최소한 침략 적 근육 (MIME) 포함-기증자 세포 중재 하는 Myogenesis를 촉진 하기 위하여 새로운 실험 기법

건강 한 골격 근육, 비록 포스트 mitotic 위성 세포 (SCs)^1,2;로 알려진 조직 상주 조직적 셀의 존재로 인해 우수한 재생 능력 보유 그리고^3,4검토. 그러나, 근육 dystrophies, 외상 또는 가속된 노화에 의해 발생 하는 병 적인 조건 하에서 근육 재생 수 있습니다 하지와 유지할 근육 쇠 약, 그리고 따라서, 진보적인 근육 섬유 손실 발생⁵. 효과적인 방법은 근육에서 SCs를 격리 하 여 myoblasts (후와 myotubes)의 많은 수를 생성 하는 문화에서 그들을 확장 개발 되었습니다, 호스트 근육에 근육 섬유의 순수 관련 번호를 생성 하는 시도 최소한의 성공⁶만 나왔고. 로 다른 많은 세포 유형에 myoblasts 혼자 호스트 조직에 주입 하면 세포의 대부분 할 하지 engraft^7,8. 우리는 신경 근육 학 전기 자극 (NMES) 인간의 myoblasts⁸주사 재생 불충분 한 호스트 마우스 근육에 기증자 세포 유래 myogenesis을 용이 하 게 나타났습니다. 다른 이식 수술 biopsied 근육 또는 연결 된 SCs와 단일 근육 섬유 NMES, SCs와 함께 전체 근육 섬유를 이식할 것 이식 보다 더 유리한 제안 없이 적당 한 myogenesis 촉진 증명 조직적 셀 혼자^9,10. 때문에 기증자 또는 호스트 근육으로 투입 조작된 근육 조직 세포만을 이식 하는 것 보다 더 나은 결과 생산, 조직 또는 조직 구조로 기증자 세포 engraftment;에 대 한 중요 한 단서를 제공할 수 있습니다 가능 하다 세포 치료 연구와 관련 된 다양 한 세포 종류^10,,1112에 점점 더 분명 되 고 있다는 개념.

최근 데이터는 인간에서 얻은 SCs 이상 2 주 사후 생성 myotubes 문화¹³에 것이 좋습니다. 따라서 우리는 살아있는 호스트에 근육 조직 수확 사후의 이식 근육 섬유 손실을 반전 됩니다 경우 평가 하고자 하는. MIME 기증자 세포 유래 myogenesis를 홍보 하기 위해 살아있는 호스트의 골격 근육 조직으로 기증자 근육 조직을 이식 하 라는 새로운 기술을 개발 했습니다. MIME 수술 바늘 바늘 트랙;을 만들 호스트 근육을 통해 전달 하는 것을 포함 한다. 바늘 트랙;을 통해 기증자 근육 조직의 작은 세그먼트 그리기 호스트 근육;에 포함 된 기증자 조직 떠나 그리고 조직 접착제로 바늘 구멍을 닫는입니다. 공부 안락사 쥐에서 기술을 연습 후 다른 실험에 우리 지금 immunodeficient는 살아있는 쥐에 MIME 수행한 편 녹색 형광 단백질 (GFP), 표현 그리고 3 ~ 14 일에 후속 포스트 MIME. 3 일 후 MIME에서 우리는 기증자 마우스 (GFP-) EDL 근육 호스트 마우스에 이식 (GFP +) TA 근육, 남아 호스트 근육에 포함 된 확인 합니다. 14 일 후 MIME에서 BaCl₂ myotoxin 부상 손상 및 myogenesis, 유도 후 우리 확인는 약 5%, 26%, 26%와 43% 단일 호스트 따 근육 섬유의 쇼 호스트 기여, 최소한의 호스트 기여, 적당 한 호스트 기여, 그리고 최대한 기여, 각각 호스트. 중앙 nucleation (변성 및 후속 중생의 표식) MIME 및 myotoxin 주입 후 따 근육 섬유의 약 95%에서 볼 수 있다.

우리 공부 따 근육 MIME + BaCl₂ 후 14 일 때문에이 시간 포인트 재생된 섬유의 대부분은 중앙 nucleated 때 중생의 중간 단계를 캡처합니다. 우리는 공부 하는 GFP + 마우스 그렇게 할 때 우리는 결국 호스트 쥐로 인간의 시체 근육 이식, 우리 호스트와 기증자의 근육 섬유를 쉽게 구별할 수 있을 것입니다에 MIME에 대 한 호스트. 우리는 사용 하는 마우스 EDL 근육이이 근육에서 단일 섬유 따 근육⁹보다 큰 조직적 잠재력 나타났습니다 때문에 실험 기증자 조직으로. EDL 근육 따 근육에 시너지도 이며 비슷한 섬유 유형 구성 했다. 우리의 예비 데이터 MIME는 호스트 근육에 기증자 세포 유래 myogenesis를 촉진 수 것이 좋습니다.

살아있는 동물을 포함 하는 모든 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 웨인 주립 대학, 디트로이트, 미시간, 미국에 의해 승인 되 고 관리 및 실험 동물의 사용 (에 대 한 가이드를 따라 8 판, 2011, 발행 국가 아카데미 압박, 500 5 거리, NW, Lockbox 285, 워싱턴, DC 20055, 미국). 승인된 IACUC 프로토콜에 의하여 통증 및 고통을 포함 하는 절차는 일반적인 마 취 유도 및 isoflurane 흡입 효과 (1.5-5%)에서 유지 관리 수행 했다. 마 취 및 종을의 부족 꼬집어, 발가락을 철수의 부족에 의해 확인 되었다 또는 털 응답 (isoflurane 비율 증가 효과 유지 하기 위해 필요에 따라). 프로토콜, 최소한 침략 적 특성상 한 " 멸 균 팁 " 기술 뒤를 이었다. 동물 마 취 동안, 석유 젤리 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 되었습니다. 아니 특별 한 치료 했다; 그러나, 다이어트 젤 일반 마 취. 조사 절차는 수술 노출 호스트를 포함 하지 않는 다음과 같은 MIME, 진통 하 IACUC에 의해 승인 절차를 다음 24 h에 대 한 동물을 제공 했다 근육, 그리고 많은 일반적인 진통 약물 정상적인 근육 재생에 영향을 미칠 것으로 알려진 한 hindlimb에 국한 하기 때문에 정상적인 기능에는 영향을 미치지 않습니다.

1. 동물 모델

1. MIME에 대 한 호스트 마우스
   1. 호스트로 사용 NSG GFP 마우스 (8-10 주, 남성) 근육 이식 연구.
      참고: 이러한 마우스는 이상적인 호스트 수용자 근육 이식 때문에 성숙한 T와 B 림프 톨과 기능성 천연 킬러 세포 부족, 부족 한 cytokine 신호, allografting 또는 xenografting 비 근육 세포에 대 한 다른 사람에 의해 사용 되었습니다 < sup 클래스 = "외부 참조" > 14. 유비 쿼터 스 GFP 식 호스트 (GFP +) 및 기증자 세포 유래 (GFP) 근육 섬유의 쉽게 식별할 수 있습니다.
2. MIME에 대 한 기증자 마우스
   1. 기증자 쥐로 사용 C57BL/6J 쥐 (12-16 주).
      참고: 이러한 마우스는 적합 한 기증자 쥐 때문에 그들은 완전히 매핑된 게놈, 어떤 골격 근육 병 리를 알 수 없는, 쉽게 사용할 수 있고 경제적, GFP를 표현 하지 않습니다.

2. 기증자 근육 조직 준비

1. 매 지도 봉합 및 수확 기증자 EDL 근육
   1. 경부 전위와 thoracotomy 탁상에 의해 관리 하는 일반적인 마 취하에 수행 하 여 기증자 마우스를 안락사 의료 산소 (흡입된 isoflurane; 2-5% 효과)에 의해 구동 isoflurane 기화.
   2. EDL 근육에 액세스 하려면 수술가 위를 사용 하 여 다리의 앞쪽 표면에 피부를 열고. 앞쪽 다리에 따 근육을 찾아서 EDL 근육 따 근육 뒤에 위치를 시각화 하기 위해 그것을 제거 합니다. EDL 근육 뒤에 집게의 쌍의 끝을 밀어 하 고 발가락 확장 보고 부드러운 견인을 적용 (이 근육은 EDL 인지 확인).                                                                                                                                                          
      참고: 기증자 조직 지역 수술, aseptically 준비 전에 수확 해야.
   3. 사용 ~ 10 cm의 세그먼트 4-0 실크, 꼰, 비 흡수, 무 균 봉합, 그리고 EDL 근육의 근과 원심 힘 줄을 지도 봉합을 적용 하 게 2 개의 두 배 매듭. ( 그림 1A).
   4. 원심 EDL 힘 줄을 잘라 EDL 근육을 반영 하 고 근 힘 줄을 잘라.
   5. 장소 기증자 EDL 근육 페 트리 접시에 가득 마우스 벨 솔루션.

3. MIME에 대 한 호스트 마우스를 준비

1. 마 취
   1. 전신 마 취 (흡입된 isoflurane; 1.5-5% 효과) 의료 산소에 의해 구동 탁상 isoflurane 기화에 의해 관리 아래 호스트 마우스.
   2. 유도 실에서 마 취를 유발 하 고 동물에 다른 절차를 수행 하는 동안 마 취를 유지 하기 위해 코 콘을 마우스를 전송. 동물 마 취 동안 패드를가 열 하는 등온선 젤 열 지원.
2. 피부 준비
   1. 동물을 제거 하려면 ' s 모피, 왼쪽된 뒷 다리의 앞쪽 측면 depilatory 크림을 적용. 후속 절차에 대 한 제어 다리는 오른쪽 다리 역할.
   2. 두고는 분리와 depilatory 크림을 2 분 클린에 depilatory 크림 모피 인산에 젖은 잎사귀와 버퍼링 식 염 수 (PBS). 털 제거 후 스크럽 povidone-요오드 제거 솔루션 및 70% 에탄올의 3 번갈아 잎사귀와 피부.
3. 호스트 따 근육에 바늘 트랙을 만드는
   1. 전달 호스트의 센터를 통해 18 게이지 (1에 긴) 수술 바늘 따 근육 근육에 따라 ' s 긴 축 ( 그림 1B). TA 근육 및 근육 배꼽 ( 그림 1B)의 센터를 통해 길이 따라 cephalo 꼬리 방향으로 바늘을 통과.
      참고:이 단계의 목적은 어떤 기증자 근육의 조각을 포함 수 바늘 트랙을 만드는 것입니다. TA 근육의 센터에 기증자 조직 포함 것 허용 하도록 마이그레이션 및 전체 호스트에서 myogenesis 촉진 기증자 조직에서 SCs 따 근육.
4. 호스트 따 근육의 바늘 트랙에 소스 기증자 조직
   1. 수술 바늘 호스트 따 근육 내에서 일단 통과 한쪽 끝에 수술 바늘의 루멘을 통해 기증자 조직의 지도 봉합 한 caudo 두 부 방향 ( 그림 1C).
   2. 바늘 caudo 두 부 방향에서 호스트 따 근육에서 인출 됩니다 바늘 트랙을 통해 기증자 조직의 그립니다.
   3. 는 기증자 조직의 꼬리와 두 부 끝에 지도 봉합을 사용 하 여 조직 기증자의 배치를 조정. 기증자 조직 호스트 따 근육 ( 그림 1D) 내에서 누렸다는 확인 하십시오.
   4. 일단 기증자 조직 배치 최적화 지침 봉합 잘라 조정을 어떤 최종 기증자 조직 배치에 뾰족한 집게와.
   5. 물개 피부 바늘 상처 ( 그림 1E -F) 집게와 상처 가장자리에 가깝게 27 게이지 수술 바늘의 팁과 수의 조직 접착제를 적용 하 여.

4. 공동으로 행 한 근육 변성 유발 및 중생을 근육 Myotoxin 주사

1. MIME 후 호스트 근육에 광범위 한 근육 섬유 손상 유도 호스트 따 근육 1.2% BaCl ₂ (myotoxin)의 50-60 µ L 주입 및 기증자 조직 안에서 포함 된 ¹⁵.
2. 주사 BaCl ₂ 호스트 조교의 길이 따라 3 사이트
   근육 (근, 중, 말 초-3 분의 1 근육 배).
   참고: 재생 ¹⁶ 다음 공동된 근육 섬유 손상 유도 골격 근육에 주입 BaCl ₂, cardiotoxins 및 notexin 같은 myotoxins.

5. 포스트 절차 동물 관리

1. 후 MIME 및 BaCl ₂ 주입, 호스트 마우스 청소 ' s 왼쪽된 뒷 다리 에탄올과 다리와 피부를 보호 하기 위해 석유 젤리의 얇은 레이어를 적용.
2. 절차 후 피부 관리, 후 코 콘에서 호스트 마우스 제거.
3. 침구 없이 독방 복구에 마우스를 놓습니다. 등온선 젤 난방 패드를 통해 회복 동물에 열 지원 복구 장의 절반 아래 배치 제공.
   참고: 하나의 절반은 하지 필요한 경우 그 동물 난방 패드에서 이동할 수 있도록가 열.
4. 호스트 마우스는 완전히 마 취에서 회복 후에 그것의 원래 감 금 소 동물을 반환 합니다. 동물 시설에 두고 동물 다시 후속 실험 수행 됩니다 때까지. 후속 준비 될 때까지 호스트 마우스를 매일 모니터링 – 예: 3 또는 14 일 후 MIME에. MIME, 다음 동물 모니터링 됩니다 실험실 직원에 의해 뿐만 아니라 수의 직원에 의해 –이 주로 동물, 경고 밝고 반응; 경우 평가 포함 또한 동물 고통의 명백한 조짐을 보이고 있다 또는 어려움을 이동, 먹이, 음주 및 정리는 데 평가.

6. 조직 컬렉션

1. 수확 호스트 근육
   1. 경부 전위와 thoracotomy 의료 산소 (에 의해 구동 탁상 isoflurane 기화에 의해 관리 하는 일반적인 마 취하에 수행 하 여 호스트 마우스를 안락사 흡입된 isoflurane; 효과 2-5%). 탐정 IACUC 승인 전에 안락사. 전신 마 취 아래 수확 따 근육에 소재한
   2. 호스트 따 근육에 액세스 하려면를 사용 하 여 수술가 위 다리의 앞쪽 표면에 피부를 열고. 앞쪽 다리에 따 근육을 찾아 원심 힘 줄을 잘라, 근육을 반영 하 고 근 위 근육 첨부 파일 (섹션 2.1 참조) 잘라.
   3. 수집 (실험) 왼쪽 및 오른쪽 (제어) TA 근육.
2. 얼어 수확된 근육 스냅
   1. 배치 하 여 수확된 근육 무게에 종이 무게와 규모를 무게.
   2. 간단히 근육 cryoprotection의 미네랄 오일에 찍어. 초과 석유 얼룩.
   알루미늄 호 일, 그리고 스냅에
   3. 장소 근육 빠르게는 Dewar에 채워진 액체 질소에 그들을 immersing 하 여 근육을 고정 합니다. 레이블이 지정 된 cryovials을 샘플을 전송 하 고 나중 연구-80 ° C 냉동 실에 샘플을 저장.

7. 조직학 연구

1. Cryosectioning 근육 조직을 직렬 횡단면 수집
   1. 액체 질소를 포함 하는 Dewar에 그들을 배치 하 여 한 cryostat 샘플-80 ° C 냉동 고에서 전송.
   2. Cryostat에서 한 번에 하나의 샘플을 처리. 차가운 면도기 블레이드 (블레이드 cryostat에 저장)의 경우, 두 번 근육은 약 1-2 m m 두께의 세그먼트를 생산 하기 위해 TA 근육의 중간 배꼽에서 샘플을 잘라. Cryostat 섹션을 만들기 위한이 세그먼트를 유지 하 고 그것의 cryovial를 근육의 나머지 부분을 반환.
   3. 최적의 절삭 온도 (10 월) 복합 동결, cryostat 견본 디스크에 조직의 두꺼운 세그먼트 확보. 견본 홀더에 견본 디스크를 놓습니다.
   4. 거친 얼굴 20 µ m 섹션 절단 샘플. Cryostat 섹션에 대 한 유리 슬라이드에 몇 가지 20 µ m 섹션을 수집.
   5. 20 µ m 섹션의 품질은 만족 하는 경우 5 µ m 절단 두께 변경 하 고 품질을 평가 하기 위해 몇 가지 섹션을 수집 합니다. 5 µ m 섹션 품질에 만족 하는 경우 직렬 섹션을 수집 합니다. 슬라이드 당 2-3 섹션을 수집 하 고 수집 3 슬라이드에 대 한 충분 한 섹션.
   6. 실험 (왼쪽)와 각 동물의 컨트롤 (오른쪽) TA 근육에서 섹션을 수집.
2. GFP 공부 식
   참고: 근육 섬유에 GFP 식 공부 준비 슬라이드 (섹션 7.1)의 1 세트를 지정.
3. 섹션에 반대로 퇴색 매체의 ~ 50 µ L을 적용 하 고 유리 coverslip 적용. 투명 매니큐어로 coverslip 가장자리를 밀봉.
   1. 빛과 형광 현미경을 사용 하 여 (재료의 표 참조) 10 배 목표와 GFP를 시각화에 대 한 적절 한 필터 섹션을 공부.
   2. 수집
      디지털 (~ 15)의 이미지 따 근육의 전체 횡단면을 충당 하기 위해 시각 필드를 중복. 형광에서 현미경에 위상 대비 모드로 전환 하 여 각 visual 필드에 대 한 위상 대비 이미지 수집.
   3. 개별 이미지를 단일 복합 이미지; 타일 수 적합 한 이미징 소프트웨어 이미지를 열고 예를 들어, 사용 된 " photomerge " 이미징 소프트웨어에서 파일 메뉴에서 옵션 재료의 테이블에에서 나열 된.
   4. 적당 한 이미지 분석 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ) GFP 형광 이미지를 엽니다. 동그라미 개별 근육 섬유를 사용 하는 " ROI 도구 " 각 섬유에 대 한 의미 하는 형광 강도 기록 하 고.
   5. 계산 의미 형광 강도 높은 GFP 식을 표시 하 고 정상적인 형태를가지고 10 섬유의 평균을 취하여 최대 GFP (형광) 강도
      . 각 섬유에 대 한 % 최대 GFP 강도 최대 GFP 강도 의해 각 섬유에 대 한 말은 개화 강도 나누어 100을 곱한 계산 합니다. 그림 3E와 같이 각 타 근육에 GFP 분석의 결과 집계.
4. Desmin의 4 Immunofluorescent 라벨 근육 섬유 무결성 및 myonuclear 위치를 공부 하 고 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 각각.
   참고: 슬라이드 준비, 위, 근육 섬유에 desmin 라벨 연구의 1 세트를 지정 합니다. 10 분에 대 한 PBS에 2 %paraformaldehyde
   1. 수정 섹션 세척 3 회 PBS 가진 섹션.
      주의: 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) 착용 paraformaldehyde 처리할 때 처리 될 때.
   2. 블록 섹션 3% 소 혈 청 알 부 민 0.01%를 포함 하는 PBS에 희석 30 분 트리톤 X100. 이 차단 솔루션으로 향후 불린다 기본 희석제.
   3. 기본 희석 액 (1: 200)에서 토끼 안티 desmin 면역 글로불린 G (IgG) 희석.
   4. 완료 되 면 차단 섹션에 희석된 주 항 체를 적용 하 고 품 어 하룻밤 ~ 4 ° C. 세척에 냉장고에서 한 번 섹션 (5 분) 0.1%를 포함 하는 PBS와 트라이 톤 X-100. 이 솔루션 첫 번째 워시 버퍼 향후 불린다.
   5. 세척 섹션 PBS로 3 회 세척 당 (5 분).
   6. 준비 안티 염소를 diluting 하 여 이차 항 체 IgG (빨간색 형광 염료를 활용) 0.01%를 포함 하는 PBS에 토끼 트라이 톤 X-100.
   7. 섹션에 희석된 이차 항 체를 적용 하 고 60 분에 대 한 실 온 (~ 23 ° C)에서 품 어
   8. 씻어 첫 번째 워시 버퍼 섹션 한 번 (5 분). 씻어 섹션 PBS로 3 회 세척 당 (5 분).
   9. 적용 DAPI 3 분 세척 섹션 PBS로 3 회 세척 당 (1 분). 적용 ~ 섹션에 반대로 퇴색 매체의 50 µ L 유리 coverslip 적용. 투명 매니큐어로 coverslip 가장자리를 밀봉.
   10. 빛과 형광 현미경을 사용 하 여 (참조 테이블의 자료), 연구 직렬 섹션 10 배 목표 및 시각화에 대 한 적절 한 필터를 빨간색 형광 염료.
   11. 따 근육의 전체 횡단면을 충당 하기 위해 겹치는 시각 필드의 디지털 이미지 (~ 15)를 수집 합니다. DAPI 적절 한 필터 설정으로 전환 하 여 각 visual 필드에 대 한 라벨의 형광 이미지 수집.
   12. 오픈 단계 7.2.3-7.2.4에에서 설명 된 대로 적절 한 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 하 고.
       참고: 이미지를 식별 하 고, 어떤 근육 섬유 손상된 (desmin 부정적인)는, 연구는 근육 섬유는 중앙 nucleation (desmin 긍정적인 섬유 DAPI 표시 된 핵 내부 보다는 주변 위치를 있는), 그리고, 섹션의 영역 염증 또는 섬유 증 (와 많은 DAPI 표시 된 핵을가지고 하지만 근육 섬유 없는 분야).

3 일 후 MIME에서 기증자는 MIME에 의해 이식 EDL 호스트 따 근육 격실 (그림 2A-C) 안에 포함 되어 있습니다. 예상 했던 대로, 형광 광학 사사 기증자 쥐에서 TA 근육의 횡단면, GFP (그림 2D)를 표현 하지 않습니다 그들은 때문에 녹색 형광 표시 되지 않습니다. 반면, 기증자 조직으로 이식 하지 호스트 마우스에서 TA 근육의 횡단면 섬유 익스프레스 GFP (그림 2E)으로 따 근육 섬유에 균일 한 녹색 형광 표시. MIME에 의해 기증자 근육 조직으로 이식 하는 근육의 횡단면에서 호스트 근육 섬유 (GFP +)와 기증자 근육 섬유 (GFP-) 사이 경계 설정의 선이 있다. 그림 2D-F 에 표시 된 시각 필드의 위상 대비 이미지 그림 2E제공 됩니다 '-F' 고 근육 섬유는 지역에는 실제로 아무 GFP는 신호입니다.

14 일 후 MIME 및 BaCl2 주입, 직렬 크로스 섹션의 TA 근육 남아 있는 레이블 없음 또는 desmin (그림 3)에 항 체와 함께 표시를 공부 함으로써 우리가 배울 GFP 신호에 모든 근육 섬유에 의해 표현 된다는 호스트 마우스에서 하지만 (빨간색 desmin 라벨 감지 가능한 근육 섬유) MIME 처리 근육 치료 근육. MIME 및 BaCl2 주입으로 치료 호스트 따 근육에 기증자 세포 유래 myogenesis 감지 GFP 신호를 보여 주는 많은 desmin(+) 근육 섬유의 존재에서 분명 하다 (그림 3C-D, 3 C' -D'). 호스트 및 기증자 조직적 셀의 가능성이 융합에서 발생 하는 공상 근육 섬유는 GFP 형광이이 섬유에 의해 전시의 적당 한 수준 낮은 의해 감지할 수 있습니다. 수많은 공상 섬유 기증자 SCs는 호스트 근육의 epimysium 내에서 미크론의 몇몇 수백을 마이그레이션할 수 있는 제안 따 근육의 전체 직경에 걸쳐 나타납니다. GFP + 섬유의 정량 그림 3E에 표시 됩니다. 그림 4 는 전체 MIME + BaCl2 치료 따 근육의 직렬 횡단면의 고배율 이미지를 보여준다.

그림 1 . 단계에 최소한 침략 적 근육 포함 (MIME) 관련된.
MIME은 전신 마 취하에 수행 됩니다. 그것은 벨 솔루션에 기증자 (기증자 마우스 EDL)의 ~ 10 mg을 배치 하 고 (A)그것의 끝에 지도 봉합 매 포함. 18-게이지 바늘 호스트 근육 (B) 의 긴 축을 통해 전달 되 고 기증자 조직 바늘 트랙 (C)를통해 그려집니다. 기증자 조직 호스트 근육 (D)에 포함 된 왼쪽, 지도 봉합은, 자르고 바늘 구멍 조직 접착제로 밀봉 된다 (E). Sealed 바늘 상처 화살표 (F)표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 . 연구 조교 근육의 MIME 후 3 일.
호스트 근육 수집 MIME; 후 3 일 참고 호스트 TA (화살표;에 바늘 자국 A-B)입니다. 데이터는 임베디드 기증자 마우스 EDL 따 근육 격실 (B-C) 내에서 누렸다는 확인 합니다. TA 근육 횡단면 표시 야생-타입 따 근육 (D)에 있는 아무 녹색 형광, 밝은 녹색 형광 NSG GFP 따 근육 (E), 그리고 호스트와 기증자 간의 구별 3 일 NSG GFP 따 근육에 근육의 형광 이미지 -MIME ((F)입니다). D'-f에서 D f에서 시각 필드의 위상 대비 이미지 표시 됩니다 ', 각각. F와 F 패널에 레드 라인 ' 호스트 및 기증자 조직 사이 경계 설정의 라인을 보여줍니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 . 연구 조교 근육의 MIME 후 14 일.
데이터 수집 후 MIME 제시는 14 일. Desmin의 immunofluorescent 라벨에서 빨간색 신호는 (desmin에 대 한 긍정적인 신호를 myofibers는 가능한 나타냅니다), 파란색 신호 (얼룩 핵), DAPI에서 이며 녹색 신호는 GFP에서. 제어 따 근육 (오른쪽 hindlimb) 예상 대로 호스트 마우스에서 수확, 거의 모든 myofibers는 desmin,이 myofibers는 가능한 제안 (A; 빨간 신호)에 대 한 긍정적 이다. 또한, DAPI 얼룩을 바탕으로, 그것은 분명 그 myonuclei 거의 모든 myofibers의 건강 한 근육 (A; 푸른 신호)에서 예상 되는 것으로, 주변 위치 하 고 있습니다. 컨트롤 따 근육의 직렬 섹션 표시 거의 모든 근육 섬유는 GFP에 대 한 긍정적 다는 것을 암시 하는 밝은 녹색. MIME + BaCl2 -TA 근육 (왼쪽된 hindlimb), 치료 기증자 세포 중재 myogenesis 없음 감지 GFP 형광을 나타내는 많은 desmin(+) 근육 섬유의 존재에서 분명 하다 (C D, C'-D'). 낮은 중간 GFP 형광 (공상 근육 섬유)에 Desmin(+) 근육 섬유는 MIME 따 근육의 epimysium 내에서 마이그레이션할 수 있는 홍보 SCs 기증자를 제공, 제안 전체 따 근육의 직경에 걸쳐 존재 기증자 세포 유래 myogenesis입니다. A'-D' A. 에 파란색 상자 내의 영역의 고배율 이미지 GFP(+) 섬유 및 중앙 nucleated 섬유의 정량 E에 표시 됩니다. 바 규모 = 100 µ m (A-D)와 50 µ m (A'-D'). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

rc="/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg" / >
그림 4 . 광범위 한 피해와 재생의 증거 MIME 및 BaCl2 주입 후 14 일.
높은 확대, 전체 MIME + BaCl2 치료 따 근육의 직렬 횡단면 표시 됩니다. 데이터 표시는 많은 근육 섬유는 온건 하 게 또는 강하게 GFP +가 위치한 핵 (A-B; 레드 a에서 신호 desmin에서, A에서 파란 신호, DAPI에서 이며 b에서 녹색 신호는 GFP에서). 이 데이터는 것이 좋습니다 그 변성 및 재생 후 BaCl2 주입이 GFP 식 영향을 주지 않습니다. 이러한 맥락에서 MIME + BaCl2 치료 따 근육, 아니 작은 GFP 식, 중앙 nucleated 근육 섬유의 존재 제안 이러한 섬유는 myogenesis (또는 재생)의 가능성이 결과에서 상당한 기여를 GFP-조직적 셀입니다. 이러한 관측 더 높은 확대 이미지의 선택 된 필드 (C F;에서 확인하실 수 있습니다. C와 D, 그리고 E와 F, 각각, 직렬 횡단면;에서 지역 겹치며 그 지역에서에서의 위치를 나타내는 이미지 테두리의 색 구분 및 B). 바 규모 = 100 µ m (A-B)와 50 µ m (C-F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.