Method Article

Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

DOI:

10.3791/55689

⸱

June 27th, 2017

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

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DNA- 단백질 상호 작용은 여러 생물학적 과정에 필수적입니다. 세포 기능을 평가하는 동안 DNA- 단백질 상호 작용의 분석은 유전자 조절을 이해하는 데 없어서는 안될 필수 요소입니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 생체 내에서 그러한 상호 작용을 분석하는 강력한 도구 입니다.

Abstract

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DNA 복제 및 수리, DNA 재조합 및 유전자 발현을 포함한 여러 세포 과정은 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 필요로합니다. 따라서 DNA- 단백질 상호 작용은 세포 분화, 세포 증식, 세포주기 조절, 염색체 안정성, 후성 유전자 조절 및 세포 변형과 같은 여러 생리적, 병리 생리 학적 및 생물학적 기능을 조절합니다. 진핵 세포에서 DNA는 히스톤 및 비 히스톤 단백질과 상호 작용하고 염색질로 응축됩니다. 전기 이동 (젤) 이동성 이동 분석 (EMSA) 및 DNase I 발자국과 같은 몇 가지 기술 도구를 사용하여 DNA- 단백질 상호 작용을 분석 할 수 있습니다. 그러나 이러한 기술은 세포 내에서가 아니라 in vitro에서 단백질 -DNA 상호 작용 을 분석합니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 특정 DNA 결합 부위에서 단백질을 포착하여 DNA- 단백질 상호 작용을 확인하는 기술입니다s의 염색질 컨텍스트 내에서. 이것은 DNA- 단백질 상호 작용을 고정시킨 후 관심 단백질의 면역 침전에 의해 이루어진다. 이어서, 단백질이 결합 된 게놈 부위가 특성화된다. 여기에서 우리는 ChIP를 기술하고 논의하고 티로신 - 아밀로오스의 프로모터 영역 내에서 전사 인자 SMAD2의 SMAD 결합 요소 (SBE) 로의 형질 전환 성장 인자 -β (TGF-β) - 유도 된 결합의 동정을위한 분석적 가치를 입증한다. 단백질 키나아제 키트 (c-KIT) 수용체 리간드 줄기 세포 인자 (SCF).

Introduction

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진핵 생물의 핵에서는 DNA가 히스톤 단백질과 비 히스톤 단백질과 상호 작용하고 염색질로 응축된다. 생리 학적, 병태 생리 학적 및 세포 생물학적 상황에서 세포 기능은 염색질 - 조정 된 유전자 발현에 의해 공간적 및 일시적으로 조절된다. DNA- 단백질 상호 작용은 DNA 복제, 재조합 및 수리뿐만 아니라 단백질 발현과 같은 세포 과정의 조절에 필수적인 역할을한다. 따라서, DNA- 단백질 상호 작용의 분석은 유전자 발현 및 세포 기능의 평가에 없어서는 안될 도구입니다.

Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA)와 DNase I footprinting 1,2 와 같은 시험 관내에서 DNA- 단백질 상호 작용을 평가하는 몇 가지 기술이 있습니다. 그러나 이러한 기술은 염색질 및 세포 내에서 단백질 -DNA 상호 작용을 분석하지 못합니다. 칩 i이 기술은 특정 DNA 결합 부위에 결합 된 단백질을 포착하여 염색질 컨텍스트 내에서 DNA- 단백질 상호 작용의 확인을 용이하게합니다. 이 기술은 원래 Gimour와 Lis가 Escherichia coli 와 Drosophila melanogaster

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Protocol

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1. 솔루션 준비

  1. 각 실험마다 다음과 같은 해결책을 준비하십시오.
    1. 고정 솔루션을 위해서는 37 % 포름 알데히드를 준비하고 RT에 보관하십시오. 1.42 %의 최종 농도로 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)로 희석한다.
      주의 : 포름 알데히드는 자극성, 부식성, 돌연변이 성, 기형 발생 성 및 발암 성으로 분류됩니다. 섭취하지 마십시오. 가스 / 흄 / 증기 / 분무를 흡입하지 말 것. 환기가 충분하지 않은 경우 적절한 호흡 장비를 착용하십시오. 피부 및 눈과의 접촉을 피하십시오. 산화제, 환원제, 산성 물질, 알칼리성 물질 및 습기와 같은 비 양립성 물질로부터 멀리하십시오.
    2. 글리신 정지 - 수정 솔루션을 위해, 1x PBS 솔루션 0.125 M 글리신을 준비하고 RT에 저장하십시오.
    3. 세포 스크래핑 솔루션, dH 2 O에 1x PBS 솔루션을 준비하고 얼음에 저장하십시오. 사용 직전에 proteinase inhibitor 인 phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) t최종 농도 0.5 mM.
      주의 : PMSF는 부식성 및 독성으로 분류됩니다. 보호 복을 착용하고 통....

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Results

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동족 수용체 복합체에 대한 TGF-β1 리간드의 결합은 SMAD2 / 3 전사 인자의 세린 - 인산화를 초래하고,이어서 공통 매개체 인 SMAD4와의 결합을 일으킨다. SMAD 복합체는 핵으로 전이합니다. TGF-β는 SMAD가 표적 유전자의 조절 영역 내 SBE에 직접 결합하거나 SMAD가 조절하는 표적 유전자의 발현을 조절하는 전사 조절 자나 억제 자의 표현을 통해 간접적으로 유전자 전사를 조절할 수있다. c-KIT 리간드 SCF가 SMAD2의 직접 프로모터에 대한 TGF-β1 유도 결합에 의해 전사 조절되는지를 시험하기 위해, 우리는 SCF 유전자의 SCF 프로모터를 포함하는 2.4kb, 5 ' SMAD2 결합 모티프, 5'-AGAC-3 '(SBE) 13 , 14 . 우리는 7 개의 추정 SBEs 업을 확인했습니다.SCF 시작 코돈 (

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Discussion

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이 보고서에서 우리는 c-KIT 리간드 프로모터 내 SBE에 SMAD2의 TGF-β1 유도 된 결합과 TGF-β1 리간드 유전자 내에서 STAT3의 인식 서열에 TGF-β1에 의해 유도 된 결합을 입증했다. 우리는 염색질 면역 침전을 사용하여 두 전사 인자 모두의 사이토 카인 유도 결합을 증명한다.

크로마토 그래피 면역 침전은 DNA에 대한 관심있는 단백질의 직접 결합을 입증하고, DNA에 대한 단백질 결합을 유도하는 자극을 특성화하고, 단백질이 결합하는 DNA 서열을 특성화하는 강력한 도구입니다. 후자의 정보는 관심있는 특정 단백질에 의해 조절되는 유전자의 확인에 도움이 될 수 있으며 ChIP-on-chip, ChIP-seq 또는 복제 전략 7 , 8 , 9 의 사용에 의해 달성된다. ChIP의 주요 장점과 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

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이 연구는 TX 텍사스 주 MD 앤더슨 암 센터 (Houston, TX) (시작 자금, BB)의 지원을 받았다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HepG2 세포ATCCHB-8065
Hep3B 세포ATCCHB-8064
TGF-β 1R& D Systems101-B110ng/mL 농도에서 사용
Anti-SMAD2 항체세포 신호 전달 기술5339사용량/IP: 3 &마이크로; g
Anti-STAT3 항체세포 신호 전달 기술4904사용량/IP: 3 &마이크로; g
ChIP-IT Protein G Magnetic BeadsActive Motif53033
프로테아제 억제제 칵테일Active Motif37490
Micrococcal NucleaseCell Signalling Technology10011
PCR 전방 프라이머: PAI-1서열: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'
PCR 리버스 프라이머: PAI-1서열: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
PCR 순방향 프라이머: SCF서열: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'  
PCR 리버스 프라이머: SCF서열: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
PCR 앞으로 뇌관: TGF-beta; 1 (STB-1)서열: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'  
PCR 리버스 프라이머: TGF-&베타; 1 (STB-1)순서 : 5 '-TAGCTTTCTCTGCCTTGCTCCCC-3 '  
PCR 앞으로 뇌관: TGF-beta; 1 (STB-2)순서: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'        
PCR 리버스 프라이머: TGF-&베타; 1 (STB-2)서열 : 5 '-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTC-3 '    

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the bi....

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Chromatin Immunoprecipitationc KIT PromoterDNA Protein InteractionSMAD2 BindingTGF Beta SignalingStem Cell FactorTranscription Factor BindingPromoter AssaySTAT3 BindingCell Differentiation

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