이 프로토콜은 마우스 배아에서 metanephric의 기초를 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜의 목표는 마우스 metanephric 기초의 해부, 격리 및 문화에 대한 방법을 설명하는 것입니다.
포유류 신장이 발달하는 동안 두 개의 전구 세포 조직, 즉 ureteric bud와 metanephric mesenchyme은 세포 기작을 전달하고 상호 작용하여 결국 포집 시스템과 신장의 네프론을 형성합니다. 포유류 배아가 자궁 내에서 자라며 관찰자가 접근하기 어렵 기 때문에 장기 배양이 개발되었습니다. 이 방법을 사용하면 신장 조직 형성 과정에서 상피 간엽 상호 작용과 세포 행동을 연구 할 수 있습니다. 또한 선천성 신장 및 비뇨 생식기 기형의 기원을 조사 할 수 있습니다. 조심스럽게 해부 된 후, metanephric 기초 물질은 배양 배지에 떠있는 필터로 옮겨져 며칠 동안 세포 배양기에 보관 될 수 있습니다. 그러나 조건은 다음과 같습니다.인공이며 조직의 신진 대사에 영향을 줄 수 있습니다. 또한, 시험 물질의 침투는 체외 이식편에 존재하는 세포 외 기질 및 기저막으로 인해 제한 될 수있다.
기관 문화의 한 주요 이점은 실험자가 기관에 직접 접근 할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 저렴하고 간단하며 생물학적 활성 물질의 첨가, 유전 변이의 연구, 진보 된 영상 기술의 적용과 같은 많은 수정을 가능하게합니다.
서론
포유류 신장은 중배엽 기원을 가진 두 가지 원시 구조, 즉 관상 상피 요관 새싹과 중신성 중간엽에서 파생됩니다. 신형성(nephrogenesis) 동안, 요관 새싹은 메타네프릭 중간엽(metanephric mesenchyme)과 가지(branchesenchyme)에 침입하여 수집 시스템을 형성합니다. metanephric mesenchyme은 네프론의 상피 요소를 발생시킵니다. 이러한 과정은 정확한 시간과 공간적으로 조정된 방식으로 발생하며 상호 귀납 메커니즘에 의해 시작됩니다. 두 조직 구성 요소는 서로 소통하고 다른 조직의 형태 형성에 영향을 미칩니다.
1920년대에 닭에서 중신관의 생체 내 폐쇄를 수행한 사람은 Boyden이었고, 분리된 신모세포가 구별되지 않음에 따라 유도 상호 작용의 첫 번째 징후를 제공했습니다1. 거의 동시에, 매달린 방울에서 닭 네프 기초를 배양하려는 최초의 성공적인 시도가 발표되었습니다. 그 후, 장기 배양은 포유류의 장기 형성에서 조직 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었습니다. 1950년대에 Grobstein은 필터에서 metanephric 기초를 배양할 수 있는 기술을 개발했습니다. 이 기술은 Saxén에 의해 수정되었으며, Saxén은 배양 접시<....
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프로토콜
마우스는 스웨덴의 규정 및 EU 법령 (2010 / 63 / EU)에 따라 유지 관리되었습니다. 모든 절차는 스웨덴 윤리위원회 (C79 / 9, C248 / 11 및 C135 / 14 허가)의 지침에 따라 수행되었습니다. 동물과 관련된 하이델베르그 대학의 절차는 하이델베르그 대학의 Regierungspräsidium Karlsruhe와 Animal Welfare Officers에 의해 승인되었습니다.
1. 시약 및 시약의 준비
참고 : 오염을 최소화하려면 층류 후드를 사용하십시오.
- 해부 당일에, 무균 인산 완충 식염수 (PBS) 중의 1 : 5의 몰비로 항 - 인간 Fc 염소 항체와 혼합함으로써 인간 Fc 단독 또는 인간 Fc에 융합 된 재조합 키메라 에프 린 단백질을 사전 - 클러스터링한다. 37 ° C에서 1 시간 동안 품어 둡니다. 5 .
- Dulbecco 's Modified Eagle Medium : Nutrient를 보충하여 배양 배지를 준비하십시오.1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (v / v), 1 % 글루타민 (v / v), 1 % 인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 (v / v), 50 ....
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결과
Metanephric kidn anlagen은 E11.5에서 임신 한 Black-6 근친 교배 마우스에서 추출하여 배양 하였다. 3 일 후, ureteric bud는 5 번까지 분지되었고, 그 결과 초기 T 자 형태의 ureteric bud가 분출되었다. 각 체외 이식편을 촬영하고 분지 생성량을 결정하고 분지 당 종말점 수를 계산하기 위해 분절 수와 종점을 정량화했습니다 ( 그림 1 ). ImageJ ( 제 4 세대), 제 4 세대는 처리 된 체외 이식편의 단 8 %에서만 달성되었으며, 대조 체외 이식편의 35 %와 비교하여 ( 그림 1b ), 따라서 분기 당 종점 및 ㎟ 당 종점은 또한 EphrinB2가 제한된 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다 ( 그림 1 ).ureteric bud branching 과정에서 EphA4와 EphB2의 순방향 신호 전달을 활성.......
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토론
이 원고는 마우스 배아에서 발생하는 metanephric anlagen을 분리하고 장기 기초를 배양하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 Grobstein 8 과 Saxén 9 , 10 에 의해 개발 된 표준 기법이며 많은 다른 사람들에 의해 수정되고 수정되었습니다 11 , 12 . 이 방법의 성공은 주로 절개의 지속 기간과 장기간의 절개 시간에 따른 생식 외 생존 및 유도 잠재력 감소에 달려 있습니다. 주변 조직으로부터 신장 조직을 제거 할 때 간 조직을 손상시키지 않도록주의해야합니다. metanephric mesenchyme의 손상은 종종 explants의 가난한 성장을위한 이유입니다. 그러나 절개 속도와 미세 운동 능력은 연습으로 크게 향상됩니다.
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 Leif Oxburgh와 Derek Adams에게 도움을 주신 Leif Oxburgh와 Stefan Wölfl 및 Ulrike Müller와 Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer 및 Viola Mayer에게 도움을 주신 데 대해 감사드립니다. 랩. 이 작품은 개발, 생물 학자의 회사 (CP) 에 의해 지원되었다 .
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| GlutaMAX 보충제 | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, 칼슘, 마그네슘 | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | 해부에 사용 |
| 시그마-알드리치 | T0665 | ||
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS -G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| 파라포름알데히드 | 시그마-알드리치 | 158127 | |
| 암포테리신 B 용액 | 시그마-알드리치 | A2942 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마-알드리치 | X100 | |
| 아지드나트륨 | 시그마-알드리치 | S8032 | |
| 티메로살 | 시그마-알드리치 | T5125 | |
| 프로필 갈레이트 | 시그마-알드리치 | 2370 | |
| 모위올 4-88 | 시그마-알드리치 | 81381 | |
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G5516 | |
| 비오틴화 돌리코루스 비플로루스 아글루티닌 | 벡터 연구소 | B-1035 | |
| Alexa488 접합 스트렙타비딘 | 잭슨 면역 연구 | 016-540-084 | |
| 재조합 마우스 에프린-B2 Fc 키메라 단백질, CF | R& D 시스템 | 496-EB | |
| 재조합 인간 IgG1 Fc, CF | R& D Systems | 110-HG-100 | |
| 염소 항인간 IgG Fc 항체 | R& D Systems | G-102-C | |
| 인산염 완충 식염수 정제 | Sigma-Aldrich | P4417 | 고정 및 면역 염색에 사용 |
| Dumont #5, biologie 팁, INOX, 11cm | agnthos.se | 0208-5-PS | 집게 2쌍 필요 |
| 아이리스 가위, 스트레이트, 12cm | agnthos.se | 03-320-120 | |
| 드레싱 집게, 스트레이트, 섬세함, 13cm | agnthos.se | 08-032-130 | |
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| TMTP01300 Isopore Membrane Filter, 폴리카보네이트, 친수성, 5.0 µ m, 13mm, 흰색, 일반 | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidishes 4 wells, 평평한 바닥 | Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| 현미경 커버 유리 24 x 50mm 두께. No.1.5H 0.17+/-0.005mm | nordicbiolabs | 107222 | |
| 커버 안경No.1.5, 18mm x 18mm | nordicbiolabs | 102032 | |
| 슬라이드 ~76 x 26 x 1, 1/2-w. 지상 일반 | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR 면도날 | VWR | 55411-055 | |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| 15 mL 원심분리기 튜브 | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman 사전 주름 품질 여과지, 등급 113V, 크레이프 | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| 고정 무대 연구 mircoscope | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 근친 마우스, 수컷, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 근친 마우스, 암컷, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Greenough 스테레오 현미경 | Leica | Leica S6 E |
참고문헌
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
- Peuckert, C., ....
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