말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

요약

우리는 배아 체 형성 (EB) 형성, 섬유 아세포 세포 확장 및 연골 형성 유도를 포함하는 통합없는 방법을 사용하여 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 인간 말초 혈액 (PB)으로부터 연골 세포 계통을 생성하는 프로토콜을 제시한다.

초록

이 연구에서, 우리는 말초 혈액 세포 (PBCs)를 통합 된 방법으로 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 연골 세포를 생산하는 종자 세포로 사용했다. 배아 체 형성 (EB) 형성 및 섬유 아세포 세포 확장 후, iPSCs는 무 혈청 및 이종없는 조건 하에서 21 일 동안 연골 분화 유도된다. 연골 세포 유도 후 형태 학적, 면역 조직 화학적 분석 및 생화학 적 분석뿐만 아니라 연골 분화 마커의 정량적 실시간 PCR 검사를 통해 세포의 표현형을 평가한다. 연골 형성 펠릿은 알 시스 파랑 및 톨루이딘 블루 염색 양성 반응을 보였다. 콜라겐 II와 X 염색의 면역 조직 화학도 양성이다. 황화 글리코 사 미노 글 라이칸 (sGAG) 함량과 연골 분화 마커 인 콜라겐 2 ( COL2 ), 콜라겐 10 ( COL10 ), SOX9 및 아그로 칸 (AGGRECAN)hiPSCs 및 섬유 아세포와 비교하여 rogenic pellets. 이러한 결과는 PBC가 연골 수복을위한 iPSC를 생성하기위한 종자 세포로 사용될 수 있음을 시사한다.

서론

연골 조직은자가 수복 및 재생 능력이 매우 낮습니다. 다양한 외과 적 중재 및 생물학적 치료법이 연골 및 관절 기능을 회복시키는 데 사용되고 있으며 만족스럽지 못한 결과가 있습니다. 최근 줄기 세포 기술의 발달로 전체 연골 치료 분야가 바뀔 수 있습니다 ¹ . 다양한 줄기 세포가 종자 세포로 연구되었지만 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 거부 반응을 일으키지 않으면 서 여러 유형의 환자 특정 세포를 제공 할 수 있기 때문에 가장 유망한 선택 인 것으로 보인다 ² . 또한, 그들은 성체 세포의 제한된 증식 성을 극복하고 자신의 재생 능력과 만능 능력을 유지할 수 있습니다. 또한, 유전자 표적화는 연골 세포의 특정 유형을 얻기 위해 유전자형을 변경하는 데 사용할 수 있습니다.

섬유 아세포는 재 프로그래밍 잠재력이 잘 연구 되었기 때문에 iPSC 생성에 널리 사용되었습니다.그러나 환자의 고통스런 생검 및 섬유 아세포의 시험 관내 팽창에 대한 필요성과 같이 유전자 돌연변이를 야기 할 수있는 몇 가지 한계가 아직 극복되어야합니다 ³ . 최근, PBC는 리 프로그래밍 ^4에 유리한 것으로 나타 났으며; 게다가, 그들은 일반적으로 활용되었고 풍부하게 저장되었다. 연구 초점을 피부에서 방향을 바꿀 수도 있습니다. 그러나 우리가 아는 바로는 PBC 재 프로그램과 연골 세포로의 분화에 관한보고는 거의 없습니다.

현재 연구에서 우리는 연골 세포 형성을 모방하기 위해 pellet 배양 시스템을 통해 iPSCs를 연골 세포 계통으로 분화시킨 다음 iPSCs로 분화시켜 PBCs를 대체 소스로 이용한다.

프로토콜

PBCs로부터 hiPSC를 생성하기위한 프로토콜은 이전의 연구 ⁵ 에서 찾을 수있다. 이 연구는 우리 기관의 기관 검토위원회 (Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다.

1. 배아 체 (EB) 형성

1. hiPSC 배지 50 ML : 15 % 녹아웃 혈청 대체 (KSR), 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 × 비 필수 아미노산, 55 μM 2- 메르 캅토 에탄올, 2 MM L을 보충 한 녹아웃 Dulbecco의 수정 이글 매체 (DMEM) - 글루타민 및 8 ng / mL 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF).
2. 50 ML의 EB 형성 매체 : 15 % KSR, 5 % FBS, 1x 비 필수 아미노산, 55 μM 2- 메르 캅토 에탄올 및 2 MM L - 글루타민으로 보충 DMEM을 확인하십시오.
3. 기본 배양 배지 50 ML : 20 % FBS, 1 × 비 필수 아미노산, 55 μm의 2 - mercaptopoethanol, 2 MM L - 글루타민으로 보충 DMEM을 확인하십시오.
4. 디스 패아 제 용액 10 mL를 녹아웃 DMEM에 1 mg / mL로 준비합니다.
5. 문화피더 세포 ( 즉, 조사 된 마우스 배아 섬유 아세포 세포의 단일 층)를 갖는 60-mm 조직 배양 접시에 hiPSCs를 재현한다. 세포가 80-90 % 합류되면 dispasis로 세포를 분리하고 4-5 일마다 hiPSCs 1 : 3을 통과시킵니다. 37 ° C와 5 % CO ₂ 배양기에 세포를 놓습니다.
6. iPSCs가 80-90 % 합류하는 경우, 불 - 그린 유리 바늘을 사용하여 미분 hiPSC 식민지를 작은 조각 (직경 약 50-100 μm)으로 해부합니다. 일반적으로, 100mm 페트리 접시에 EBs를 생성하는 60mm 요리에 hiPSC 식민지를 사용하십시오.
   1. 10 mm의 EB 형성 배지가 들어있는 100 mm 비 접착 성 배양 접시에서 100 개 미만의 작은 콜로니 조각을 배양합니다. 접시를 37 ° C 및 5 % CO ₂ 배양기에 넣으십시오.
7. 초기 배지의 약 25 %를 2 일마다 동일한 양의 배양 배지로 교체하십시오. EB를 고정 시키도록 접시를 기울이십시오. 조심스럽게 3 mL신선한 배지 4 mL를 넣는다. EB를 방해하지 마십시오.
   참고 : EBs는 현미경으로 부드러운 테두리와 둥근 모양을 취하는 식민지 조각에 의해 형태학 특징입니다.
8. 비 접착 성 배양 접시에서 10 일간 배양 한 후 사용하기 전에 37 ℃에서 30 분 동안 0.1 % 젤라틴 4 mL로 새로운 100 mm 조직 배양 접시를 코팅하십시오.
9. 매체 플러스 EB를 100mm, 비 접착 성 페트리 접시에서 15mL 원추형 튜브로 옮기십시오. EBs가 4-5 분 동안 침전되게하십시오. 조심스럽게 상청액을 흡인하고 중성 플러스 EB 0.5 mL 미만을 남겨 둡니다
10. 10 ㎖의 기본 배양 배지가있는 100 mm 젤라틴 코팅 조직 배양 접시에 100 EB 미만의 종자를 뿌립니다. 접시를 37 ° C 및 5 % CO ₂ 배양기에 넣으십시오.

2. 세포 펠렛 형성과 연골 세포의 분화

1. 0.25 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 10 mL를 만든다. bas의 80 ML을 확인하십시오α 배양 배지 : 20 % FBS, 1x 비 필수 아미노산, 55μM 2- 메르 캅토 에탄올 및 2mM L- 글루타민으로 보충 된 DMEM.
2. 10 % 인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 용액 (ITS), 0.1 μM dexamethasone, 1 mM ascorbic acid, 1 % sodium pyruvate 및 10 ng / mL transforming growth factor-로 보충 된 DMEM (고 포도당) 10 ml를 연골 분화 배지로 만든다. 베타 1 (TGF-β1).
3. 48 시간 후 기본 배지 10 ML로 매체를 새로 고침. 그 후, 기본 배지 10 mL로 3 일마다 배지를 새로 고친다.
   참고 : 배양 10 일 후, 섬유 아세포 세포의 성장은 EB에서 확장되어야합니다.
   1. 37 ° C에서 30 분 동안 0.1 % 젤라틴 4 mL로 100 mm 접시를 코팅하십시오. 세포 상등액을 버리고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS)로 한 번 씻으십시오.
   2. 37 ℃에서 0.25 % 트립신 / EDTA 3 mL로 세포를 소화시키고 5 분간 처리하고 4 mL의 기본 배지.
4. 5-10 배 위아래로 pipetting하고 70 μm의 나일론 메쉬를 통해 그들을 통과하여 단일 세포에 세포를 떼어. 5 분 200 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 세포를 새로운 100mm 젤라틴 코팅 조직 배양 접시에 다시 넣고 기본 배지 10 mL를 넣으십시오.
5. 48 시간 후 기본 배지 10 ML로 매체를 새로 고침. 그 후, 기본 배지 10 mL로 3 일마다 배지를 새로 고친다.
   참고 : 세포는 균일 한 섬유 모세포 유사 형태를 획득합니다.
6. ~ 90-100 % 합류 ( 즉, 약 5-7 일)에 도달하면, 세포를 37 ℃에서 0.25 % 트립신 / EDTA 3 mL로 5 분 동안 수확한다. 4 mL의 기본 배지로 중화시킨다. 5 회 위아래로 pipetting하여 단일 세포로 세포를 떼어. hemocytometer를 사용하여 세포 번호를 계산합니다.
   1. 15 mL 폴리 프로필렌 튜브에 3 x 10 ⁵ 세포를 놓습니다. 200 xg로 원심 분리기실온 (RT)에서 5 분간. chondrogenic 차별화 매체 1 ML의 세포를 다시 일시 중지합니다.
7. 3 분 동안 300 XG에서 세포를 재 원심 분리하고 작은 펠렛 형태로 세포를 유지하십시오. 21 일 동안 튜브를 37 ° C와 5 % CO ₂ 배양기에 넣으십시오. 뚜껑을 단단히 조이고 가스 교환을시키지 마십시오.
8. 신선한 chondrogenic 차별화 매체와 3 일마다 문화 매체 3/4을 교체하십시오.
   참고 : 배양 후 21 일이 지나면 hiPSC 연쇄 펠릿 (hiPSC-Chon)이 형성되었을 것입니다. 양성 대조군 인 인간 간엽 줄기 세포 (MSCs)도 수집하여 연골 분화 배지에서 21 일간 배양하여 연골 형성 펠렛 (hMSC-Chon)을 형성시킨다.

3. 연골 분화 분석

1. 10 % 중성 완충 포르말린 10 ML을 준비합니다.
2. 0.1 % 알 시안 블루 시약 50 mL와 1 % 톨루이딘 블루 시약 50 mL를 준비한다.
3. Pr콜라겐 II (1:50)에 대한 토끼 폴리 클론 항체 또는 콜라겐 X (1:50)에 대한 마우스 단일 클론 항체의 1 차 항체를 발현. 또한, 항 토끼 또는 마우스 보조 항체를 준비하십시오.
4. 파파인 솔루션 1 ML : 0.1 M 나트륨 아세테이트, 2.4 MM EDTA 및 5 MM L - 시스테인과 PBS에 10 U / ML하십시오.
5. 100 mL의 디메틸 메틸렌 블루 (DMMB) 염료 용액을 만든다. 16 mg / L 1,9- 디메틸 메틸렌 블루, 40 mM 글리신, 40 mM NaCl, 9.5 mM HCl 100 μL; pH 3.0.
6. 펠렛 섹션의 alcian blue 및 toluidine blue 얼룩에 의한 연골 분화를 평가하십시오.
   1. 24 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린 1 ML에 하나의 hiPSC - 롱 펠렛 또는 hMSC - 롱 펠렛을 수정.
   2. 펠렛을 H ₂ O 중 70 % 에탄올 1 mL에 옮긴다. 펠렛을 등급이 매겨진 에탄올 시리즈 ( 즉, 25, 50, 75, 90, 95, 100 및 100 %, 각 3 분) 1 mL로 탈수시킨다.
   3. 100 % 자일 렌 1 mL에 넣고 펠릿을 세 번 분쇄한다. 침입자65 ℃ 오븐에서 1 시간 동안 파라핀으로 펠렛을 만든다. 일상적인 조직학 절차 ⁶ 다음, 7 X 7 X 5 밀리미터 ³ 기본 금형과 파라핀 블록에 펠렛을 삽입.
   4. 약 4 μm 두께의 마이크로톰으로 인접한 섹션을 만듭니다 ⁷ . 유리 슬라이드 위에 섹션을 부착하십시오.
   5. 슬라이드를 60 ° C에서 2 시간 동안 오븐에서 건조시킵니다. 100 % 크실렌을 사용하여 3 사이클 (각 3 분)으로 섹션을 비 파라핀 화합니다.
   6. rehydration ( 즉, H ₂ O에서 100, 100, 95, 95, 70, 50 및 25 %, 각각 3 분)을 위해 감소하는 알코올 시리즈를 사용하고 5 분 동안 탈 이온수로 최종 헹굼을 수행하십시오.
   7. 0.1 % alcian blue 시약 또는 1 % toluidine blue 염색으로 4-5 시간 동안 염색 한 후 증류수로 헹구십시오.
   8. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈 ( 즉, 25, 50, 75, 90, 95, 100 및 100 %, 각각 3 분씩)로 3 번 연속해서 탈수하십시오eps of 100 % xylene. 슬라이드를 마운트하고 현미경으로 시각화하십시오.
7. 면역 조직 화학 검사를 수행하십시오.
   참고 : 추가 펠렛 섹션은 면역 조직 화학에 의해 추가로 평가됩니다.
   1. 탈 파라핀 및 rehydration 후, 1 밀리미터 EDTA, 산도 8.0 (오토 클레이브로 삶은 물에 방수)에서 종기에 슬라이드를 가져와. 그들이 끓는 온도에서 8 분 동안 앉아서 슬라이드를 RT에서 식히도록하십시오.
   2. 탈 이온수로 슬라이드를 3 회 헹굽니다. 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 차단하기 위해 15 분 동안 3 % H에 RT에서 메탄올 ₂ O ₂ 용액 섹션을 인큐베이션.
   3. 탈 이온수로 슬라이드를 헹구고 DPBS에 5 분 동안 담그십시오. 슬라이드의 섹션에 적절하게 희석 한 (1시 50 분) 기본 항체의 50-100 μL를 적용 후 RT에서 습기 챔버에서 1 시간 품어.
   4. DPBS로 슬라이드를 3 번 ​​(각각 5 분씩) 씻으십시오. sa를 품어 라.RT에서 15 분 동안 해당 이차 항체 ( 즉, 항 토끼 또는 마우스)와 mple.
   5. DPBS로 슬라이드를 3 번 ​​(각각 5 분 동안) 씻으십시오. 현미경으로 DAB 탐지를 수행하십시오.
   6. DPBS로 슬라이드를 3 번 ​​씻으십시오 (각각 2 분씩). 1 ~ 2 분 동안 헤 마톡 실린에 슬라이드를 담그어 세포 핵을 대조합니다. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈 (25, 50, 75, 90, 95, 100 및 100 %; 각 3 분)로 탈수 한 다음 자일 렌으로 3 회 연속 해리합니다. 마지막으로, 슬라이드를 마운트하고 현미경으로 시각화하십시오.
8. sGAG 콘텐츠를 탐지합니다.
   1. 60 ° C에서 2 시간 동안 파파인 용액으로 연골 화 펠렛을 분해하십시오.
   2. dsDNA 분석 키트 및 형광 계 시스템을 사용하여 DNA 함량을 결정합니다. 525 nm에서 흡광도를 측정하여 DMMB 염료 용액과 혼합하여 sGAG 함량을 측정하십시오 ⁸ .
   3. 표준 곡선에 대한 sGAG의 농도를 계산하십시오.상어 콘드로이틴 황산염.
9. hiPSC-Chon pellets에서 연골 분화 마커의 실시간 PCR 분석을 수행하십시오.
   1. 하나의 튜브에 500 μL의 얼음 차가운 추출 시약을 첨가하여 동일한 연질 펠렛 중 3-4 개를 수확하십시오. 완전히 소용돌이 치고. RT에서 5 분 샘플을 품어.
   2. 클로로포름 0.1 mL를 넣는다. 샘플을 15 초 동안 볼 텍싱하고 3 분 동안 실온에서 배양합니다. 12,000 xg 및 4 ° C에서 15 분 동안 시료를 원심 분리하십시오. 상부 수성 상 (약 250 μL)을 새로운 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 옮긴다.
   3. 샘플에 아세트산 나트륨 25 μL와 글리코겐 1 μL를 첨가하십시오. 250 μL의 이소 프로필 알코올과 혼합하여 RNA를 침전시킵니다. 철저히 섞는다. 샘플을 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
   4. 12,000 xg 및 4 ° C에서 10 분간 원심 분리하십시오. 뜨는 물을 완전히 제거하십시오. 75 % 에탄올 500 μL로 RNA 펠렛을 두 번 씻으십시오.
   5. 5 분간 원심 분리기7,500 xg 및 4 ° C. 모든 남은 에탄올을 제거하고 RNA 펠렛을 5-10 분 동안 공기 건조시킵니다. RNA를 10 μL의 nuclease가없는 물에 녹입니다.
   6. 역전사 효소 시스템을 사용하여 RNA를 cDNA로 전환하십시오. qPCR 키트 마스터 믹스 (2x)와 실시간 PCR 시스템을 사용하여 cDNA 샘플을 실시간 PCR에 적용하십시오. ⁹ .
      참고 : 프라이머 순서는 다음과 같습니다 :
      h AGGRECAN -F : TCGAGGACAGCGAGGCC;
      h AGGRECAN -R : TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      h β-ACTIN -F : TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      h β-ACTIN -R : GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      h COL2- F : TGGACGATCAGGCGAAACC;
      h COL2 -R : GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      h SOX9- F : AGCGAACGCACATCAAGAC;
      h SOX9 -R : CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      h COL10 -F : ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      h COL10 -R : GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

결과

hiPSCs의 연골 형성 분화 :

EB 형성 배지 및 기초 배양 배지를 사용하여 hiPSC를 중간 엽 계통으로 분화시켰다. 다중 단계 배양 방법이 사용되었습니다 ( 그림 1 ). 첫째, hiPSCs는 10 일 동안 EB 형성을 통해 자발적으로 분화되었다 (D10, 도 2A ). 둘째, EBs에서 10 일 (D10 + 10) 동안 더 많은 세포가 빠져 나간다. 이 두 단계 동안, iPSCs는 점차 원래 형태학을 잃어 버렸고 방추형 모양을 얻었고 ( 그림 2B ), 통과 후 섬유 아세포 모양으로 바뀌었다. 셋째, 계대 배양 후 단층에서 세포를 확장시켰다 ( 그림 2C

토론

여기, 우리는 iPSCs를 통해 PBCs에서 연골 세포를 생성하는 프로토콜을 제공합니다. PBC는 임상 분야에서 보편적으로 널리 사용되기 때문에 재 프로그래밍을위한 잠재적 대안으로 제시됩니다. 이 연구에서, episomal vectors (EV)는 Zhang et al.에 의해 확립 된 방법에 따라 PBC를 iPSC로 재 프로그램하기 위해 이용되었다 . ¹¹ . 이러한 통합이없는 접근 방식은 임상 필드 ^{(12), (13)의} 폭 넓은 영향을 미칠 것으로 생각됩니다 바이러스 관련 유전 독성을 통합 포함되지 않습니다. 이 연구에서 혈액 세포로부터 무결점 iPSC를 생성하는 재 프로그래밍 효율은 만족 스러웠다. 말초 혈액 2 mL에서 30 개 이상의 iPSC를 생산할 수있었습니다. 따라서 PBC는 연골 조직 및 기타 임상 적용을위한 iPSC를 생성하는 데 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Knockout DMEM	HiPSC 배양 및 EB 형성 배지에 사용되는	Invitrogen	10829018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Invitrogen	10828028	hiPSC 배양 및 EB 형성 배지에 사용되는 보다 정의된 FBS가 없는 배지 보충제
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	sh30070.03	hiPSC 배양 및 EB 형성 배지에 사용되며 세포에 탁월한 가치를 제공합니다. 배양
비필수 아미노산	Chemicon	TMS-001-C	세포 성장과 생존력을 증가시키기 위해 모든 세포 배양 배지에서 성장 보조제로 사용
L-글루타민	Invitrogen	TMS-002-C	세포 배양에 필요한 아미노산
염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)	Peprotech	100-18B	hiPSC의 다능성 및 자가 재생을 유지하는 데 사용되는 사이토카인
Dispase	Invitrogen	17105041	계대배양을 위한 hiPSC 해리에 사용
DMEM	Gibco	C11960	MSC 배양 배지에 사용되는
기초 배지 0.1% 젤라틴	Millipore	ES-006-B	접시에 세포 부착에 사용
0.25% 트립신/EDTA	Gibco	25200072	세포 해리에 사용
DPBS	Gibco	14190250	세포 세척 또는 시약에 사용되는 균형 잡힌 염 용액으로
2-메르캅토에탄올	인비트로겐	21985023	모든 세포 배양 배지에서 성장 보조제로 사용됩니다.
그것의	invitrogen	41400045	인슐린, 트랜스페린, 연골 생성 감별법을 위한 셀레늄 Solution.Used.
아스코르브산	시그마	4403	비타민 C로 알려져 있습니다. 활발한 성장에 도움이 되며 항산화 특성이 있습니다.
Sodium pyruvate	Gibco	11360070	포도당 외에 에너지 원으로 세포 배양 배지에 첨가됩니다.
변형 성장 인자 - 베타 1	Peprotech	AF-100-21C	세포 증식, 성장 및 연골 생성 분화를 조절하는 사이토 카인.
Abcam	ab34712	에 대한 토끼 다클론 항체	이 항체는 연골 조직에 특이적인 II형 콜라겐과 반응합니다.
Abcam	ab49945	에 대한 마우스 단클론 항체	이 항체는 hyperthrophic 연골 세포의 산물인 X형 콜라겐과 반응합니다.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	슬라이드 장착 및 장기 보관용
Toluidine blue	Sigma	89640	프로테오글리칸 검출에 사용됩니다.
Alcian blue	Amresco	#0298	글루코사미노글리칸 검출에 사용됩니다.
Papain	Sigma	P4762-25MG	연골 생성 펠릿을 소화하는 데 사용됩니다.
디메틸메틸렌 블루	시그마	341088-1G	글리코사미노글리안을 정량화하는 데 사용
상어 연골에서 콘드로이틴 황산염 나트륨 염	시그마	C4384-250MG	sGAG 함량 측정을 위한 표준 곡선을 그리는 데 사용됩니다.
Qubit dsDNA HS 어세이 키트	Invitrogen	Q32851 (100)	DNA 함량 측정에 사용
TRIzol	Invitrogen	15596018	세포에서 RNA 분리에 사용
역전사 효소 시스템	Promega	A3500	RNA를 cDNA,
SYBR, FAST, QPCR 키트로	Kapa	KK4601	Real-time PCR에 사용