이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
혈소판은 혈관 침범을 봉쇄하기위한 혈전 형성의 지혈에 필수적인 요소입니다. 또한 혈전증, 혈관을 막아 장기를 손상시키는 혈전 형성에 생명을 위협하는 결과를 초래합니다. 이것은 혈소판 기능에 대한 과학적 연구와 흐름 조건에서 일어날 때 세포 생물학적 과정을 추적하는 방법 개발의 동기를 부여합니다.
혈소판 접착 및 응집의 연구를 위해 다양한 유동 모델을 사용할 수 있는데, 혈소판 생물학의 두 가지 주요 현상입니다. 이 연구는 활성화 동안 혈류에서 실시간으로 혈소판 탈과립을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 와이드 필드 역전 된 LED 기반 형광 현미경 아래에 놓인 주사기 펌프 셋업에 연결된 유동 챔버를 사용합니다. 여기에 설명 된 설정은 형광으로 표지 된 항체 또는 형광으로 전달되는 다중 형광 물질의 동시 여기를 허용합니다염료. 라이브 셀 이미징 실험 후 커버 유리는 정적 현미경 ( 즉, 공 초점 현미경 또는 주사 전자 현미경)을 사용하여 추가 처리 및 분석 될 수 있습니다.
서론
혈소판은 혈류를 순환하는 무핵 세포입니다. 그들의 주요 기능은 손상 부위에서 혈관 침범을 봉쇄하고 출혈을 막는 것입니다. 이러한 부상 부위에서, 내피 내 콜라겐 섬유가 노출되고이어서 다량 단백질, 폰 빌레 브란트 인자 (VWF)로 덮힌 다. VWF는 세포 표면의 당 단백질 Ibα-IX-V 복합체에 의존하는 메커니즘으로 혈소판과 순환 적으로 상호 작용하여 혈소판의 속도를 늦춘다. 이것은 고 전단 속도에서 특히 중요합니다. 이어서 혈소판은 콜라겐으로부터 활성화 자극을받는 동안 형태 학적 변화를 겪습니다. 이것은 돌이킬 수없는 퍼짐 및 결국 혈소판 응집을 유도한다. 두 공정 모두 혈소판 - 혈소판 혼입을 촉진하기 위해 과립 내용물의 분비에 달려있다. 그 중에서도 혈소판 알파 과립에는 혈소판의 부착과 다리를 돕기 위해 섬유소원과 VWF가 포함되어 있습니다혈소판을 인테그린에 의존적으로 결합시킨다. 혈소판 고밀도 과립에는 혈소판 활성화를 강화시키는 데 도움이되는 칼슘 및 아데노신 디 포스페이트 (ADP)를 비롯한 무기 화합물 2가 포함되어 있습니다. 또한 혈소판에는 (알레르기) 염증 3 매개체, 보체 - 조절 단백질 4 및 혈관 신생 인자 5....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
University Medical Center Utrecht의 지역 의료 윤리위원회 (Medical Medical Committee)는이 연구를 포함한 생체 외 연구 목적으로 혈액을 채취하는 것을 승인했습니다.
1. 솔루션 준비
- 10mM HEPES, 0.5mM Na 2 HPO 4 , 145mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgSO 4 및 5.55mM D- 글루타민을 용해시켜 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) Tyrode 's 완충액을 준비한다. 증류수 내 포도당.
- 완충액의 두 가지 변종을 만드십시오 : pH를 각각 6.5와 7.4로 설정하십시오. 실험 매일에 신선한 완충액을 만드십시오. 표시된 경우 10 ng / mL 프로 스타 사이클린으로 보충하십시오.
- 증류수에 50 MM 트리스와 150 MM NaCl을 용해하여 pH를 9.0으로 조정하여 TRIS - 버퍼 식염수 (TBS)를 준비합니다.
- 85 mM Tri-sodium citrate, 71 mM citric acid 및 111 mM D-glu....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
도 1 은 유동 챔버 및 실험 장치의 이미지를 도시한다. 실리콘 시트의 위치와 치수; 및 배관 연결. 그림 2 는 플로우 챔버의 치수에 대한 세부 사항을 제공합니다. 그림 3 과 영화 1 은 고정 된 VWF에 혈소판 접착 및 퍼짐의 이미지의 시계열을 보여줍니다. CD63은 쉬고있는 혈소판의 세포 내 고밀도 과립 막에 삽입 된 막 관통 단백질이다. 혈소판 표면에 시간 의존적으로 동원되어 녹색으로 표시됩니다. 유사하게, P- 셀렉틴 (Psel)은 쉬고있는 혈소판의 세포 내 알파 - 과립 막에 삽입 된 막 횡단 단백질이다. 혈소판 표면에 시간 의존적으로 동원되어 오렌지색으로 표시됩니다. 도 3b 는 45 ° 각도에서의 대표 이미지, .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
전 세계적으로 혈전증은 사망 및 이환율의 주요 원인이며 혈소판은 그 발달에 중심적인 역할을합니다. 이 작품은 흐름 아래 혈소판 degranulation의 라이브 셀 이미징을위한 방법을 설명합니다. 일반적으로 혈소판이 활성화되면 모든 세분화 된 내용물이 직접 용액으로 방출된다고 가정합니다. 수반되는 결과는 이것이 꼭 그런 것은 아니라는 것을 암시한다. 접착 및 탈과립시 혈소판은 상당량의 폴리 인산염을 보유합니다 ( 그림 4 ). 또한, multimeric 단백질 VWF는 degranulation 후 혈소판 표면과 관련이있다 ( 그림 5 ). 이것은 혈소판 과립 탈과립을 조절하는 분자 기작이 일반적으로 추정되는 것보다 미묘 함을 나타냅니다.
유동 하에서 혈소판 탈과립의 생세포 이미징을 가능하게하기 위해, 실험 조건은 혈소판 응집을 최소로 유지하도록 선택되었다. 혈소판 검사150,000 혈소판 / μL의 ts가 사용되었다.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
CM은 C1- 저해제 결핍증 (HAEi), Vladen van Het UMC Utrecht 및 수혈 연구를위한 Landsteiner 재단 (LSBR)에 대한 국제 환자기구의 재정 지원을 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2HPO<>4 | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4 | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glucose | Merck KGaA | 1.04074 | |
| 프로스타사이클린 | 케이맨 화학 | 18220 | |
| 트라이 나트륨 시트레이트 | Merck KGaA | 1.06448 | |
| 구연산 | Merck KGaA | 1.00244 | |
| 커버 안경 | Menzel-Glä ser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, 1 번 = 0.13 - 0.16 mm 두께. |
| 염색황산(2% CrO3) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand factor (VWF) | in-house purified | ||
| Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | FIB3L | |
| 4웰 디쉬, 비처리 | Thermo Scientific | 267061 | |
| Human Serum Albumin Fraction V | Haem Technologies Inc. | ||
| 혈액 수집 튜브, 9 mL, 9NC 응고 나트륨 시트레이트 3.2% | Greiner Bio-One | 455322 | |
| 세포 분석기 | Abbott Diagnostics | CELL-DYN 혈액학 분석기 | |
| 파라포름알데히드 | 시그마 | 30525-89-4 | |
| 주사기 펌프 | 하버드 장치, Holliston, MA | 하버드 장치 22 | |
| 10 mL 주사기와 14.5 mm 직경 | BD 생명과학 | 305959 | Luer-Lok 주사기 |
| Anti-CD63-biotin | 아브캠 | ||
| 안티-CD62P-비오틴 | R& D 시스템 | Dy137 | |
| 4',6-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드 (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Scientific | S11223 | |
| 이머젼 오일 | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| 세제 솔루션 | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| 폴리비닐 알코올 | 시그마 | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| 트리스 하이드로 클로라이드 | 시그마 | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| 양 Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| 글리세롤 | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn 필름 | Bemis | PM-996 | 4 인치 x 125 피트 롤. |
| 실리콘 시트 비강화 | Nagor | NA 500-1 | 200mm x 150mm x 0.125mm. |
| 맞춤형 절단 실리콘 시트는 | 자체 제작 | 실리콘 시트 비강화 (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL 튜브 | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| 형광 현미경 | Zeiss Observer Z1 | LED 여기 조명을 갖추고 있습니다. | |
| 현미경 소프트웨어 | Zeiss ZEN 2 | 블루 에디션 | |
| 18 G 바늘 (18 G x 1 1/2") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| 플라스틱 파스퇴르 피펫 | VWR | 612-1681 | 7 mL 비멸균, 최대 3 mL까지 눈금이 매겨집니다. |
| 실리콘 튜브 | VWR | 228-0656 | 내경. x 외경 x 벽 두께 = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| 현미경 슬라이드 | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1mm, 접지 가장자리 45°C, 끝단에 젖빛 끝단이 있습니다. |
참고문헌
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013). <....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
