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방법 논문

마우스 배아 신장의 해부 및 배양

11.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55715

⸱

2017년 5월 17일

 , 
1Department of Neuroscience, Uppsala University, 2Department of Organismal Biology, Evolutionary Biology Center, Uppsala University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 마우스 배아에서 metanephric의 기초를 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다.

초록

이 프로토콜의 목표는 마우스 metanephric 기초의 해부, 격리 및 문화에 대한 방법을 설명하는 것입니다.

포유류 신장이 발달하는 동안 두 개의 전구 세포 조직, 즉 ureteric bud와 metanephric mesenchyme은 세포 기작을 전달하고 상호 작용하여 결국 포집 시스템과 신장의 네프론을 형성합니다. 포유류 배아가 자궁 내에서 자라며 관찰자가 접근하기 어렵 기 때문에 장기 배양이 개발되었습니다. 이 방법을 사용하면 신장 조직 형성 과정에서 상피 간엽 상호 작용과 세포 행동을 연구 할 수 있습니다. 또한 선천성 신장 및 비뇨 생식기 기형의 기원을 조사 할 수 있습니다. 조심스럽게 해부 된 후, metanephric 기초 물질은 배양 배지에 떠있는 필터로 옮겨져 며칠 동안 세포 배양기에 보관 될 수 있습니다. 그러나 조건은 다음과 같습니다.인공이며 조직의 신진 대사에 영향을 줄 수 있습니다. 또한, 시험 물질의 침투는 체외 이식편에 존재하는 세포 외 기질 및 기저막으로 인해 제한 될 수있다.

기관 문화의 한 주요 이점은 실험자가 기관에 직접 접근 할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 저렴하고 간단하며 생물학적 활성 물질의 첨가, 유전 변이의 연구, 진보 된 영상 기술의 적용과 같은 많은 수정을 가능하게합니다.

서론

포유류 신장은 중배엽 기원을 가진 두 가지 원시 구조, 즉 관상 상피 요관 새싹과 중신성 중간엽에서 파생됩니다. 신형성(nephrogenesis) 동안, 요관 새싹은 메타네프릭 중간엽(metanephric mesenchyme)과 가지(branchesenchyme)에 침입하여 수집 시스템을 형성합니다. metanephric mesenchyme은 네프론의 상피 요소를 발생시킵니다. 이러한 과정은 정확한 시간과 공간적으로 조정된 방식으로 발생하며 상호 귀납 메커니즘에 의해 시작됩니다. 두 조직 구성 요소는 서로 소통하고 다른 조직의 형태 형성에 영향을 미칩니다.

1920년대에 닭에서 중신관의 생체 내 폐쇄를 수행한 사람은 Boyden이었고, 분리된 신모세포가 구별되지 않음에 따라 유도 상호 작용의 첫 번째 징후를 제공했습니다1. 거의 동시에, 매달린 방울에서 닭 네프 기초를 배양하려는 최초의 성공적인 시도가 발표되었습니다. 그 후, 장기 배양은 포유류의 장기 형성에서 조직 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었습니다. 1950년대에 Grobstein은 필터에서 metanephric 기초를 배양할 수 있는 기술을 개발했습니다. 이 기술은 Saxén에 의해 수정되었으며, Saxén은 배양 접시1의 Trowell 유형 화면에 필터를 배치했습니다. 수년에 걸쳐 장기 배양에 대한 많은 수정과 응용이 등장했습니다. 여기에 설명된 방법은 Saxén의 기술을 기반으로 하지만 필터가 매체에서 자유롭게 떠다니고 배양물의 직경이 필터의 직경을 약간 초과하여 필터의 원치 않는 움직임을 제한하기 때문에 단순화되었습니다.

전체 장기 배양은 기관 생성 중 세포 과정과 세포 간 통신을 조사하기 위한 고전적이고 저렴하며 간단하지만 강력한 도구입니다. 장기 배양은 성장 인자, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 바이러스 및 펩타이드와 같은 생물학적 제제뿐만 아니라 제약 화합물 및 기타 화학 물질로 치료할 수 있습니다. 또한 유전자 변형 마우스에서 유래한 외식(explant)을 사용하거나 Cre-loxP 시스템과 같은 유도성 유전자 불활성화 기술을 사용하여 유전자 기능을 연구할 수 있습니다. 이를 통해 신장이 발달하기 전에 배아의 치사율을 유발하는 유전적 돌연변이를 연구할 수 있습니다. 장기 배양은 또한 유전자 기능 또는 계통 추적을 위한 형광 태깅 및 세포 행동의 실시간 모니터링을 가능하게 하는 최신 이미징 기술과 결합할 수 있습니다2.

여기에 제공된 특정 예에서, 요관 싹의 분기 형태에 대한 EphrinB2 활성화 Eph-수용체 신호전달의 효과를 조사했습니다. EphA4/EphB2 이중 녹아웃 마우스의 형태는 신장 발달에 몇 가지 심각한 결함을 시사했으며, 이는 배아 11일째(E11)부터 감지할 수 있었고 요관 싹, 요관 및 총신관3과 관련이 있습니다. Eph 수용체를 통한 신호전달은 리간드-수용체 dimer4의 클러스터링을 필요로 합니다. Eph 신호전달을 과도하게 활성화하기 위해 E11.5 마우스 배아의 신장 기초를 군집된 재조합 EphrinB2-Fc의 존재 하에서 배양했습니다. EphrinB2는 EphA4 수용체에 대한 알려진 리간드이며, 이는 요관 새싹 tips3에서 발현됩니다.

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프로토콜

마우스는 스웨덴의 규정 및 EU 법령 (2010 / 63 / EU)에 따라 유지 관리되었습니다. 모든 절차는 스웨덴 윤리위원회 (C79 / 9, C248 / 11 및 C135 / 14 허가)의 지침에 따라 수행되었습니다. 동물과 관련된 하이델베르그 대학의 절차는 하이델베르그 대학의 Regierungspräsidium Karlsruhe와 Animal Welfare Officers에 의해 승인되었습니다.

1. 시약 및 시약의 준비

참고 : 오염을 최소화하려면 층류 후드를 사용하십시오.

  1. 해부 당일에, 무균 인산 완충 식염수 (PBS) 중의 1 : 5의 몰비로 항 - 인간 Fc 염소 항체와 혼합함으로써 인간 Fc 단독 또는 인간 Fc에 융합 된 재조합 키메라 에프 린 단백질을 사전 - 클러스터링한다. 37 ° C에서 1 시간 동안 품어 둡니다. 5 .
  2. Dulbecco 's Modified Eagle Medium : Nutrient를 보충하여 배양 배지를 준비하십시오.1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (v / v), 1 % 글루타민 (v / v), 1 % 인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 (v / v), 50 μg / ml 인간 홀로 코 - 트랜스페린 및 1.5㎍ / mL 암포 테리 신이 포함된다.
    참고 : 16 ML 배아의 10 ML 충분합니다.
  3. 배양액에 최종 농도 20 μg / mL의 클러스터 된 재조합 에프린 용액을 첨가합니다. 클러스터 된 인간 Fc를 대조군으로 사용하십시오.
  4. 무균, 코팅되지 않은 평평한 바닥 폴리스티렌 4 잘 접시의 각 우물에 문화 매체 500 μL를 추가하여 문화 플레이트를 준비합니다.
  5. 무균 포셉을 사용하여 신중하게 매체 상단에 구멍 당 5 μm의 기공 크기와 하나의 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터를 놓으십시오. 인큐베이터 (37 ° C / 5 % CO 2 )에 준비 접시를 전송하십시오. 필터가 윗면이 마를 때까지 뜨고 플로트가 발생하는지 확인하십시오.
    참고 : 두 개의 신장 혈관에 대해 하나의 필터로 충분합니다.
  6. 면도날을 사용하여 대략 30 피펫 팁 (볼륨 : 100 μL) approximately 끝에서 1mm가 더 넓게 열립니다. 팁을 다시 피펫 - 팁 랙에 넣으십시오.

2. E11.5에서 Metanephric Rudiments의 해부

  1. 자궁 경부 탈구 (또는 지역 윤리위원회의 승인을받은 방법을 사용)하여 E11.5에서 임신 임신 한 마우스를 희생합니다.
  2. Brown 외 6 에 설명 된대로 자궁과 배아를 제거합니다. 이 시점에서 해부 현미경으로 작업하십시오.
  3. 5 번 시계 제조기 겸자를 사용하여 앞다리 바로 아래에서 배아를 잘라냅니다. 각 배아에 신선한 페트리 접시를 사용하십시오. 배아의 꼬리와 다리를 제거하십시오. 이렇게하려면 5 번 시계 제조기 집게 한 쌍으로 제거 할 조직을 잡고 두 번째 쌍의 끝을 사용하여 자릅니다.
  4. 복부 기관의 질량을 제거하려면, 꼬리의 주둥이 방향으로 배아의 몸 벽을 옆으로 열려면 한 쌍의 포셉의 팁을 사용하십시오.
    1. 외형 적으로 절단, t와 평행하게그는 지느러미 대동맥. 오리 엔테이션을 위해 혈액으로 채워지기 때문에 눈에 보이는 대동맥을 사용하십시오. 조심스럽게 폐쇄 포셉의 팁을 사용하여 등쪽 부분에서 신체 벽의 복부 부분을 분리하고 배아를 뒤집습니다. 앞면과 마찬가지로 몸통 벽을 옆으로 대동맥 - 꼬리 방향으로 절단하고 배부 대동맥을 사용하여 방향을 잡습니다.
  5. 복부 몸의 벽이 지느러미 몸체에서 분리되면, 한 쌍의 포셉으로 잡아서 신중하게 잡아 당겨 기관 덩어리와 함께 제거하십시오.
    참고 : metanephric anlagen은 일반적으로 등쪽 몸 벽에 붙어있어. 그들은 타원형이며, 뒷다리 수준에 위치한 ~ 200 μm 길이의 구조물입니다.
  6. 복부 쪽이 위로 향하게 한 쌍의 포 셉를 사용하여 등쪽 몸통 벽을 지킨다. 포셉의 다른 한 켤레를 사용하여, 그것의 주둥이 끝에서 등쪽 대동맥을 잡고 조심스럽게 몸의 벽에서 등 대동맥을 껍질.
    참고 : 두 metanephric 신장은 일반적으로 붙어있어등 대동맥에 붙어있다.
  7. 한 쌍의 포셉을 사용하여 신장 anlagen에 rostrally 잘라 대동맥을 제거하십시오. 그런 다음 신중하게 포 셉의 팁을 사용하여 두 신장 anlagen 분리하십시오.
  8. 조심스럽게 포셉의 팁을 사용하여 신장 anlagen에서 원치 않는 조직을 껍질. mesenchyme을 손상시키지 않도록주의하십시오. 손상은 추가 분석에서 explant의 성장 및 배제를 초래할 수 있습니다.
  9. 4 잘 접시에 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터에 PBS 10 μL에 microliter 피펫과 와이드 오픈 피펫 팁을 사용하여 신장 anlagen을 별도로 전송합니다.
    참고 : 표면 장력으로 인해 체외 이식편은 얇은 매질로 덮여 있습니다. 하나의 필터로 두 개의 신장 혈관이 충분합니다.
    1. 두 개의 신장 anlagen 각 필터의 ​​각 절반의 중심에 놓습니다. 37 ° C / 5 % CO 2 에서 배양기로 플레이트를 다시 옮긴다. metanephric rud 때까지 인큐베이터에 접시를 남겨주세요다음 배아에서 iments은 필터에 배치 할 준비가되었습니다.
  10. 각 배아에 대해 2.3-2.9.1 단계를 반복합니다.
    참고 : 일부 연습으로 해부 절차는 배아당 약 5 분 걸립니다.
  11. 37 ° C / 5 % CO 2 에서 3 일 동안 신장 anlagen을 품어.

3. 고정 및 염색을위한 시약의 준비

  1. 칼슘과 마그네슘 (w / v)이없는 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비하려면 PFA를 60 ℃에서 PBS에 녹여서 지속적으로 저어줍니다. 실온으로 식힌 다음 페이퍼 필터를 사용하여 남아있는 입자를 제거합니다. 분주하고 4 ° C에서 보관하여 즉시 사용하거나 장기간 보관할 수 있습니다.
    주의 : PFA는 유독합니다. 지역 안전 표준에 명시된 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오. 시설 지침에 따라 지정된 폐기물 용기를 사용하여 폐기물을 버립니다.
  2. permeabilization solution을 준비하기 위해 희석 된 Triton X-1000.3 % (v / v)가되도록 칼슘과 마그네슘이없는 PBS에서 처리 하였다.
  3. 차단 용액을 준비하기 위해 5 % (v / v) 염소 혈청과 0.1 % Triton X-100을 칼슘과 마그네슘없이 PBS에 첨가한다. 나트륨 아자 이드를 0.02 % (w / v)의 최종 농도로 첨가한다. 4 ° C에서 보관하십시오.
    주의 : 나트륨 아자 이드는 독성이 있습니다. 지역 안전 및 환경 보호 규정에 따라 나트륨 아자 이드를 취급하십시오.
    참고 : 염색을 위해 항체를 사용하는 경우 2 차 항체가 유도 된 종에서 5 % 혈청을 사용하여 차단 용액을 만듭니다.
  4. biotinylated Dolichorus biflorus agglutinin을 1 : 200으로 블로킹 용액으로 희석한다. Alexa488 - conjugated streptavidin을 1 : 200으로 블로킹 용액으로 희석하십시오.
  5. 즉시 사용할 수있는 배지 (물질 표 참조)를 만들기 위해 0.1M Tris-HCl (pH 8.5)에 녹인 25 % (w / v) 글리세롤에 0.1g의 수용성 폴리 비닐 알코올 계 점착제 / mL를 넣는다. . 연속 교반하에 50 ° C로 1 시간 가열하고 식힌 다음 1을 사용하여 pH를 8.0-8.5로 조정한다.M NaOH. NaOH 농도를 높이 지 마십시오. 0.02 % (w / v)의 최종 농도로 100 μg / mL의 N- 프로필 게 네이트와 티 메로 살을 첨가한다. 실온에서 30 분 동안 교반한다.
    주의 : Thimerosal은 독성이 있습니다. 해당 지역의 안전 및 환경 보호 규정에 따라 취급하십시오.
    1. 50 ML 튜브에 삽입 매체를 채우고, 로터를 균형을, 그리고 3,200 XG 및 10 분 실온에서 원심 분리기. 15 mL 튜브에 투명한 용액을 따라 내고 펠렛을 버린다. 분주하고 -20 ℃에서 몇 주 동안 보관하십시오. 해동되면 용액을 4 ° C에 유지한다. 사용 직전 ~ 30 ° C로 예열하십시오.
  6. explants와 필터가 장착 될만큼 많은 유리 슬라이드를 준비합니다. 이를 위해 인스턴트 접착제를 사용하여 유리 슬라이드 양쪽에 18 x 18 mm 크기의 작은 커버 슬립 2 개를 붙이고 필터 사이에 15 mm의 공간을 남겨 둡니다.

4. 고정 및 염색

  1. 배양 기간 3배양기에서 플레이트를 제거하고 조심스럽게 micropipette를 사용하여 각 우물에서 문화 매체를 대기음. 필터를 만지지 말고 팁 입구를 우물 벽쪽으로 유지하십시오.
  2. 각 우물에 4 % PFA / PBS 500 μL를 추가합니다. 필터는 정착액 위에 뜨게됩니다. 마이크로 피펫을 사용하여 PFA 고정액을 조심스럽게 첨가하여 필터를 잠수시킵니다. 실온에서 30 분 동안 품어 낸다.
    참고 : 다음 단계를 수행 할 때 필터에서 외과 체를 씻어 내지 않도록주의해야합니다. 우물 벽을 향한 피펫 팁의 개방을 유지하십시오.
  3. PFA를 제거하고 500 μL의 PBS로 두 번 헹구십시오. 각 우물에 permeabilization 솔루션 500 μL를 추가하고 1 시간 동안 실온에서 품어.
  4. PBS 500 μL로 두 번 씻어서 각 잘 차단 솔루션의 500 μL를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한다.
  5. 차단 용액을250 μL의 biotinylated Dolichorus biflorus agglutinin은 1 : 200으로 블로킹 용액으로 희석하고 4 ° C에서 24 시간 동안 배양한다.
  6. Dolichorus biflorus agglutinin 솔루션을 제거하고 잘 PBS 당 500μL로 씻어.
  7. Alexa488 - conjugated streptavidin 250 μL를 1 : 200 희석 용액에 첨가하고 4 ° C에서 24 시간 동안 배양하십시오. 또는 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
    참고 : 4 ° C에서 배양하면 더 나은 신호 대 잡음비가 달성됩니다.
  8. 1 웰당 PBS 500 μL로 두 번 씻어. 집게를 사용하여 explants이 위로 향하게 준비 슬라이드에 필터를 전송합니다. 임베딩 매체 ~ 50-100 μL로 탑재하십시오. 60mm 길이의 1.5 번 커버 슬립으로 덮으십시오. 매질 용액을 실온에서 2 시간 동안 응고시킨다. 이미지 준비가 끝날 때까지 4 ° C에서 포일로 싸인 슬라이드를 이미지화하거나 보관하십시오.
  9. 와이드 필드 epifluorescence 현미경 7 </ sup>를 Hg- 램프에 연결하고 청색 여기 (여기 대역 통과, 460 - 495 nm, 이색 거울, 505 nm, 방출 대역, 510 - 550 nm) 및 20X Plan-Apochromat 렌즈 용 거울 장치를 사용하여 0.75 구멍.

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결과

Metanephric kidn anlagen은 E11.5에서 임신 한 Black-6 근친 교배 마우스에서 추출하여 배양 하였다. 3 일 후, ureteric bud는 5 번까지 분지되었고, 그 결과 초기 T 자 형태의 ureteric bud가 분출되었다. 각 체외 이식편을 촬영하고 분지 생성량을 결정하고 분지 당 종말점 수를 계산하기 위해 분절 수와 종점을 정량화했습니다 ( 그림 1 ). ImageJ ( 제 4 세대), 제 4 세대는 처리 된 체외 이식편의 단 8 %에서만 달성되었으며, 대조 체외 이식편의 35 %와 비교하여 ( 그림 1b ), 따라서 분기 당 종점 및 ㎟ 당 종점은 또한 EphrinB2가 제한된 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다 ( 그림 1 ).ureteric bud branching 과정에서 EphA4와 EphB2의 순방향 신호 전달을 활성...

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토론

이 원고는 마우스 배아에서 발생하는 metanephric anlagen을 분리하고 장기 기초를 배양하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 Grobstein 8 과 Saxén 9 , 10 에 의해 개발 된 표준 기법이며 많은 다른 사람들에 의해 수정되고 수정되었습니다 11 , 12 . 이 방법의 성공은 주로 절개의 지속 기간과 장기간의 절개 시간에 따른 생식 외 생존 및 유도 잠재력 감소에 달려 있습니다. 주변 조직으로부터 신장 조직을 제거 할 때 간 조직을 손상시키지 않도록주의해야합니다. metanephric mesenchyme의 손상은 종종 explants의 가난한 성장을위한 이유입니다. 그러나 절개 속도와 미세 운동 능력은 연습으로 크게 향상됩니다.

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

저자는 Leif Oxburgh와 Derek Adams에게 도움을 주신 Leif Oxburgh와 Stefan Wölfl 및 Ulrike Müller와 Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer 및 Viola Mayer에게 도움을 주신 데 대해 감사드립니다. 랩. 이 작품은 개발, 생물 학자의 회사 (CP) 에 의해 지원되었다 .

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific21331020
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140148
GlutaMAX 보충제Thermo Fisher Scientific35050061
DPBS, 칼슘, 마그네슘Thermo Fisher Scientific14040117해부에 사용
시그마-알드리치T0665
인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS -G) (100x)Thermo Fisher Scientific41400045
파라포름알데히드시그마-알드리치158127
암포테리신 B 용액시그마-알드리치A2942
트리톤 X-100시그마-알드리치X100
아지드나트륨시그마-알드리치S8032
티메로살시그마-알드리치T5125
프로필 갈레이트시그마-알드리치2370
모위올 4-88시그마-알드리치81381
글리세롤시그마-알드리치G5516
비오틴화 돌리코루스 비플로루스 아글루티닌벡터 연구소B-1035
Alexa488 접합 스트렙타비딘잭슨 면역 연구016-540-084
재조합 마우스 에프린-B2 Fc 키메라 단백질, CFR& D 시스템496-EB
재조합 인간 IgG1 Fc, CFR& D Systems110-HG-100
염소 항인간 IgG Fc 항체R& D SystemsG-102-C
인산염 완충 식염수 정제Sigma-AldrichP4417고정 및 면역 염색에 사용
Dumont #5, biologie
팁, INOX, 11cm		agnthos.se0208-5-PS집게 2쌍 필요
아이리스 가위, 스트레이트, 12cmagnthos.se03-320-120
드레싱 집게,
스트레이트, 섬세함, 13cm		agnthos.se08-032-130
페트리 접시 Nunclo Delta 처리Thermo Fisher Scientific150679
TMTP01300 Isopore Membrane Filter, 폴리카보네이트, 친수성, 5.0 µ m, 13mm, 흰색, 일반MerckMilliporeTMTP01300
Nunclon Multidishes
4 wells, 평평한 바닥		Sigma-AldrichD6789-1CS
현미경 커버 유리 24 x 50mm 두께. No.1.5H 0.17+/-0.005mmnordicbiolabs107222
커버 안경No.1.5, 18mm x 18mmnordicbiolabs102032
슬라이드 ~76 x 26 x 1, 1/2-w. 지상 일반nordicbiolabs1030418
VWR 면도날VWR55411-055
50 mL 원심분리기 튜브Sigma-AldrichCLS430828
15 mL 원심분리기 튜브Sigma-AldrichCLS430055
Whatman 사전 주름 품질 여과지, 등급 113V, 크레이프Sigma-AldrichWHA1213125
고정 무대 연구 mircoscopeOlympusBX61WI
Black 6 근친 마우스, 수컷, C57BL/6NTacTaconicB6-M
Black 6 근친 마우스, 암컷, C57BL/6NTacTaconicB6-F
Greenough 스테레오 현미경LeicaLeica S6 E
홀로-트랜스페린 인간

참고문헌

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  2. Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
  3. Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
  4. Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
  5. Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
  6. Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555(2011).
  7. Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
  8. Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
  9. Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
  10. Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
  11. Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
  12. Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
  13. Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
  14. Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
  15. Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550(2010).
  16. Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
  17. Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
  18. Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
  19. Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
  20. Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
  21. Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).

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