여기서 우리는 Golgi-Cox 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 신뢰할 수있는 조직 얼룩 방법은 최소한의 문제 해결과 함께 해마 및 전체 뇌에 걸쳐 cytoarchitecture의 높은 품질 평가를 허용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
수상 돌기는 흥분성 시냅스를 포함하는 신경 돌기 샤프트의 돌기입니다. 해마 내의 신경성 수상 돌기의 형태 및 분지 변이는인지 및 기억 형성에 관여한다. Golgi 염색에 대한 몇 가지 접근법이 있으며, 모두 수지상 세포의 형태 학적 특성을 결정하고 명확한 배경을 생성하는데 유용합니다. 현재 Golgi-Cox 방법 (상업적 골지 염색 키트와 함께 제공되는 프로토콜의 약간의 변형)은 비교적 낮은 용량의 화학 요법 약물 인 5- 플루오로 우라실 (5-Fu)이 수지상 형태에 어떻게 영향을 미치는지 평가하기 위해 고안되었다 , 척추의 수 및 해마 안의 정강이 형성의 복잡성과 관련이 있습니다. 5-Fu는 수지상 복합체를 상당히 변조 시켰고, 해마 전역에서 척추 밀도를 영역 특이 적 방식으로 감소시켰다. 제시된 데이터는 Golgi 염색 방법이CA1, CA3 및 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 성숙한 뉴런을 fectively 염색했다. 이 프로토콜은 각 단계의 세부 사항을보고하여 다른 연구자가 뇌 전체에 걸쳐 조직을 안정적으로 얼룩지게하고 고품질의 결과와 최소한의 문제 해결을 가능하게합니다.
서론
Dendrites는 presynaptic 입력을 받아 처리하는 뉴런의 가장 큰 부분입니다 1 . 그들의 수지상 프로세스는 복잡한 기하학을 가지고 있는데, 근위부 가지가 원위부 가지보다 더 큰 직경을 가지고 있습니다. 수상 돌기가 발달함에 따라 돌기 arborization이라고하는 과정에서 다른 뉴런과 여러 연결을 형성합니다. 이 분기의 범위와 패턴은 수상 돌기가 적절하게 처리 할 수있는 시냅스 입력의 양을 결정합니다 2 .
수상 돌기 arborization은 활동 의존성 소성과 연결 회로의 적절한 개발을 위해 필요한 과정입니다. 확장, 후퇴, 분지 및 시냅스 생성은 내인성 유전 프로그램 및 외인성 요인으로부터의 영향을 포함하는 복잡한 과정이다. 해마 내의 신경성 수상 돌기의 형태 및 분지 변화는인지 및 기억 형성에 관련되어있다돌기 복잡성의 변화는 병리 생리학 및 행동 변화와 관련이있다 5. 이상은 X- 증후군 및 다운 증후군을 포함한 여러 질병 상태와 관련이있다.
수상 돌기 (dendritic spines)는 중추 신경계 내에서 흥분성 입력을받는 돌기....
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프로토콜
실험은 UAMS 기관 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)가 승인 한 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다.
1. 동물과 5-Fu 주사 패러다임
- 6 개월 된 수컷 C57Bl6 / J 야생형 마우스를 구입하여 1 살이 될 때까지 일정한 12 시간의 명암주기하에 보관하십시오.
- 0.9 % 살균 식염수로 5 푸를 희석하십시오. 마우스 당 필요한 용량으로 60 mg / kg을 사용하십시오.
- 5-Fu의 복강 내 주사를 주십시오 (3 주 동안 1 주일에 한 번).
- 매일 같은 시간에 복강 내 주사를합니다. 예를 들어, 0900-1200 시간.
- 동물을 안락사시키고 마지막 주입 후 30 일 동안 두뇌를 추출하십시오.
2. 안락사 절차 및 뇌 추출
- 설치류를 억제하고 꼬리의 바닥을 잡아. 다른 한편으로, 엄지 또는 첫 번째 손가락을 th설치류 목의 바닥. 설치류의 목에 신속하게 압력을 가하고 꼬리를 잡고있는 다른 손이 뒤로 당기는 동안 앞으로 밉니다.
- 한 손으로....
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결과
수상 돌기 arborization에 5 -Fu 처리의 효력 및 Golgi 얼룩 두뇌 단면의 해마에있는 복합성은 상업적으로 이용 가능한 화상 진찰 소프트웨어를 사용하여 정량되고 추적되었다. 추적 후, 돌기 arborization, 척추 밀도 및 척추 형태학은 Sholl 분석 및 수지상 복합 지수 (DCI)를 사용하여 분석되었습니다. Sholl 분석은 수지상 세포 형태를 결정하는 데 사용할 수있는 정량 분석 방법입니다 25 . 소마 (soma)부터 시작해서, 서로 10μm 떨어져있는 원들은 돌기 추적을 오버레이합니다. 수상 돌기의 길이는 돌기가 교차하는 원의 수에 의해 결정됩니다. 돌기 아버의 복잡성을 확인하는 방법 인 분기점 분석은 분기점의 총 수와 순서를 기반으로합니다.
분기점은 다음과 같이 정의됩니다.브랜치는 두.......
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토론
보다 현대적인 기술에 비해 Golgi-Cox 방법은 척추 형태를 검사하는 데 선호되는 몇 가지 장점이 있습니다. 1) 염색은 본질적으로 모든 조직에 사용할 수 있습니다. 2) 기본적인 광학 현미경 설정만으로 모든 것이 가능합니다. 3) Golgi-Cox 이미징은 공 촛점 영상보다 빠르다. 4) Golgi 염색 된 절편은 형광 라벨이 부착 된 샘플보다 몇 개월에서 몇 년 더 오래 실행 가능하다. 이러한 장점을 가지고 있어도 Golgi-Cox 방법에는 여전히 한계가 있습니다. 첫째, 전체 프로세스가 매우 시간 소모적이어서 몇 주간의 얼룩이 필요하고 이미지를 분석해야합니다. 이 프로토콜에서 볼 수 있듯이, A 절에서 14 일, B 절에서 1 일이 소요되기 전에 절편을 시작할 수 있습니다. 또한 절단, 포스트 염색 및 마운팅 작업은 두뇌 당 2-3 시간이 소요됩니다. 각 슬라이드는 청소 및 덮기 전에 1 일 동안 건조해야합니다. 그 후 시간의 양그것이 섹션에 개인에 따라 달라집니다 이미지 및 분석 소요됩니다. 둘째, 척추 분류의 차이.......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 NIH P20 GM109005 (ARA) 및 Translational Neuroscience IDeA 프로그램 상 P30 GM110702 센터의 파일럿 보조금에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 슈퍼골지 키트 | 바이오엔노 라이프사이언스 | 30100 | 유해 물질이 포함되어 있습니다. |
| PBS 10x 분말 농축 | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | 어부 | SP 15-100 | |
| 슬라이드 커버 | 어부 | 12-546-14 | |
| 7 mL 이송 피펫 | 글로브 사이언티픽 | 135030 | |
| 10 mL 팔콘 튜브 | BD 바이오사이언스 | ||
| 호일 | 어부 | 01-213-105 | |
| 12웰 플레이트 | BD 바이오사이언스 | ||
| 353043 200 proof 에탄올 | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| 자일렌 | 아크로스 오가닉스 | 1330-20-7 | 위험. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL 혈청학 피펫 | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| 비브라톰 | 세계 정밀 기기 | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 남성 마우스 | 잭슨 연구소 | ||
| Axio Imager 2 | ZEISS | 다중 구성 요소, 자세한 내용은 웹 사이트를 참조하십시오. | |
| AxioCam MRc 카메라 | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| 염색 접시, 그린 | 티슈-텍 | 62541-12 | |
| 염색 접시 세트 | 전자 현미경 과학 | 70312-20 | |
| 모터화된 피펫 필러 | 어부 | 03-692-168 | |
| 뉴로루시다 | mbf 생명과학 | ||
| 뉴로루시다 익스플로러 | mbf 생명과학 | ||
| 프리즘 | 그래프패드 |
참고문헌
- Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Kulkarni, V. A., Firestein, B. L.
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재인쇄 및 허가
