이 프로토콜은 non-adherent / mesenchymal 유방 상피 세포에서 세포 외 소포 (EVs) / 엑소 좀을 정화, 정량화 및 특성화하고 유선 형성능을 내유성 상피 세포로 전달하는 방법을 설명합니다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은이 세포 특성을 EVs / 엑소 좀을 섭취하는 세포로 전달할 수있다.
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방법 논문
extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전
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이 논문에서
요약
초록
세포는 단백질, 지질 및 핵산을 포함하는 ~ 100-nm 세포 외 소포 (EVs) 인 엑소 좀을 통해 전달할 수 있습니다. Non-adherent / mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC) 유래 세포 외 소포는 차별적 인 초 원심 분리를 통해 NAMEC 배지에서 분리 할 수 있습니다. 밀도에 따라 EV는 110,000 x g에서 초 원심 분리를 통해 정제 할 수 있습니다. 초 원심 분리로 얻은 EV 준비물은 가용성 단백질에 의한 오염을 방지하기 위해 연속 밀도 구배를 사용하여 더욱 분리 할 수 있습니다. 그런 다음 정화 된 EVs는 나노 입자 추적 분석을 사용하여 추가로 평가할 수 있으며, 이는 준비 과정에서 소포의 크기와 수를 측정합니다. 50 내지 150 nm 범위의 세포 외 소포가 엑소 좀이다. NAMEC에서 추출한 EVs / exosomes는 유선 상피 세포에서 섭취 할 수 있는데, 이는 유동 세포 계측법과 공 촛점 현미경으로 측정 할 수 있습니다. 일부 유방 줄기 세포 특성 ( 예 : 유선 형성 능력)은줄기 모양의 NAMEC에서 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀을 통해 유방 상피 세포로 전달 될 수있다. 격리 된 일차 성 EpCAM hi / CD49f lo 내시경 상피 세포는 마우스 지방 패드에 이식 된 후 유방 땀샘을 형성 할 수 없으며, EpCAM lo / CD49f hi 기저 유방 상피 세포는 이식 후 유방 땀샘을 형성합니다. EpCAM hi / CD49f lo luminal mammary 상피 세포에 의한 NAMEC 유래 EVs / 엑소 좀의 섭취는 지방 패드에 이식 된 후 유방 땀샘을 생성하게한다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은 유방 내 형성 능력을 EpCAM hi / CD49f lo 내강 유방 상피 세포로 전달한다.
서론
Exosomes는 막과 세포질 단백질, 지질 및 RNA를 세포간에 전달하여 세포 간 통신을 매개 할 수 있습니다 1 . Exosome-mediated communication은 많은 생리 학적 및 병리학 적 과정 ( 즉, 항원 제시, 내성 2 의 발달 및 종양 진행 3 )에 관여하는 것으로 입증되었습니다. 엑소 좀은 종종 그것들을 방출하는 원천 세포와 비슷한 내용을 가지고있다. 따라서, exosomes은 소스 세포에서 특정 세포 속성을 수행하고 4 그들을 섭취 세포 에이 특성을 전송할 수 있습니다.
Exosomes는 50 ~ 150 nm의 이중층 멤브레인 베 시클이며 특정 마커 ( 예 : CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix 및 TSG101)를 나타냅니다. 따라서, 엑소 좀은 다양한 측면에 대한 다양한 방법으로 특징 지어 져야한다. 투과 전자 현미경으로 막 소포를 시각화 할 수 있습니다.엑소 좀 4 , 5 와 같은 나노 ....
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프로토콜
동물과 관련된 모든 연구는 동물 관리위원회 (Institutional Animal Care Committee)가 승인 한 의정서를 준수했습니다.
1. 세포 외 소포 / 엑소 좀 격리 및 검증
- 문화 유방 상피 기저 세포, NAMECs, 500 mL의 MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL의 중탄산 나트륨 (0.2438 %)을 함유 한 DMEM / F12로 제조 된 신선한 무 혈청 배지; EGF (5 ng / mL); hydrocoritisone (0.5 μg / mL); 인슐린 (5 μg / mL); 소 뇌하수체 추출물 (BPE; 35㎍ / mL); 및 GW627368X (1 μg / mL)를 15 cm 접시에 넣었다.
- hemocytometer로 세포를 계산 후 4 일 동안 0 일째에 15cm dish 당 12mL의 배지에 1.2x10 6 세포를 사육한다.
- 배양 4 일 후 탁상용 원심 분리기를 사용하여 300 xg에서 5 분간 원심 분리한다. 상등액을 원추형 튜브 ( 그림 1 )로 옮긴다.
- 상등액을 원심 분리한다.탁상용 원심 분리기에서 2,000 xg에서 20 분간. 뜨는 원심 분리기 튜브....
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결과
PGE 2 / EP 4 신호 전달을 막음으로써 유방 기초 형 줄기 세포 4 에서 EV / 엑소 좀 방출을 유발한다는 것이 보여지기 때문에,이 연구는 유방 상피 기저 세포 (NAMEC) 배양으로부터 유도 된 EVs / 엑소 좀을 분리하는 방법을 제시한다. NAMEC은 혈청이없는 배지에서 배양되기 때문에 혈청에서 유래 된 EV / 엑소 좀은 존재하지 않는다. 혈청 함유 배지에서 배양 된 세포의 경우, 배지의 선재 exosomes는 EVs / exosomes 5 의 수집을위한 소스 세포를 배양하기 위해 배지가 사용되기 전에 110,000 xg에서 초 원심 분리에 의해 미리 세척되어야합니다. 4 일 유도 된 NAMEC 조건화 배지의 EVs / 엑소 좀은 그림 1 에서와 같이 차동 초 원심 분리에 의해.......
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토론
엑소 좀은 종종 그것들을 방출 한 세포의 특성을 가지고 있으며 방출 된 엑소 좀의 양은 자극 4 에 의해 유도 될 수있다. 세포의 배양 배지를 수집하여 EV / exosome 수집을위한 차동 초 원심 분리 (differential centrifuge)에 적용 할 수 있습니다 ( 그림 1 ). 현재 EVs / exosomes를 분리하는 이상적인 방법에 대한 일반적인 합의는 없다. 여기에서 사용 된 최적의 방법은 다운 스트림 어플리케이션 (14) 에 의해 결정된다. 초 원심 분리는 EVs / exosomes의 생물학적 활성을 보존 할 수있는 EVs / exosomes의 분리를위한 상대적으로 빠른 방법입니다. 그러나, 초 원심 분리에 의해 분리 된 소포는 일반적으로 엔도 솜 구획을 통해 생성 된 엑소 좀 및 / 또는 세포막으로부터 새싹을 통해 생성 된 소포를 함유하는 EVs의 혼합물을 함유한다........
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 국립 보건 연구원 (05A1-CSPP16-014, HJL)과 과학 기술부 (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL)의 연구비 지원에 의해 뒷받침되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K 초원심분리기 | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti 로터 | Beckman | 342204 | |
| SW41 로터 | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | 나노사이트 LM10 | 나노 입자 추적 분석(NTA) |
| 옵티프렙 | Sigma-Aldrich | D1556 | 물에 담긴 요오드딕산올 60%(w/v) 용액(멸균). |
| CD81 항체 | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 ° C, 하룻밤 |
| CD9 항체 | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 ° C, 하룻밤 |
| CD63 항체 | Abcam | Ab59479 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 ° C, 하룻밤 |
| TSG101 항체 | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 in 5% w/v nonfat dry milk, 1x TBS, 0.1% Tween 20 at 4 ° C, 하룻밤 |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 in 5% w/v 무지방 분유, 1x TBS, 0.1% 트윈 20 at 4 ° C, 하룻밤 |
| CFSE (카르복시플루오레세인 숙시니미딜 디아세테이트 에스테르) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | 형광 세포 분석기 | |
| 콜라겐분해효소 IV형; | Thermo | 17104019 | |
| 트립신 | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | 은 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스퍼린, 그리고 나트륨 셀레나이트 |
| 아큐타제의 | ebioscience | 00-4555-56 | 은 프로테올릴리틱 및 콜라겐 분해 효소 활성이 분산된 천연 효소 혼합물 |
| 입니다. | STEMCELL | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anti-CD49f 항체 | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM 항체 | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | cell sorter | |
| carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| human mammary epithelial cells (HMLE cells, NAMECs) | 로버트 와인버그 박사의 선물 | ||
| permount | 써모 피셔 사이언티픽 | SP15-500 | |
| 중탄산나트륨 | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritisone | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| 인슐린 | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (소 뇌하수체 추출물) | Hammod Cell Tech | 1078-뉴질랜드 | |
| GW627368X | 케이맨 | 10009162 | |
| 15cm 문화 접시 | Falcon | ||
| 탁상용 원심분리기 | Eppendrof | 원심분리기 3415R | |
| 초원심분리기 튜브 | Beckman | 344058 | |
| PBS(인산염 완충 식염수) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA 단백질 분석 | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| 투과 전자 현미경 | Hitachi | HT7700 | |
| 젤라틴 | STEMCELL | 7903 | |
| 10cm 배양 접시 | Falcon | ||
| 6-웰 배양 접시 | Corning | 3516 | |
| 암컷 C57BL/6 마우스 | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| FBS (Fetal Bovine Serum) | BioWest | S01520 | |
| 겐타마이신 | 써모 피셔 사이언티픽 | ||
| 펜/스트렙 | 코닝 | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| 이소플루오란 | 할로카본 | NPC12164-002-25 | |
| 포름알데히드 | 마크론 | H121-08 | |
| EtOH (에탄올) | J.T. 베이커 | 800605 | |
| 빙하 아세트산 | Panreac | 131008.1611 | |
| 알루미늄 칼륨 황산염 | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylene | 라이카 | 3803665 | |
| 0.22 μ m 멤브레인 | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP 상처 클립, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP 상처 클립 Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ 딥 레드 | 써모 피셔 사이언티픽 | C10046 | 원형질막 염색 |
참고문헌
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
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