방법 논문

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

DOI:

10.3791/55738

⸱

2017년 6월 1일

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 기능적 미토콘드리아 전자 수송 사슬 복합체 (Cx) IV와 그 복합체 (supercomplexes)의 분리를 기술하여 네이티브 전기 영동을 사용하여 어셈블리 및 구조에 대한 정보를 나타냅니다. 네이티브 젤은 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔 (in-gel) 분석법, 전기 분해 (electroelution)로 정제하여 개별 복합체를 추가로 특성 분석 할 수 있습니다.

초록

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미토콘드리아 전자 수송 사슬 (ETC)은 다양한 연료의 분해로 인해 생성 된 에너지를 세포의 ATP 인 생물 에너지로 변환시킵니다. ETC는 respirasomes (CI, C-III, C-IV) 및 전자 전달 및 ATP 생산의 효율성을 증가시키는 synthasomes (CV)라고 불리는 supercomplexes로 조립되는 5 개의 거대한 단백질 복합체로 구성됩니다. ETC 기능을 측정하기 위해 50 년 이상 다양한 방법이 사용되었지만 이러한 프로토콜은 개별 복합체와 수퍼 콤플렉스의 조립에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 이 프로토콜은 ETC 복잡한 구조를 연구하기 위해 20 년 이상 전에 수정 된 방법 인 고유 겔 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE) 기술을 설명합니다. 네이티브 전기 영동으로 ETC 복합체를 활성 형태로 분리 할 수 ​​있으며,이 복합체는 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔화 분석 (IGA) 및 전기 분해로 정제 할 수 있습니다. 다시 조합하여네이티브 젤 PAGE와 다른 미토콘드리아 분석 결과를 비교해 보면 ETC 활동, 동적 인 조립 및 분해, 그리고 이것이 미토콘드리아 구조와 기능을 어떻게 조절하는지에 대한 완성도를 얻을 수 있습니다. 이 작품은 또한 이러한 기술의 한계를 논의 할 것입니다. 요약하면, 네이티브 PAGE 기술은 면역 블로 팅, IGA, 전기 분해가 뒤 따르는 것으로 미토콘드리아 ETC 수퍼 콤플렉스의 기능과 구성을 조사하는 강력한 방법입니다.

서론

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ATP 형태의 미토콘드리아 에너지는 세포 생존에 필수적 일뿐만 아니라 세포 사멸의 조절에도 필수적이다. 산화 적 인산화에 의한 ATP의 생성에는 기능적 전자 전달 사슬 (ETC, Cx-1 내지 IV) 및 미토콘드리아 ATP 신타 제 (Cx-V)가 필요하다. 최근의 연구에 따르면 이러한 큰 단백질 복합체는 respirasomes 및 synthasomes 1 , 2 라고 불리는 수퍼 콤플렉스로 구성되어 있습니다. 이러한 대규모 단지와 수퍼 콤플렉스의 조립, 역학 및 활동 규제를 분석하는 것은 어려운 일입니다. 분광 광도계를 사용하여 수행 한 산소 전극 및 효소 분석으로 얻은 산소 소비 측정은 ETC 복합체 활성에 대한 유용한 정보를 제공 할 수 있지만이 분석법은 관련된 단백질 복합체 또는 수퍼 콤플렉스의 존재, 크기 및 하위 구성에 관한 정보를 제공 할 수 없습니다. 그러나, 청색 및 투명한 천연 (BN 및 CN) PAGE 3 은 복잡한 구성 및 조립 / 해체에 대한 중요한 정보와 생리 및 병리학 적 조건 하에서 이들 중요한 호흡 복합체의 초분자 조직의 동적 조절에 대한 강력한 도구를 창출했습니다.

이러한 복합체를 고차 수퍼 콤플렉스로 조립하면 미토콘드리아 구조와 기능을 조절하는 것으로 보인다 5 . 예를 들어 respirasome assembly는 전자 이동의 효율과 미토콘드리아 내부 막을 가로 지른 양성자 원동력의 생성을 증가시킵니다 5 . 또한, synthasomes의 조립은 ATP 생산의 효율과 세포질 2 로의 에너지 등가물의 전달을 증가시킬뿐만 아니라 미토콘드리아 내부 막을 관상의 cristae 6 로 몰드시킨다 </ sup> 7 . 마우스 배아에서 심장 발달 중 supercomplex assembly에 대한 연구는 심장에서 Cx-I- 함유 supercomplexes의 생성이 대략 배아 일 13.5 8 에서 시작한다는 것을 보여준다. 다른 사람들은 노화 또는 허혈 / 재관류 손상으로 인해 Cx-I- 함유 수퍼 콤플렉스의 양이 심장에서 감소하거나 신경 퇴행성 질환의 진행에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여주었습니다 11 .

이 프로토콜은 ETC 복합체 및 supercomplexes의 조립 및 활동을 조사하는 데 사용할 수있는 원시 젤 페이지에 대한 방법을 설명합니다. 미토콘드리아 supercomplexes의 대략 분자량은 CN 또는 BN polyacrylamide 젤에 단백질 복합체를 분리하여 평가할 수 있습니다. CN PAGE는 또한 겔에서 직접적으로 모든 미토콘드리아 복합체의 효소 활성을 시각화합니다 (in-gel assay;IGA) 12 . 이 연구는 IGA를 통해 NADH를 산화시키는 Cx-I의 능력과 IGA에 의한 Cx-V의 ATP 가수 분해 활성으로 인한 신타 소솜의 존재를 강조함으로써 호흡기 활동을 입증합니다. Cx-I 및 Cx-V를 함유 한 복합체 및 수퍼 콤플렉스는 또한 단백질을 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고 면역 블로 팅을 수행함으로써 입증 될 수있다. 이 방법의 장점은 일반적으로 BN 또는 CN PAGE가 생리 학적 크기 및 조성을 기반으로 단백질 복합체를 분리한다는 점입니다. 멤브레인으로의 전달은 이러한 밴드 패턴을 보존합니다. BN 또는 CN PAGE에서 단백질 복합체를 분석하는 것은 2D-PAGE (Fiala 등 13 참조) 또는 자당 밀도 원심 분리 14 , 15 를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 특정 밴드를 추가로 분석하기 위해 BN PAGE에서 추출 할 수 있으며이 단백질 복합체의 단백질을 정제 할 수 있습니다d. 네이티브 전기 분해는 몇 시간 내에 수행 될 수 있는데, 이것은 겔로부터 주변 완충액으로의 단백질의 수동 확산 (참조 문헌 16에서 사용 된 바와 같이)에 상당한 차이를 만들 수있다.

요약하면, 이들 방법은 미토콘드리아 막으로부터의 고 분자량 수퍼 콤플렉스의 추가 특성 결정을 가능하게하는 몇 가지 접근법을 기술한다.

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프로토콜

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모든 실험은 C57BL / 6N 마우스 (야생형)의 심장을 사용하여 수행 하였다. 쥐는 자궁 경부 전위 이전에 이산화탄소로 마취되었고, 모든 절차는 로체스터 대학의 실험실 동물 의학부에 따라 주법, 연방 법령 및 NIH 정책에 따라 엄격하게 수행되었다. 의정서는 로체스터 대학 동물 동물 보호 및 사용위원회 (동물 자원위원회)의 승인을 받았습니다.

1. CN 및 BN 페이지

참고 : BN 및 CN PAGE에 사용되는 모든 장비는 세제가 없어야합니다. 이것을 보장하기 위해 모든 장비를 0.1M 염산으로 씻은 다음 탈 이온화 된 H 2 O로 광범위하게 헹구십시오.

  1. 예비
    1. 4 ° C에서 25 MM imidazole, pH 7.0으로 구성된 양극 완충액을 준비하십시오. 4 ° C에서 보관하십시오.
    2. CN 또는 BN PAGE 용 음극 완충액을 준비하십시오.
      1. CN PAGE의 경우 7.5 mM imidazole과 50 mM tricine을 사용하십시오. 1 리터의 완충액에 sodium deoxycholate 0.5g과 lauryl maltoside 0.2g을 넣는다. 4 ° C에서 7.0으로 pH를 조정하고 4 ° C에서 보관하십시오.
      2. BN PAGE의 경우, 7.5 mM imidazole과 50 mM tricine을 사용하고 4 ℃에서 7.0으로 pH를 조정한다. 4 ° C에서 보관하십시오.
      3. 하늘색 BN 음극 완충액의 경우, 7.5 mM imidazole과 50 mM tricine을 사용하십시오. 4 ° C에서 7.0으로 pH를 조정하고 완충액 1 리터당 20 mg의 쿠마시를 첨가한다. 4 ° C에서 보관하십시오.
    3. 50 MM NaCl, 50 MM 이미 다졸, 2 MM aminocaproic 산성 및 1 MM EDTA로 추출 버퍼 (EB)를 준비합니다. 4 ° C에서 7.0으로 pH를 조정하고 4 ° C에서 보관하십시오.
    4. 75 MM 이미 다졸과 1.5 M 아미노 카프로 산과 함께 3X 젤 버퍼 (BN 및 CN 젤에 사용)를 준비합니다. 4 ° C에서 7.0으로 pH를 조정하고 4 ° C에서 보관하십시오.
    5. 0.01g의 Ponceau S, 5g의 글리세롤, 5mL의 H 2 O 로딩 완충액 (LB)을 준비하십시오.온도.
    6. 500 mM 6- 아미노 헥산 산 1 mL에 50 mg의 쿠마시를 첨가하여 쿠마시 블루를 준비한다. 4 ° C에서 7.0으로 pH를 조정하고 4 ° C에서 보관하십시오.
    7. H 2 O에서 20 mM과 200 mM 라 우릴 말 토 시드를 준비한다. 분량을 200 μL로하여 냉동 보관한다. 사용하기 전에 세제를 해동하십시오.
3 % ~ 8 % (미니) 4 % ~ 10 % (맥시)
0.5 젤 (밝은) 0.5 젤 (무거운) 0.5 젤 (밝은) 0.5 젤 (무거운)
AAB (mL) 0.42 1.3 2.5 7.7
CN / BN 완충액 (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H2O (mL) 2.7 1.4 14 6.3
글리세롤 (g) 0 0.47 0 2.5
부피 (mL) 4.72 4.77 25 세 25 세
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

표 1 : 미니 또는 맥시 (Maxi-PAGE) 1 개를 주입 할 때 필요한 성분의 양. 이 표에 사용 된 부피는 1 최소 또는 최대 맥 1 겔, 1.5 mm 두께로 계산됩니다. AAB의 부피는 40 % 저장 용액을 기준으로합니다. 가볍고 무거운 것이 집중자를 가리킨다.AAB의 이온. 그라디언트 믹서의 각 컬럼을 AAB 용액으로 채운 후에 APS 및 TEMED를 첨가한다.

  1. 쏟아져 흐르는 젤
    참고 : CN 또는 BN 젤에 3-8 % 또는 4-10 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 (AAB) 그라디언트를 각각 사용하십시오. 표 1 은 미니 젤 (폭 85mm x 높이 73mm x 두께 1.5mm) 또는 맥시 겔 (160mm) 용으로 사용 된 완충액, AAB, H 2 O, 글리세롤, 암모늄 퍼 술 페이트 (APS) 및 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED) 폭 x 높이 200 mm x 두께 1.5 mm). CN 또는 BN 겔을 사용한 유리판 어셈블리는 1x 젤 버퍼가 몇 mL 인 백에서 냉장 보관하거나 저장 용 1x 겔 버퍼로 적신 페이퍼 타월로 싸서 보관할 수 있습니다. 젤은 최대 일주일 동안 사용하기에 안정적입니다.
    1. 겔을 부어 넣으려면 겔이 중력에 의해 준비된 젤 챔버로 흐를 수 있도록 상승 된 교반 판에 그라디언트 믹서를 놓습니다.
    2. 그라디언트 믹서의 유출 챔버를 4.77 / 25 mL로 채우십시오 (미니 / 맥시) (AAB의 농도가 더 높음).
    3. 가볍고 가벼운 챔버 사이의 스톱 코크 연결부를 부드럽게 열고 한 방울의 용액이 다른 쪽을 통과하도록하십시오.
      참고 : 이것은 연결 튜브와 스톱 콕에서 공기 방울을 밀어내어 두 챔버 사이의 흐름을 막습니다. 동등한 압력으로 버블이 움직이는 것을 막을 수 있기 때문에 양측이 이미 채워져 있다면이를 수행 할 수 없습니다.
    4. 그라디언트 믹서의 다른 챔버를 4.72 / 25 mL (mini / maxi)의 가벼운 용액으로 채 웁니다.
    5. 무거운 솔루션과 유출 챔버에 저어 막대를 놓고 감동 시작. 버블 링을 일으키지 않는 교반 막대 속도를 사용하십시오.
    6. 각 chamber에 APS와 TEMED를 신속하게 첨가하여 중합을 시작하십시오.
    7. 그라디언트 믹서의 두 챔버 사이의 연결을 열고 유출 챔버를 열기 전에 젤을 부어 수 초 동안 혼합을 허용하십시오.
      참고 : Gravity wi두 챔버 모두 똑같이 배수하고, 무거운 용액에 빛을 혼합하면 아크릴 아마이드 밀도가 겔의 바닥에서 상단으로 서서히 감소합니다. 그라디언트 믹서에있는 전체 내용물을 사용하여 젤을 부으십시오.
      1. 마지막에 조심스럽게 빗을 넣고 거품과 섞임을 피하기 위해 겔을 넣으십시오.
    8. 즉시 에탄올로 그라디언트 믹서를 씻어 젤을 헹구십시오. 물로 헹구고 두 번째 젤을 부으십시오. 겔을 중합 시키십시오 (보통 mini-gel에는 20 분 미만이 필요합니다).
    9. 젤을 실행하려면 전극 어셈블리 클램프에 장착하고 중앙 또는 상부 챔버를 CN 또는 연한 파란색 BN 음극 완충액으로 채 웁니다. 외부 / 하부 챔버에 양극 버퍼를 추가하기 전에 누출 여부를 확인하기 위해 몇 분 기다립니다.
      1. 부드럽게 잘 빗을 꺼내 주사기 또는 피펫을 사용하여 음극 버퍼와 우물을 씻으십시오.
      2. 차가운 방 (4 ° C)에서 젤을 실행하거나 완전히 얼음으로 포장.
        1. CN 미니 페이지의 경우 처음 1 시간 동안 100V를 사용하고 완료 될 때까지 200V를 사용합니다. 일반적으로 추가로 1-1.5 시간이 소요됩니다. 또는 CN 미니 페이지를 30-40 V에서 밤새 실행하십시오.
          참고 : 여기서는 고 분자량 단백질 복합체에 중점을두고 있으므로 분자량이 140 kDa 미만인 단백질 복합체가 젤을 모두 소모합니다. 저 분자량 복합체를 유지하기 위해 전기 영동을위한보다 짧은 운전 시간을 사용할 수 있습니다.
        2. BN 맥시 - 페이지 (BN maxi-PAGE)의 경우, 100V를 사용하고 밤새 (약 18 시간) 젤을 흐르게하십시오.
          참고 : 전류가 매우 낮아 (<15mA), 이러한 조건을 처리 할 수있는 전원 공급 장치가 필요합니다. 이 시점에서 젤은 IGA 또는 면역 블로 팅에 사용할 수 있습니다. 경우에 따라 전기 분해를 위해 유리판에 면도날을 사용하여 밴드 또는 레인을 젤에서 잘라낼 수 있습니다.
  2. 샘플 준비
    참고 : 멤브레인 바인딩 된 mitochondrial supercomplexes는에서 추출해야합니다내부 미토콘드리아 막. 미토콘드리아 supercomplexes을 보존하기 위하여는, 신선한 격리 한 mitochondria 또는 동결되고 해빙 된 견본을 한 번만 사용하십시오. 아래의 계산 / 부피는 미니 젤 (1.5 ㎜ 두께의 겔에서 10 웰 빗의 웰은 35-40 μL까지 유지) 및 맥시 겔 (15 웰 빗의 웰은 200 μL). 또한, 각 시료의 분량 (보통 10 μL)을 저장하여 로딩 제어로서 전압 의존성 음이온 채널 (VDAC)을 검출하기위한 변성 SDS 겔에서 작동시킵니다.
    1. 4 ℃에서 10-15 분 동안 17,000 xg에서 원심 분리하고 마이크로 튜브에 분리 된 미토콘드리아 또는 조직 균질 액을 적절한 양 ( 예 : 미니 젤의 경우 10-50 μg 및 맥시 - 젤의 경우 50 - 200 μg)에 놓습니다.
      참고 :이 단계는 일부 가용성 mitochondrial 매트릭스 및 / 또는 cytosolic 단백질을 제거합니다.
    2. 흡인하고 뜨는 버리고 원하는 양의 추출 버퍼를 추가하십시오젤에로드합니다. 부드럽게 얼음에 침전물을 다시 일시 중지하십시오. 원할 경우이 시점에서 일반적인 프로테아제 억제제 혼합물을 첨가하십시오.
      참고 : 여기에 사용 된 장비를 기준으로 mini-gel에는 30 μL를, maxi-gel에는 100 μL를 사용하여 단백질 / 완충 용액 비율을 완충 용액 1 μL에 대해 2 μg 이하로 제한했습니다.
    3. 세제를 첨가하십시오 ( 예 : 2 μg의 라 우릴 말 토 시드 / 1 μg의 단백질; 자세한 정보는 대표 결과 및 토론 참조).
      참고 : 일반적으로 라 우릴 말 토 시드가 사용되지만 digitonin도 사용할 수 있습니다.
    4. 얼음 위에서 20 분 동안 품어 낸다. 처음에는 가볍게 혼합하고 가끔 배양 중에 튜브를 가라 앉히거나 교반합니다.
    5. 4에서 10 분 동안 17,000 XG에서 원심 분리기 ° C 모든 막과 조직 조각을 제거합니다.
    6. 상층 액을 새 튜브로 옮긴다. CN 샘플의 경우 10 μL의 샘플 볼륨마다 1 μL의 LB를 첨가하십시오. 샘플의 총 볼륨은 app이어야합니다.미니 젤의 경우 약 40 μL, 맥시 겔의 경우 130 μL입니다. BN 샘플의 경우 염료와 세제의 비율이 1 : 4 (w / w)가되도록 샘플에 쿠마시를 넣으십시오.
    7. 샘플을 최소 또는 최대 겔의 웰에 각각 30 및 120 μL 씩 넣으십시오. 로딩 컨트롤로 VDAC를 검출하기 위해 변성 SDS 겔에 대한 각 샘플에서 나머지 10 μL를 사용하십시오.
    8. 분자량 마커를 준비하려면 BN / CN 젤 완충액 60 μL에 고 분자량 보정 믹스 (자세한 내용은 표 참조) 1 병을 용해시키고 120 μL의 H 2 0 및 20 μL LB. 1 차선 당 15 μL를로드하십시오.
    9. 단계 1.2.9.2에서 설명한대로 젤을 실행하십시오.

2. Cx-I 및 Cx-V에 대한 In-gel 분석

참고 : 분석은 실온에서 수행됩니다. 문서화를 위해 개발중인 밴드의 사진, 스캔 또는 이미지를 촬영하십시오. (중요) 단백질은 전송할 수 없습니다o IGA를 완료 한 후 니트로 셀룰로스 멤브레인.

  1. Cx-1 분석
    1. 예비.
      1. pH 7.4의 H 2 O에 5mM Tris의 분석 완충액을 준비한다. 상온에서 보관하십시오.
      2. 1 mL의 분석 완충액에 10 mg의 NADH를 녹인다. 사용하기 전까지 -20 μC에서 100 μL 분취 량으로 보관하십시오. 동결과 해동을 피하십시오.
      3. 마이크로 튜브에 Nitroblue tetrazolium 25 mg을 달아보십시오.
      4. 95 mL의 H2O에 5 mL의 아세트산을 희석하여 고정액을 준비한다; 상온에서 보관하십시오.
    2. 분석 수행.
      1. Nitroblue tetrazolium 25mg (최종 농도 : 2.5mg / mL)과 10mg / mL NADH (0.1mg / mL) 100μL와 함께 분석 완충액 10mL를 합칩니다. 이것을 CN 젤에서 절제 한 전체 겔, 차선 또는 관심 영역에 첨가하십시오.
        참고 :이 작업은 투명 플라스틱 또는 유리 용기에서 수행 할 수 있습니다. BN PAGE 후에는이 분석을 수행 할 수 없습니다.
      2. 3 분 이상 부드러운 교반 (로커) 후 파란색 띠의 발달을 따라하십시오.
      3. 겔을 아세트산 용액 10 - 20 mL에 넣거나 5 mM Tris, pH 7.4로 씻어서 반응을 멈춘다. 문서화를 위해 사진을 찍으십시오 (재료 표 참조).
  2. Cx-V 분석
    참고 : Cx-V 분석은 중복 CN 또는 BN 젤을 사용하여 수행해야하며, Cx-V- 독립적 활동을 입증하기 위해 5 μg / mL oligomycin (Cx-V 억제제)과 함께 배양합니다.
    1. 예비.
      1. 35 MM 트리스와 270 MM 글리신과 분석 버퍼를 준비; 실온에서 pH를 8.3으로 조정한다. 완충액을 50mL 분량으로 냉동 보관하십시오. 그러나 동결 및 해동 후 pH를 확인하십시오.
      2. H 2 O 중 1M MgSO 4 를 준비한다. 사용하기 전까지 4 ° C에서 보관하십시오.
      3. Pb (NO 3 ) 2 27.28mg을 마이크로 튜브에 넣습니다.
      4. ATP 60mg을 마이크로 튜브에 넣습니다.
      5. 1 mg의 o를 용해시킨다.1 mL의 에탄올에 용해시켰다. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 보관하십시오.
      6. 50 mL의 메탄올과 50 mL의 H2O를 혼합하여 고정액을 준비한다; 상온에서 보관하십시오.
    2. 분석 수행.
      1. 분석 버퍼 ± 5 μg / ML oligomycin 10-20 ML에 부드러운 교반 (로커)와 2 시간 BN 또는 CN 젤에서 관심의 겔, 차선, 또는 관심 영역을 품어 (50-100 μL 1 MG / mL)을 실온에서 첨가 하였다.
      2. 배양 후 버퍼를 14 mL의 새로운 분석 완충액으로 교체하고 1 M MgSO 4 (14 mM) 190 μL, Pb (NO 3 ) 2 (5 mM) 27.28 mg, ATP 60 mg 8 mM) 및 올리고 마이신 75 μL (필요한 경우).
      3. oligomycin으로 처리 한 젤의 밴드가 Cx-V 의존성이 아닌 밴드를 제공하므로 부드러운 교반 (로커)으로 품어두고 흰색 침전물을 관찰합니다.
        참고 : 침전물의 모양은 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
      4. 겔을 메탄올 -( 예 : 50 % 메탄올), 산성 용액이 납 침전물을 녹일 것이기 때문이다. 결과를 사진으로 찍으십시오.
        참고 : 납 침전물은 겔의 쿠마시 염색을 방해하지 않습니다.

3. Nitrocellulose 또는 Polyvinylidene Difluoride (PVDF) 멤브레인으로 단백질 전달

  1. 25 MM 트리스와 200 밀리그램 글리신의 전송 버퍼를 준비합니다. pH를 8.3으로 조정하고 0.0005 g / L SDS와 200 mL / L 메탄올을 첨가한다. 실내 온도에 보관하십시오.
    1. 면도날이나 가위로 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 막 (기공 크기 : 0.45 μm)을 젤 크기보다 약간 큰 크기로 자릅니다.
      참고 : 니트로 셀룰로오스 멤브레인은 Ponceau S 염색이 단백질 로딩을 평가하는 반면 PVDF 멤브레인은보다 명확하게 정의 된 밴드를 산출합니다.
  2. 실험 계획안.
    1. 니트로 셀룰로오스 막, 여과지 및 스폰지를전송 버퍼에서 최소 10 분. PVDF 막을 15 초 동안 100 % 메탄올에 넣거나 전달 버퍼에 넣기 전에 제조업체의 권장 사항에 따라 배치하십시오. 트랜스퍼 버퍼가있는 평평한 그릇에 트랜스퍼 키트의 오픈 카세트를 놓습니다.
    2. 카세트의 뒷면에 스폰지와 1-2 개의 여과지를 놓습니다. 거품을 제거하십시오.
    3. 젤을 여과지 위에 놓습니다. 겔 및 / 또는 멤브레인의 모서리 부분을 클리핑하여 겔의 방향을 나타냅니다.
    4. 멤브레인을 젤 위에 올려 놓습니다. 모든 거품을 제거하십시오.
    5. 멤브레인 위에 필터 종이와 스폰지를 놓습니다. 이 샌드위치에있는 모든 거품을 제거하십시오.
    6. 카세트를 닫고 전송 키트의 카세트 홀더에 넣으십시오.
    7. 단백질을 25V에서 약 12-18 시간 동안 옮긴다.

4. 면역 블로 팅

  1. 예비.
    1. Ponceau Stain (500 mL)에 25 mL의 아세트산 및 0.5 g의 폰 소우 S를 475 mL의 H2O에 첨가하고; 실온에서 보관하십시오 (재사용 가능).
    2. 200 MM NaCl, 25 MM 트리스 -베이스, 및 2.7 MM KCl와 Tris - 버퍼 식염수 (TBS)를 준비합니다. pH를 8.0으로 조정하고 실온에서 보관하십시오.
    3. TBS에 0.5 mL / L Tween 20을 첨가하여 TBS-tween (TBST)을 준비하십시오. 상온에서 보관하십시오.
    4. TBST 100 mL에 5 g의 고형 우유를 녹여서 우유 고형분 / TBST를 준비한다. 4 ° C에서 보관하고 3 일 이내에 사용하십시오.
    5. 3 g의 소 혈청 알부민 (BSA, 분획물 V)을 TBST 100 mL에 녹여 BSA / TBST를 준비한다. 4 ° C에서 보관하고 3 일 이내에 사용하십시오.
  2. 실험 계획안.
    1. 전송이 완료되면, 모든 전송 된 단백질을 시각화하기 위해 Ponceau S 솔루션에 막을 놓습니다. 멤브레인의 마커 위치를 연필로 표시하고 Ponceau-S-stained membrane을 사진 또는 스캔으로 기록합니다.
    2. 각 10 분 동안 멤브레인을 3 번 씻으십시오.TBS를 부드럽게 흔들어 준다.
    3. 멤브레인을 우유 고형물 / TBST로 상온에서 1 ~ 2 시간 동안 또는 온화한 교반하에 차가운 방에서 밤새 차단하십시오.
    4. 완만하게 교반하면서 TBST로 10 분 동안 막을 씻으십시오.
    5. 온화한 교반하에 차가운 방에서 밤새 일차 항체와 함께 품어 라. BSA / TBST에서 항체 ( 예 : 1 : 1,000의 항 ATP5A 및 -NDUFB6)를 희석하십시오.
      참고 : 대부분의 항체는 하룻밤 배양하면 원래 젤의 막에 더 좋은 신호를줍니다.
    6. 완만하게 교반하면서 TBST로 10 분 동안 막을 씻으십시오.
    7. 상온에서 최소한 60 분 동안 2 차 항체와 함께 항온 처리한다. 우유 고형물 / TBST로 항체 (1 : 5,000에서 1 : 50,000)를 희석하십시오.
    8. TBST로 부드럽게 교반하면서 상온에서 10 분 동안 3 번 멤브레인을 씻으십시오.
    9. 마지막 세척하는 동안, manufa의 지시에 따라 향상된 chemoluminescence (ECL) 기판을 준비cturer.
    10. 제조 업체가 제공 한 지침을 사용하여 ECL 기판과 멤브레인을 품어.
    11. ECL 기판 제조업체가 제공 한 지침을 사용하여 필름의 신호를 감지합니다.

5. 전기 분해

  1. 예비.
    1. 25 mM tricine, 3.75 mM 이미 다졸 (pH 7.0, 4 ℃) 및 5 mM 6- 아미노 헥산 산의 용출 완충액을 준비한다.
      참고 : 외부 단백질 오염을 방지하기 위해 전기 장비와 멤브레인 캡을 취급하는 동안 항상 장갑을 착용하십시오.
  2. 네이티브 electroelution에 대한 electroeluter를 사용하기 전날에 다음을 수행하십시오.
    1. 60 ° C에서 1 시간 동안 용리 완충액에 멤브레인 캡 (컷오프 : 3.5 kDa)을 담급니다. 새 용출 완충액으로 뚜껑을 옮기고 냉장고에 12 시간 이상 담근다.
      참고 : 3.5 kDa의 컷 - 오프 분자량은 작은 p의 손실을 방지한다관심있는 단백질 복합체에서 쉽게 해리 될 수있는 로틴 (roteins).
    2. 전기 분해기 모듈, 유리 튜브, 탱크 및 뚜껑을 에탄올로 완전히 씻으십시오. 물로 헹구고 장비를 말리십시오.
  3. 기본 전기 분해의 날에 다음을 수행하십시오.
    1. 사용할 각 유리 튜브의 바닥 (프 로스트)에 프릿을 놓습니다. 필요한 경우 유리 튜브를 용리 완충액에 넣고 프릿을 튜브의 안쪽에서 아래쪽으로 밀어 넣습니다.
    2. 유리 재 튜브가있는 유리 튜브를 전기 에너지 모듈에 밀어 넣으십시오. 용출 완충액으로 그로밋을 적신 다음 유리관을 제자리로 밀어 넣으십시오. 유리 튜브의 윗부분이 그로밋과 평평한 지 확인하십시오.
    3. 스토퍼로 빈 그로밋을 닫습니다.
    4. 실리콘 어댑터 바닥에 젖은 멤브레인 캡을 놓고 어댑터를 용리 완충액으로 채 웁니다. 어댑터의 버퍼를 천천히 피펫 팅하여 투석막 주위의 기포를 제거하십시오.
    5. 버퍼 채워진 어댑터를 유리 튜브의 바닥에 밀어 넣으십시오. 유리 튜브 안의 유리에 나타나는 모든 거품을 제거하십시오.
    6. 용리 완충액으로 각 유리관을 채 웁니다.
    7. BN PAGE의 절취 된 밴드를 유리 튜브에 넣으십시오 (1.2.9.3 단계 참조). 큰 조각을 작은 조각으로 자릅니다. 유리 튜브 내의 충전 높이가 약 1cm인지 확인하십시오.
    8. 전체 모듈을 탱크에 넣으십시오.
    9. 약 600 mL의 차가운 용리 완충액을 탱크에 첨가한다. 투석 막에 거품이 생기지 않도록 실리콘 어댑터 캡이 버퍼에 있는지 확인하십시오.
    10. 탱크 하단에 저어 막대를 놓습니다.
      참고 : 교반하면 거품이 투석 막 바닥에 달라 붙지 않습니다.
    11. 콜드 룸에서 350 V에서 4 시간 동안 단백질을 용출시킨다.
    12. 용리가 완료된 후 완충액 탱크에서 전기 에너지 모듈을 꺼내 싱크대 또는 보울에 넣으십시오.
    13. 마개가 사용 된 경우에는 마개를 사용하여 드라상부 버퍼 챔버에서. 그렇지 않으면 큰 피펫을 사용하여 버퍼를 제거하십시오.
    14. 각 유리 튜브에서 버퍼를 제거하고 버립니다. 실리콘 어댑터가 제 위치에 유지되고 프릿 아래의 액체가 방해 받거나 흔들리지 않도록하십시오.
    15. 조심스럽게 유리 어댑터의 바닥에서 멤브레인 캡과 함께 실리콘 어댑터를 제거합니다. 마이크로 튜브에 실리콘 캡의 내용물 (약 400 μL)을 채 웁니다. 용리 완충액 200 μL를 추가로 실리콘 뚜껑을 헹구고 마이크로 튜브에 추가하십시오. 모든 유리 튜브에 대해 반복합니다.
    16. 멤브레인 캡을 재사용 할 수 있으므로 0.5 mg / mL sodium azide가 포함 된 용리 완충액에 멤브레인 캡을 보관하여 보존하십시오. 그들을 냉각하십시오.
      참고 : 용리액은 단백질 농도가 낮으며 원심 분리 필터 장치를 사용하여 농축 할 수 있습니다.

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결과

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미토콘드리아 supercomplexes를 시각화하기 위해 쥐에서 새로 격리 mitochondria가 사용되었다 17 , 18 . Mitochondrial supercomplexes는 일부 연구자들에게는 용인 될 수 있지만, 분해 및 해동의 반복주기에 민감합니다. 보관을 위해 동결이 필요한 경우 최상의 결과를 얻으려면 샘플을 한 번 이상 동결 및 해동하지 않아야합니다.

미토콘드리아 ETC 복합체를 BN PAGE로 시각화하기 위해 분리 된 심장 미토콘드리아의 단백질 100 μg을 4-10 % 젤에 로딩했다 ( 그림 1A ). 로딩 및 음극 완충액의 쿠마시 스테인은 실행 중 단백질 복합체를 표지하기에 충분합니...

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토론

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기능적 ETC는 미토콘드리아 ATP 생성에 필요합니다. ETC의 복합체는 respirasomes (Cx-I, -III 및 -IV) 1 과 신타 소솜 (Cx-V) 2의 두 가지 유형의 수퍼 콤플렉스를 형성 할 수 있습니다. ETC를 supercomplexes로 편성하는 것은 전반적인 ETC 효율성을 증가시키는 것으로 생각되는 반면, 각 복합체의 조립은 손상되지 않은 ETC에 필요하다. 이러한 수퍼 콤플렉스가 어떻게 조립 및 분해되는지는 잘 알려져 있지 않지만 여기에 제시된 프로토콜은 이러한 프로세스를 더 잘 이해할 수 있습니다.

ETC 어셈블리 연구의 주요 과제는 이러한 단백질 복합체의 크기입니다. 예를 들어, 미토콘드리아 호흡기는 Cx-I (약 880 kDa)와 하나 이상의 Cx-III 분자 (460 kDa) 및 Cx-IV (200 kDa, 이량 체로 활성)로 구성되어 분자와의 복합체를 형성...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 미국 심장 학회 설립자 제휴사 (12GRNT12060233)와 로체스터 대학의 Strong Children 's Research Center의 연구비 지원으로 이루어졌습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Protean II 미니 젤 챔버Biorad1658004미니 젤 전기 영동을 붓고 실행하는 전체 세트
Protean XL 맥시 젤Biorad1653189맥시 젤 전기 영
디언트 메이커, Hoefer SG15 VWR95044-704붓는 미니 젤 그라디언
메이커, 맥시 젤VWRGM-100붓는 맥시 젤 그래디언트
전사 키트Biorad1703930멤브레인으로 단백질을 습식으로 이송하는 전체 세트
Electroeluter 모델 422Biorad1652976천연 또는 SDS PAGES에서 단백질의 전기 용출
유리판 Biorad1653308Short plates
유리판Biorad1653312스페이서 플레이트
유리판Biorad1651823내부 플레이트
유리 플레이트Biorad1651824외부 플레이트
전원 공급 장치Biorad1645070기본 전기영동에 적합한 전원 공급 장치
ECL-Western Thermo Scientific32209Chemolumniscense 기질
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075Enhanced chemolumniscense 기질
필름/자가방사선 촬영 필름GE 헬스케어28906845웨스턴 블롯 문서화
필름 프로세서 CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 CanonNA젤, 멤브레인 및 블롯을 문서화하기 위해 사진을 찍습니다.
Canon Power Shot 640 카메라 후드 가벼운 테이블에서 사진을 찍을 수 있는Canon
아크릴아미드/비아크릴아미드Biorad161014840% 사전 혼합 용액
글리신시그마G7403
SDS(도데실황산나트륨)인비트로젠15525-017
트리스 베이스시그마T1503버퍼
트리신시그마T0377
소듐데옥시킬레이트시그마D66750세제
EDTA시그마E5134
수크로오스시그마S9378
MOPS시그마M1254버퍼
이미다졸시그마I15513버퍼
라우릴 말토시드시그마D4641세제
Coomassie G250Biorad161-0406
아미노헥산산시그마O7260
네이티브  분자량 키트GE 헬스케어 17-0445-01네이티브 전기영동을 위한 고분자량 교정 키트.
NameCompany카탈로그 번호Comments
NADHSigmaN4505
Nitroblue 테트라졸륨SigmaN6639
Tris HClSigmaT3253
ATP   SigmaA2383
NameCompany카탈로그 번호Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2):Sigma228621
올리고마이신SigmaO4876
이름Company카탈로그 번호코멘트
Ponceau SSigmaP3504
Abcamab14748항체 ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6Abcamab110244Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC 항체Calbiochem529534VDAC
ECL HRP 연계 항체GE Health CareNA931VATP5A, NDUFB6 및 VDAC 차단 시약에 대한 2차 항체
Biorad170-6404
BSA
염화나트륨SigmaS9888
염화칼SigmaP9541
EGTASigmaE3889
NameCompany카탈로그 번호Comments
Silver staining KitInvitrogenLC6070
동 그라트 차폐 카메라륨

참고문헌

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