잠재적 인 세포질 대체 요법을위한 골수 간엽 줄기 세포로부터의 혈장 막 소포의 제조

요약

연령 관련 질환은 세포질 구성 요소의 여러 결함과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 골수 간엽 줄기 세포에서 플라즈마 막 소포를 준비하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기법은 연령 관련 phenotypes을 개선하거나 심지어 심지어 세포질 대체 요법의 수단으로 잠재적으로 사용할 수 있습니다.

초록

우리는 이전에 포유류 세포의 기계적 압출을 통한 원형질막 소포 (PMVs)의 생성에 대해보고했다. 미토콘드리아 결핍 Rho0 세포와 PMVs의 융합은 정상적인 배양 조건 하에서 유사 분열 활성을 회복시켰다. 죽상 동맥 경화증, 제 2 형 당뇨병, 알츠하이머 병 및 암은 다양한 세포 유형의 세포질 및 세포 소기관에서 여러 가지 기계적 및 기능적 결함과 관련이 있다고보고 된 연령 관련 질환입니다. 골수 간엽 줄기 세포 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)는 다 기능성을 유지하면서자가 재생 능력을 보유한 골수에서 유래 된 독특한 세포 집단을 대표합니다. PMVs의 융합을 통한자가 BMSCs로부터의 어린 세포질을 가진 노화 세포의 보충은 노화와 연관된 표현형을 개선하거나 심지어 역전시키는 유망한 접근법을 제공한다. 이 프로토콜은 압출을 통해 BMSC에서 PMV를 준비하는 방법을 설명합니다.1, 공극, 미토콘드리아의 존재를 결정하고 공 촛점 현미경을 사용하여 PMV 내의 막 전위의 유지를 검사하고, 원심 분리에 의해 PMV를 농축하고 생쥐의 비복근 내로 PMV의 생체 내 주입을 수행한다.

서론

유전자, 효소 및 세포 대체 요법에 대한 접근법을 수립하는데 엄청난 노력이 기울여왔다. 이것은 획기적인 발전을 가져 왔고 심지어 임상 적용 ^{1 , 2 , 3을} 가져 왔습니다. 최근 핵 전달 기술에 기반을 둔 논란이되고있는 미토콘드리아 보충 요법이 ​​노년기 여성 또는 치명적인 mitochondrial DNA 돌연변이를 가지고있는 체외 수정에 적용되었습니다. 아테롬성 동맥 경화증, 2 형 당뇨병, 알츠하이머 병 및 암을 포함한 연령 관련 질환에서 발견되는 결함은 대개 다각적입니다. 지질 방울의 축적이 문서화되어있다. 아밀로이드 단백질의 침전; 소포체에서 전개되지 않은 단백질의 유지; autophagosome, mitochondria가 이들 질병의 발달 또는 악화에 기여한다."xref"> 5 ^{, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . 현재, 노화 및 노화 표현형을 일으키는 세포질 및 세포 기관에서의 오작동의 직접적인 개선을 목표로하는 이용 가능한 메커니즘이 없다.

우리는 이전에 포유 동물 세포의 기계적 압출을 통해 플라즈마 막 소포 (PMVs)의 생성에 대해보고했습니다 ¹² . 핵을 제외하고는 미토콘드리아와 같은 세포 소기관뿐만 아니라 단백질과 RNA를 비롯한 막 또는 세포질의 구성 요소가 PMV에서 발견되었습니다. 본질적으로, PMV는 소형 핵 세포로 간주 될 수 있습니다. 더 중요한 것은, 미토콘드리아 결핍 Rho0 세포와 PMVs의 융합은 정상적인 문화 조건 하에서 mitotic 활동을 복원했다. 이것은 첫 번째 보고서입니다.세포질 대체 요법을위한 잠재적으로 효율적인 접근 방법을 제시하고있다.

골수 간엽 줄기 세포 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)는 골수에서 일상적으로 생성되는 다 분화 선조 세포 (multipotent progenitor cell)이며 배양 물에서 쉽게 확장됩니다. 배아 줄기 세포 마커 Oct4, Nanog 및 SOX2는 MSCs ¹³ 에서 낮은 수준으로 검출되었다. 텔로 머라 아제 활성도 측정 가능합니다. 또한 MSC에서의 낮은 HLA Class I 발현뿐만 아니라 공동 자극 분자 및 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 II 분자의 부재는 동종 이성체 또는 "기성품 인"사용에 이상적인 세포로 작용합니다. 재생 의학 및 면역 조절 응용 ¹⁴ .

여기, 우리는 3 μm의 공극을 가진 폴리 카보 네이트 멤브레인을 통해 압출을 통해 마우스 BMSC에서 PMV를 준비하는 방법, 미토콘드리아의 존재를 결정하는 방법 및 PMV에서 멤브레인 잠재력의 유지를 검사하는 방법을 설명합니다.현미경 검사법으로 원심 분리에 의해 응축 된 PMV가 아닌 농축 된 PMV를 준비하고 PMV를 생쥐의 비복근 내로 주입합니다.

프로토콜

8-12 주된 BALB / c 마우스는 Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, China)에서 구입하여 특정 병원균이없고 공기가없는 동물 시설에서 자랐습니다. 동물 관리 및 실험 절차는 산 터우 대학 (Shantou University)에 의해 설립 된 실험용 동물의 사용 및 관리에 대한 지침을 준수했습니다.

1. 장치의 조립

1. 무균 상태를 유지하려면 사용하기 전에 30 분 동안 조직 배양 후드의 자외선을 켭니다.
2. 일회용 25 mm 필터 유닛의 나사를 풀고 캡과 장치의 바닥을 75 % 에탄올이 채워진 200 mL 유리 컵에 30 분간 담근다. 의료용 폴리 프로필렌으로 만들어졌습니다.
3. 포셉을 사용하여 장치의 뚜껑과 바닥을 잡고 남은 에탄올을 손으로 털어 내고 부품을 후드에서 10 분 동안 공기 건조시킵니다.
4. PBS에 19mm 폴리 카보네이트 멤브레인을 적신 다음 조심스럽게 보토의지지 매트릭스 위에 올려 놓습니다m입니다. 고분자 필름은 매끄럽고 평평한 표면을 가지고 있으며 3 μm의 공극을 트랙 에칭했습니다.
5. 캡을 바닥에 단단히 조여서 장치를 다시 조립하십시오. 멤브레인이 중앙에서 빠지지 않았는지 확인하십시오.
6. 1 ML 인슐린 주사기의 바늘을 제거하고 PBS 1 ML을 그립니다. 주사기를 필터 장치에 연결 한 다음 PBS를 장치에 밀어 넣어 어셈블리를 적시고 누출이 있는지 테스트하십시오.

2. 플라즈마 막 소포 (PMVs)의 생성

1. Nemeth et al. 에 의해보고 된대로 BMSC 문화를 확립 하십시오. ¹⁵ , 15 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 DMEM 배양 배지에서 배양 하였다. 37 ° C에서 5 % CO ₂ 가 포함 된 humidified 인큐베이터에서 6 잘 접시에있는 세포를 육성.
2. 세포를 증식시키기 위해 배양 배지를 제거하고 칼슘이없는 PBS 0.5 mL로 잘 헹구십시오.
3. 0.25 % 트립신 - EDTA 0.5 ML을 추가하고 37에서 세포를 품어 ° C3 분 동안. 손바닥에 대해 접시를 몇 번 두드려 세포 분리를 촉진하십시오. 배양액 1 mL를 넣어 소화를 멈춘다.
4. 벤치 상단 원심 분리기에서 2 분 200 XG 15 ML 원뿔 튜브와 회전에서 세포를 수집합니다. 배지 4 ML에 세포를 Resuspend하고 6 - 웰 플레이트의 두 우물에 세포를 나누어지는.
   참고 : 세포는 대개 24 시간 내에 합류합니다.
5. PMVs를 생성하기 위해 트립신 소화에 의해 6-well plate의 한 well (약 5 x 10 ⁵ cell)에서 세포를 수확하고 0.5 mL의 배양 배지에서 monodisperse시킨다.
6. 인슐린 주사기에 세포를 넣고 필터 장치에 연결 한 다음 플런저를 빠르게 밀어 필터를 통과하는 세포를 쥐어 짜십시오. 내부에 몇 개의 PMV 만 있어야하기 때문에 압출 된 매체를 버립니다.
7. 주사기에 추가로 0.5 mL의 배지를 넣고 신속하게 필터를 통과시킵니다. 포함 된 두 번째 압출 매체 수집다양한 크기의 PMV.
8. 수집 된 매체 150 μL를 35 mm 유리 바닥 접시에 넣고 PMV를 약 10 분 동안 바닥에 고정시킵니다. 20X 대물 렌즈를 사용하여 CCD 카메라가 장착 된 역상 위상차 현미경으로 PMV를 검사합니다.

3. 공 촛점 현미경을 이용한 PMV 내의 내용물 검사

1. BMSC에서 트랜 스펙 션을 수행하려면 50 μL의 무 혈청 DMEM에 2 μg의 supercoiled plasmid DNA와 6 μL의 양이온 transfection reagent ( 예 : PolyJet)를 희석하십시오. 소용돌이가 잘 섞이고 튜브의 측면에서 모든 액체를 수집하기 위해 잠시 회전합니다.
2. 희석 된 DNA 용액에 희석 된 용액 (단계 3.1에서)을 적가하고, 1 분 동안 강하게 와동시키고, 짧게 회전시키고, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션한다.
3. 하룻밤 동안 약 30 %의 농도로 배양 된 BMSC의 새 배지를 2 mL의 새로운 배양 배지로 교체하고 DN형질 전환 혼합물을 적가합니다.
4. 형질 감염 12 시간 후 신선한 매체 2 ML로 바꿉니다.
5. 세포질로 현지화 된 단백질을 추적하려면 위에 설명한대로 EGFP 발현 카세트 (pEGFP-N1)를 포함하는 플라스미드로 세포를 형질 감염시킵니다. 위에서 설명한대로 PMV 생성에 대한 transfection 48 시간 후 트립신 소화에 의해 세포를 수확.
6. 미토콘드리아를 추적하려면 37 ° C에서 30 분 동안 신선한 배지에서 미토콘드리아 염료 (1 μM, MitoTracker)로 세포를 염색하십시오.
7. 미토콘드리아의 막 전위를 검출하기 위해, 시아닌 염료 JC-1 (5,5 ', 6,6'- 테트라 클로로 -1,1', 3,3'- 테트라 에틸 벤즈 미미 - 다 졸릴 카르 보시 아닌 요오드화물) (10 μg / ML) 37 ° C에서 30 분 신선한 배지에서.
   1. 위에서 설명한대로 PBS 0.5 ML의 세 번 세포를 씻어 후 PMV 생성에 대한 트립신 소화에 의해 세포를 수확.
   2. 150 μL의 수집 된 med로드ium을 35mm 유리 바닥 접시에 넣고 PMV를 약 10 분 동안 바닥에 내려 놓습니다. 100X 오일 객관적인 렌즈를 사용하여 공 촛점 현미경하에 PMVs를 검사하십시오.
8. EGFP 또는 미토콘드리아 염료를 검출하려면 488 nm 레이저를 켜고 505-530 nm에서 신호를 수집하십시오. JC-1을 감지하려면 488nm 및 543nm 레이저를 켜고 505-530nm 및 560-615nm에서 신호를 수집합니다. 핀홀 값을 약 1.4로 설정하십시오.

4. 원심 분리에 의한 농축 된 PMV의 제조

1. 트립신 소화에 의해 세포를 수확하고 위에서 설명한대로 PMVs를 0.5 ML 문화 매체에 생성합니다.
2. 상온에서 5 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 1,200 xg로 PMV를 돌립니다. 조심스럽게 상등액을 기음과 부드러운 소용돌이와 문화 매체의 100 μL에 펠렛을 resuspend.
3. 35mm 유리 바닥 접시에 50 μL의 PMV를로드하고 약 10 분 동안 실온에서 안정되게하십시오. PMV 검사40X 오일 대물 렌즈를 사용하는 공 촛점 현미경 하에서.
4. 1 시간 동안 BMSC 배양 물에 일련의 희석 된 폴리에틸렌 이민 (PEI) 용액을 첨가하고 세포 독성의 징후를 확인하십시오.
   참고 : BMSC에서 독성의 징후가 발견되지 않았으므로 여기서 2 μg / mL의 PEI를 선택했습니다.
5. 트립신 소화하여 세포를 수확하고 응집을 방지하는 수단으로 세포막을 충전 1 H 2 μg / ML에 PEI를 추가합니다. 위에서 설명한대로 0.5 ML 문화 매체에서 PMVs를 생성합니다. 위에서 설명한대로 PMV를 집중시키고 공 촛점 현미경으로 검사하십시오.

5. 비복근 근육에 PMV 주사

1. 막을 염색하기 위해 30 분 동안 BMSCs에 신선한 문화 매체 1 ML에 CM - DiI (chloromethyl dialkyl - indocarbocyanine) (10 μm의) 염료를 추가합니다.
2. 트립신 소화에 의해 세포 (약 5 x 10 ⁵ )를 수확하고 배양 배지 0.5 mL에 그들을 재현 탁한다. PEI (2 μg / mL)를 1h. 위에 설명한대로 PMV를 생성하고 100 μL의 배지에 집중시킵니다.
3. 12 시간의 금식 후 sodium barbital (10 mg / kg)을 주사하여 BALB / c 마우스를 마취시킨다.
4. 75 % 에탄올로 위의 근육의 외부를 청소하십시오. 천천히 30 G 인슐린 주사기를 사용하여 비복근 근육에 PMV (100 μL)를 주입합니다.
5. 마취를 시행 한 후, 실험 기간 동안 눈 위에 젖은 거즈를 놓고 마우스가 깨어날 때까지 백열등으로 따뜻하게합니다. 개별 환기 케이지에 마우스를 홀로 두십시오.
6. 수술 12 시간 후 gastrocnemius 근육을 수확하려면 경추 탈구로 마우스를 죽이십시오.
7. gastrocnemius 근육 위에 75 % 에탄올을 뿌리고, 가위로 피부를 열고 양끝에서 전체 gastrocnemius 근육을 잘라내십시오.
8. PBS로 근육을 헹구고 20X 객관적인 렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 검사하십시오.
9. 근육을 손질해라.날카로운 면도날로 형광이없는 부분을 제거합니다. 약 9mm ^3의 입방체로 강한 붉은 색 형광으로 부품을 자릅니다.
10. 최적의 절삭 온도 매체 (OCT)에 각 큐브를 삽입하고 5 분 동안 액체 질소에 담그고 -20 ° C의 냉동고에 보관하십시오.
11. 냉동 섹션을 저온 유지 장치를 사용하여 20 μm 두께로 자르고 각 섹션을 유리 슬라이드에 부착하십시오. PBS로 절편을 한 번 헹굽니다.
12. 얼룩 원형 펜으로 섹션 주위에 원을 그려 DAPI (1 μg / ML) 100 μL를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 10 분 잠복 후 DAPI 솔루션을 대기음과 PBS로 세 번 씻어.
13. 시험편 위에 오일을 떨어 뜨리고, 유리 슬립으로 덮고 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하십시오. 100X 오일 객관적인 렌즈를 사용하여 공 촛점 현미경하에 섹션을 검사하십시오.
14. CM-DiI를 검출하기 위해서는 543 nm 레이저를 켜고 560-615 nm에서 신호를 수집하십시오. DAPI를 감지하려면 405를 켭니다.420-480 nm에서 신호를 수집합니다. 핀홀 값을 약 1.4로 설정하십시오.

결과

PMV의 성공적인 제조의 열쇠는 1 mL의 PBS를 멤브레인을 통과시켜 시험 할 수있는 필터 유닛 ( 그림 1 )의 정확한 조립에 크게 의존합니다. 누출이 발생하면 필터 장치를 다시 조립하고 다시 테스트하십시오. 그러나 누설은 세포가 멤브레인을 통과 할 때만 신뢰성있게 테스트 할 수 있습니다. 단지 10X 대물 렌즈를 사용하는 일반적인 현미경으로 PMV가 몇 개 발견되거나 PMV의 크기가 대부분 1μm 정도라면 부정확 한 조립으로 인해 대부분의 세포가 장치 내부에 갇히게됩니다. 직경 약 3 μm 범위의 PMV는 20X 대물 렌즈 ( 그림 2 )를 사용하여 위상차 현미경으로 검사했을 때 가장 두드러졌습니다. 나노 미터 크기의 PMV는 쉽게 시각화되지 않았기 때문에, 큰 PMV의 수에 대한 비율은 낮았다. 재빨리 주사기를 눌러서 다시 주사하는 것이 도움이되는 것으로 판명되었습니다.명백하게 구형 PMV를 형성하지 ...

토론

이 원고에서 제안된 세포질 대체 요법은 유전자, 분자 및 세포 요법과 같은 다른 보고된 접근법에 비해 고유한 이점을 가지고 있습니다. BMSC에서 생성된 PMV는 줄기 유전자의 산물뿐만 아니라 노화와 관련된 노화 표현형을 치료하는 데 필수적인 온전한 세포 소기관도 캡슐화합니다. 젊은 세포질이 노화 세포에 전달되면 오작동 메커니즘이 잠시 완화될 수 있습니다. 동시에 후성유전체를 재프로그래밍하고 활성화하여 오래 지속되는 효과를 제공할 수 있습니다. 또한, 외인성 미토콘드리아는 이전 연구¹²에서 나타난 바와 같이 증식 속도가 더 빠를 수 있습니다. 미토콘드리아 기능 장애는 많은 노화 질환과 관련이 있기 때문에 손상된 미토콘드리아의 교체는 필수적입니다¹¹. 또한, 줄기 세포와 달리 적출된 PMV는 증식할 수 없습니다. 따라서 암 발병에 대한 우려를 제기할 가능성은 거의 없습니다. 마지막으로, PMV에 핵 DNA가 부족하면 DNA 무작위 통합에 의한 게...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
IsoporeTM 막	Millipore	TSTP04700	3mm 포어
일회용 필터 유닛	Xinya, 상하이, 중국	25mm	의료용 폴리프로필렌
인슐린 주사기	BD		328446 1 mL
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
MitoTracker	분자 프로브	M7514	Green FM, 1 μ M
JC-1	Beyotime, Haimen, China	C2006	10 mg/mL
CM-DiI	Beyotime, Haimen, China	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75,000
형광 현미경	Nikon	Eclipse TE 2000	CCD 카메라
포함 Confocol 현미경	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	세포 형질 주입용