에 대 한 수 있습니다. 췌, 분리 하 여 미래의 분석 샘플에 실시 수 있습니다. 이 절차는 비교와 같은 시간 프레임 내에 동일한 유기 체 내의 다른 조직에서 상호 작용의 연구에 대 한 수 있습니다.

기술의 한계
이 절차의 가장 큰 한계의 마우스의 생활, 경도 컬렉션 방지 및 동일한 마우스에서 여러 조직 샘플의 샘플링입니다. 나이, 성별, 또는 다른 수량자에 관련 된 트렌드를 분석 하기 위하여 횡단면 인구...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
유리병	코닝	3140-150	영상에 사용된 유리병은 단종되었습니다. 이것은 그것을 대체합니다.
유리병 뚜껑	Corning	9985-150	영상에 사용된 유리병 뚜껑은 단종되었습니다. 이것은 그것을 대체합니다.
15 mL 팔콘 튜브	Fisher Scientific	339650
수술용 가위	Fisher Scientific	9201
스퀴즈 병	Fisher Scientific	03-409-10DD
100% 에탄올	Fisher Scientific	22-032-103
포르말린	Fisher Scientific	245-684
폼 보드	테라팩	562908
겸자	Fisher Scientific	200205SHN
1 mL 21G 주사기	BD Biosciences	309624
50 mL 팔콘 튜브	Fisher Scientific	339652
2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	02-681-258
수술용 패드	Fisher Scientific	S67011
T-핀 길이:  2"	사전 상점 제품	X32T-05
살균 물티슈	전문 일회용품 국제 Inc.	Q85084
샤프 컨테이너	피셔 사이언티픽	14-827-122
분석 저울	마샬 사이언티픽	ME-AE200
4L 듀어	테일러-와튼	4LD
얕은 와이드 마우스 듀어	피셔 사이언티픽	F3087-V
플로팅 마이크로튜브 랙	VWR	60986-100
극저온 바이알 1.2 mL, 멸균	Fisher Scientific	10-500-25
이소감각(이소플루란)	Henry Schein 동물 건강	050033
액체 질소	라이트 형제	NIT-60-XX
마우스 크라스 균주	잭슨 연구소	OO8179
마우스 크레 균주	MMRRC	OOO435-UNC