우리는 배아 체 형성 (EB) 형성, 섬유 아세포 세포 확장 및 연골 형성 유도를 포함하는 통합없는 방법을 사용하여 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 인간 말초 혈액 (PB)으로부터 연골 세포 계통을 생성하는 프로토콜을 제시한다.
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정오 공지
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요약
초록
이 연구에서, 우리는 말초 혈액 세포 (PBCs)를 통합 된 방법으로 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 연골 세포를 생산하는 종자 세포로 사용했다. 배아 체 형성 (EB) 형성 및 섬유 아세포 세포 확장 후, iPSCs는 무 혈청 및 이종없는 조건 하에서 21 일 동안 연골 분화 유도된다. 연골 세포 유도 후 형태 학적, 면역 조직 화학적 분석 및 생화학 적 분석뿐만 아니라 연골 분화 마커의 정량적 실시간 PCR 검사를 통해 세포의 표현형을 평가한다. 연골 형성 펠릿은 알 시스 파랑 및 톨루이딘 블루 염색 양성 반응을 보였다. 콜라겐 II와 X 염색의 면역 조직 화학도 양성이다. 황화 글리코 사 미노 글 라이칸 (sGAG) 함량과 연골 분화 마커 인 콜라겐 2 ( COL2 ), 콜라겐 10 ( COL10 ), SOX9 및 아그로 칸 (AGGRECAN)hiPSCs 및 섬유 아세포와 비교하여 rogenic pellets. 이러한 결과는 PBC가 연골 수복을위한 iPSC를 생성하기위한 종자 세포로 사용될 수 있음을 시사한다.
서론
연골 조직은자가 수복 및 재생 능력이 매우 낮습니다. 다양한 외과 적 중재 및 생물학적 치료법이 연골 및 관절 기능을 회복시키는 데 사용되고 있으며 만족스럽지 못한 결과가 있습니다. 최근 줄기 세포 기술의 발달로 전체 연골 치료 분야가 바뀔 수 있습니다 1 . 다양한 줄기 세포가 종자 세포로 연구되었지만 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 거부 반응을 일으키지 않으면 서 여러 유형의 환자 특정 세포를 제공 할 수 있기 때문에 가장 유망한 선택 인 것으로 보인다 2 . 또한, 그들은 성체 세포의 제한된 증식 성을 극복하고 자신의 재생 능력과 만능 능력을 유지할 수 있습니다. 또한, 유전자 표적화는 연골 세포의 특정 유형을 얻기 위해 유전자형을 변경하는 데 사용할 수 있습니다.
섬유 아세포는 재 프로그래밍 잠재력이 잘 연구 되었기 때문에 iPSC 생성에 널리 사용되었습니다.그러나 환자의 고통스런 생검 및 섬유 아세포의 시험 관내 팽창에 대한 필요성과 같이 유전자 돌연변이를 야기 할 수있는 몇 가지 한계가 아직 극복되어야합니다 3 . 최근, PBC는 리 프로그래밍
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프로토콜
PBCs로부터 hiPSC를 생성하기위한 프로토콜은 이전의 연구 5 에서 찾을 수있다. 이 연구는 우리 기관의 기관 검토위원회 (Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다.
1. 배아 체 (EB) 형성
- hiPSC 배지 50 ML : 15 % 녹아웃 혈청 대체 (KSR), 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 × 비 필수 아미노산, 55 μM 2- 메르 캅토 에탄올, 2 MM L을 보충 한 녹아웃 Dulbecco의 수정 이글 매체 (DMEM) - 글루타민 및 8 ng / mL 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF).
- 50 ML의 EB 형성 매체 : 15 % KSR, 5 % FBS, 1x 비 필수 아미노산, 55 μM 2- 메르 캅토 에탄올 및 2 MM L - 글루타민으로 보충 DMEM을 확인하십시오.
- 기본 배양 배지 50 ML : 20 % FBS, 1 × 비 필수 아미노산, 55 μm의 2 - mercaptopoethanol, 2 MM L - 글루타민으로 보충 DMEM을 확인하십시오.
- 디스 패아 제 용액 10 mL를 녹아웃 DMEM에 1 mg / mL로 준비합니다.
- 문화피더 세포 (....
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결과
hiPSCs의 연골 형성 분화 :
EB 형성 배지 및 기초 배양 배지를 사용하여 hiPSC를 중간 엽 계통으로 분화시켰다. 다중 단계 배양 방법이 사용되었습니다 ( 그림 1 ). 첫째, hiPSCs는 10 일 동안 EB 형성을 통해 자발적으로 분화되었다 (D10, 도 2A ). 둘째, EBs에서 10 일 (D10 + 10) 동안 더 많은 세포가 빠져 나간다. 이 두 단계 동안, iPSCs는 점차 원래 형태학을 잃어 버렸고 방추형 모양을 얻었고 ( 그림 2B ), 통과 후 섬유 아세포 모양으로 바뀌었다. 셋째, 계대 배양 후 단층에서 세포를 확장시켰다 ( 그림 2C
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토론
여기, 우리는 iPSCs를 통해 PBCs에서 연골 세포를 생성하는 프로토콜을 제공합니다. PBC는 임상 분야에서 보편적으로 널리 사용되기 때문에 재 프로그래밍을위한 잠재적 대안으로 제시됩니다. 이 연구에서, episomal vectors (EV)는 Zhang et al.에 의해 확립 된 방법에 따라 PBC를 iPSC로 재 프로그램하기 위해 이용되었다 . 11 . 이러한 통합이없는 접근 방식은 임상 필드 (12), (13)의 폭 넓은 영향을 미칠 것으로 생각됩니다 바이러스 관련 유전 독성을 통합 포함되지 않습니다. 이 연구에서 혈액 세포로부터 무결점 iPSC를 생성하는 재 프로그래밍 효율은 만족 스러웠다. 말초 혈액 2 mL에서 30 개 이상의 iPSC를 생산할 수있었습니다. 따라서 PBC는 연골 조직 및 기타 임상 적용을위한 iPSC를 생성하는 데 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 자신의 플라스미드 인 Xiaobin Zhang에게 감사 드리고자합니다. 우리는 또한 Shaorong Gao와 Qianfei Wang에게 실험 중에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No.81101346, 81271963, 81100331), 베이징 215 고급 인재 프로젝트 (No.2014-3-025) 및 베이징 차오양 병원 기금 (No CYXX-2017-01), 중국 과학 아카데미 청소년 혁신 진흥 협회 (YL).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Knockout DMEM | HiPSC 배양 및 EB 형성 배지에 사용되는 | Invitrogen | 10829018 |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | hiPSC 배양 및 EB 형성 배지에 사용되는 보다 정의된 FBS가 없는 배지 보충제 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | hiPSC 배양 및 EB 형성 배지에 사용되며 세포에 탁월한 가치를 제공합니다. 배양 |
| 비필수 아미노산 | Chemicon | TMS-001-C | 세포 성장과 생존력을 증가시키기 위해 모든 세포 배양 배지에서 성장 보조제로 사용 |
| L-글루타민 | Invitrogen | TMS-002-C | 세포 배양에 필요한 아미노산 |
| 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) | Peprotech | 100-18B | hiPSC의 다능성 및 자가 재생을 유지하는 데 사용되는 사이토카인 |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | 계대배양을 위한 hiPSC 해리에 사용 |
| DMEM | Gibco | C11960 | MSC 배양 배지에 사용되는 |
| 기초 배지 0.1% 젤라틴 | Millipore | ES-006-B | 접시에 세포 부착에 사용 |
| 0.25% 트립신/EDTA | Gibco | 25200072 | 세포 해리에 사용 |
| DPBS | Gibco | 14190250 | 세포 세척 또는 시약에 사용되는 균형 잡힌 염 용액으로 |
| 2-메르캅토에탄올 | 인비트로겐 | 21985023 | 모든 세포 배양 배지에서 성장 보조제로 사용됩니다. |
| 그것의 | invitrogen | 41400045 | 인슐린, 트랜스페린, 연골 생성 감별법을 위한 셀레늄 Solution.Used. |
| 아스코르브산 | 시그마 | 4403 | 비타민 C로 알려져 있습니다. 활발한 성장에 도움이 되며 항산화 특성이 있습니다. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | 포도당 외에 에너지 원으로 세포 배양 배지에 첨가됩니다. |
| 변형 성장 인자 - 베타 1 | Peprotech | AF-100-21C | 세포 증식, 성장 및 연골 생성 분화를 조절하는 사이토 카인. |
| Abcam | ab34712 | 에 대한 토끼 다클론 항체 | 이 항체는 연골 조직에 특이적인 II형 콜라겐과 반응합니다. |
| Abcam | ab49945 | 에 대한 마우스 단클론 항체 | 이 항체는 hyperthrophic 연골 세포의 산물인 X형 콜라겐과 반응합니다. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | 슬라이드 장착 및 장기 보관용 |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | 프로테오글리칸 검출에 사용됩니다. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | 글루코사미노글리칸 검출에 사용됩니다. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | 연골 생성 펠릿을 소화하는 데 사용됩니다. |
| 디메틸메틸렌 블루 | 시그마 | 341088-1G | 글리코사미노글리안을 정량화하는 데 사용 |
| 상어 연골에서 콘드로이틴 황산염 나트륨 염 | 시그마 | C4384-250MG | sGAG 함량 측정을 위한 표준 곡선을 그리는 데 사용됩니다. |
| Qubit dsDNA HS 어세이 키트 | Invitrogen | Q32851 (100) | DNA 함량 측정에 사용 |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | 세포에서 RNA 분리에 사용 |
| 역전사 효소 시스템 | Promega | A3500 | RNA를 cDNA, |
| SYBR, FAST, QPCR 키트로 | Kapa | KK4601 | Real-time PCR에 사용 |
참고문헌
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell
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재인쇄 및 허가
정오
Formal Correction: Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells.
The corresponding author was updated from:
Yueying Li
yueyinglee2010@hotmail.com
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu
waterkins@163.com
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University
