Method Article

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 세포주기의 특정 단계와 관련된 사건을 연구하기위한 배경 정보를 제공하는 두 가지 세포 동기화 프로토콜을보고합니다. 우리는이 접근법이 교란되지 않은 세포주기 또는 세포주기에 영향을 미치는 약물에 노출되었을 때 특정 유전자의 조절을 분석하는데 유용하다는 것을 보여준다.

Abstract

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세포주기의 유전자 발현 프로그램은 세포주기 의존적 과정과 암과 같은 질병에서의 그 역할을 이해하는 중요한 단계입니다. 세포주기 조절 유전자 발현 분석은 특정 단계로의 세포 동기화에 달려있다. 여기서 우리는 세포주기 동안 유전자 발현의주기적인 변이를 연구하는데 일반적으로 사용되는 두 개의 보완적인 동기화 프로토콜을 이용하는 방법을 설명한다. 두 절차 모두 하나의 정의 된 지점에서 세포주기를 일시적으로 차단하는 것에 기반합니다. Hydroxyurea (HU) 처리에 의한 동기화 프로토콜은 G1 / 초기 S 기 후반에 세포질 체포를 유도하고, HU- 매개 체포로부터의 방출은 S 및 G2 / M을 통해 균일하게 진행하는 세포 집단을 제공한다. thymidine과 nocodazole (Thy-Noc) 처리에 의한 동기화 프로토콜은 초기 유사 분열에서 세포를 차단하고 Thy-Noc에 의한 체전으로부터의 방출은 G1 기 및 S기에 적합한 동기 세포 집단을 제공한다공부 해봐. 두 절차의 적용은 일반적으로 세포의 프로피 디움 아이오다 이드 (PI) 염색 및 유동 세포 계측법 - 중재 된 DNA 함량 분석 후에 수행되는 세포주기 분포 프로파일의 모니터링을 필요로합니다. 우리는 두 가지 동기화 프로토콜의 결합 된 사용이 세포주기 ( 즉, E2F1 및 E2F7)에서 차별적으로 조절되는 유전자의 전사 프로파일을 명확하게 결정하고 결과적으로 세포주기에서 그들의 역할에 대해 더 잘 이해할 수있는 강력한 접근 방법이라는 것을 보여줍니다 프로세스. 또한,이 접근법은 세포주기 섭동에 의해서만 영향을받는 유전 독성 물질과 유전 독성 물질에 반응하는 유전자를 구별 할 수 있기 때문에 약물 기반 치료법 ​​( 즉, 항암제 인 mitomycin C)의 기초가되는 연구에 유용함을 보여줍니다 대리인에 의해 부과 된

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포주기의 모든 단계를 통한 전이는 엄격하게 조절 된 유전자 발현 프로그램과 결합됩니다. 세포주기를 통한 유전자 전사의 "온 오프"는 타이밍뿐 아니라 유전자 발현 수준을 조절하는 복잡한 전사 조절 시스템의 제어하에 있다고 믿어진다. 주요 세포주기 구성 요소의 조절 해제는 여러 질병의 발병에 기여하는 것으로 알려져 있으며 종양 형성의 확실한 특징입니다 1 , 2 . 효모 및 포유 동물 세포에서 수행 된 게놈 - 전 사체 해독 분석 결과 많은 유전자가 세포주기에서주기적인 유전자 발현 양상을 보임으로써 세포주기 동안의 전사 변동이 주어진 유전자 산물의 일시적인 필요성을 반영한다는 것을 보여 주었다 정확한 단계 3 , 4 , 5 .

세포주기 조절 유전자 발현 연구의 주요 과제는 세포주기를 특정 세포주기 단계로 동기화시키는 것입니다. 세포 동기화는 특정 세포주기 위상 전이에 대한 유전자 발현 패턴의 연관성을 해석하는 데 도움을 주며 수많은 유전자의 조절과 기능에 대한 더 나은 이해를 이끌어 냈습니다. 세포 동기화는 항암제의 작용 메커니즘을 연구하는 데에도 중요합니다. 화학 요법 제는 유전자 발현뿐만 아니라 세포주기 동역학 6,7 에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 약제를 사용한 치료로 인한 유전자 발현의 차이가 치료에 대한 직접적인 반응인지 아니면 단지 세포주기 프로파일의 변화의 결과인지 결정하는 것은 종종 어렵습니다. 이러한 가능성을 구별하기 위해, 유전자 발현은 s화학 요법 약물을 첨가하기 전에 미리 채웠다.

갓 분리 된 림프 세포 (G08에 동 기적으로 동질 된 세포 집단을 구성하는)와 같은 일부 초기 세포를 제외하면 시험관 내 확립 된 세포주는 배양 물에서 비동기 적으로 성장합니다. 정상적인 성장 조건에서 이러한 비동기 사이클링 세포는 세포주기의 모든 단계에서 발견되지만, G1 9 에서 우선적으로 발견됩니다. 따라서이 문맥은 특정 세포주기 단계 ( 예 : G1, S 등)에서 기능적 또는 유전자 발현 분석을위한 최적의 시나리오를 제공하지 않습니다. 비 형질 전환 불멸화 세포주 ( 예 : 섬유 아세포)는 소위 생리적 방법 10 과 동기화 될 수 있습니다. 이러한 방법은 사이클을 계속하기 위해 세포 접촉 억제 및 성장 인자 의존성과 같은 비 형질 전환 세포의 유지 된 일차 세포 특징에 기초한다. 제거접촉 억제와 병용 된 혈청의 혈청 농도는 G0 / G1에서 정지 된 비 형질 전환 세포를 만든다. 그러나 동기화 된 세포주기 진입 및 진행은 종종 계대 배양을 필요로하며, 이는 또한 세포의 인공적인 분리 및 재 - 도금 10을 포함 한다. 가장 중요하게는,이 방법은 세포 접촉 - 매개 성장 억제 또는 성장 인자 금기에 대한 반응이 결여 된 형질 전환 세포주, 현재 사용중인 확립 된 세포주의 대다수에 적합하지 않다. 따라서, 세포주기의 특정 단계에서 효율적인 세포 동기화를 위해 대안적인 방법이 필요하다는 것이 명백하다. 일반적으로 가장 자주 사용되는 동기화 방법은 DNA주기 또는 유사 분열 스핀들 형성과 같은 세포주기의 한 지점에 대한 일시적인 화학적 또는 약리학 적 억제를 기반으로합니다. DNA 합성의 억제는 G1 또는 늦은 S 단계에서 세포를 정지시킴으로써 세포를 동기화시킨다. 이것은 아치 일 수있다.미오신, 뉴클레오티드 생합성 저해제 11,12 , 아피 디 콜린, DNA 폴리머 라제 13,14 , 히드 록시 우레아 억제제, 리보 뉴클레오타이드 리덕 타제 저해제 15,16 또는 과량의 티미 딘 17,18과 같은 화합물의 첨가에 의해 치료 될 수있다. 한편, 콜히친이나 노코 다졸과 같은 미세 소관 중합 억제제는 초기 M 단계에서 세포 동기화를 유도하는 유사 분열 스핀들 형성을 차단할 수 있습니다 19 , 20 , 21 .

이 연구에서 우리는 mRNA에서 세포주기 조절 유전자의 발현을 연구하기 위해 일시적 화학 저해에 기초한 두 개의 보완적인 동기화 프로토콜을 포함하는 방법을 기술한다수평. 이 방법은 특정 세포주기 과정에서 세포주기 유전자의 역할을 정의하는 기본입니다. 또한 항암 치료법의 영향을 연구하여 약물 반응 유전자를 정확하게 검출하고 이러한 약물에 의해 생성 된 세포주기 진행의 혼란으로 인한 잘못된 해석을 최소화하기위한 일반적인 프레임을 제공합니다.

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Protocol

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1. 세포주기의 세포 동조, 방출 및 모니터링

  1. 유사 분열에서 U2OS 세포의 Thymidine- 및 nocodazole- 기반 (Thy-Noc) 동기화 및 방출
    1. 필요한 세포 배양 배지를 준비하십시오. U2OS 세포는 10 % (vol / vol) FBS (선택 : 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신)로 보충 된 DMEM- 글루타민 배지에서 일상적으로 성장시킨다. 멸균 조건에서 모든 배지 준비 및 조작을 수행하고 사용하기 전에 보완 된 배지 (이후부터는 "완전 배지"라고 함)를 37 ° C까지 예열하십시오.
    2. 10 ML 완전한 배양 배지에 100mm 접시 당 종자 2 X 10 6 U2OS 세포. 필요한 접시 수를 계산하려면 각 100mm 접시가 일반적으로 6- 웰 플레이트 (0.2 - 0.25 x 10 6 세포 / 웰)의 약 5 웰을 재 플레이트하기에 충분한 유사 분열 세포를 제공한다는 점을 고려하십시오 ( 그림 참조). 1B ). 선택된 시점 당 두 개의 우물이 필요합니다.실험에서 ed (RNA 추출을위한 1 웰 및 세포주기 모니터링을위한 1 웰). 또한, 단백질 분석을 위해 제 3 웰을 시간 점당 수집 할 수있다.
      참고 : 저녁 (오후 7 시경)에 세포를 배양하여 다음 날 근무 시간 중에 다음 단계를 수행 할 수 있도록하십시오. FACS 분석 보정 설정을 정의하기 위해 비동기 적으로 성장하는 세포 2 웰을 추가합니다.
    3. 37시에 100mm 요리를 잠복시킴으로써 세포를 붙이십시오. 24 시간 동안 5 % CO 2 의 가습 분위기에서.
    4. 티미 딘 블록의 경우, H 2 O (또는 동등한 양) 3 mL에 145.2 mg 티미 딘 파우더를 용해시키고 0.2 μm 기공 크기 필터를 통해 여과하여 용액을 소독하여 200 mM 티미 딘 저장 용액을 준비한다. 약간의 온난화는 티미 딘을 용해시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 각 100mm 문화 요리 (최종 농도 2 MM)에 새로 준비한 200 MM 주식의 100 μL를 추가합니다. 37에서 20 시간 동안 thymidine으로 세포를 인큐베이션한다.76 ℃, 5 % CO2의 가습 된 분위기에서의 C.
      참고 : 저녁 (약 오후 7시)에 세포를 처리하여 다음 날 티미 딘 방출과 노코 다졸 차단을 동시에 수행 할 수있는 시간을 갖도록하십시오.
    5. 티미 딘 블록에서 방출하려면 다음날 오후 3시 (3 pm)에 티미 딘 함유 성장 배지를 제거하십시오. 미리 데워진 1x PBS로 세포를 두 번 씻고 각 100mm 접시에 완전한 배지 10 mL를 첨가하십시오. 5 % CO 2 습도 분위기에서 37 ° C에서 5 시간 동안 세포를 인큐베이션하십시오.
    6. mitotic 세포 체포를 위해 50 ng / ML (오후 8시)의 최종 농도에 nocodazole를 추가하십시오. nocodazole 분말을 DMSO ( 예 : 5 mg / mL)에 녹여 -20 ° C에서 냉동 보관하여 재고 용액을 준비하십시오. 5 ~ 2 % CO 2 의 가습 분위기에서 37 ℃에서 10 ~ 11 시간 동안 노코 다졸로 세포를 부화시킨다.
    7. 초기 M 단계 (mitotic shake-off)에서의 nocodazole-mediated arrest로부터의 방출 및 여러 시간 poi에서의 시료 채취nts (오전 6 시부 터 7 시까 지).
      1. 각 플레이트를 흔들어 부드럽게 분열 (mitotic) 세포를 분리하고 부드럽게 nocodazole 함유 성장 매체를 pipetting. 50 ML 멸균 튜브, 원심 분리기 (300 XG, 5 분, 실온 (RT)) 및 원심 분리에 따라 1X PBS를 추가하여 두 번 세포를 씻어 각각의 100mm 판에서 분리 된 세포와 매체를 수집합니다. 분열 된 미끄러짐을 피하기 위해 차가운 ​​PBS 또는 PBS와 노코 다졸을 사용하는 것이 좋습니다 (토론 섹션 참조).
      2. 10 ML의 전체 매체에 각 100mm 플레이트에서 수집 된 Resuspend 유사 분열 세포. RNA 추출을 위해 2 mL, FACS 분석을 위해 2 mL를 0 시간 지점 (시료 당 약 0.2-0.25 x 106 세포) 동안 저장하십시오.
      3. 6 잘 플레이트 (2 ML / 우물, 0.2-0.25 X 10 6 세포 / 우물)의 후속 시점에 대한 남아 mitotic 세포를 다시 판.
        참고 : 선택한 시점 당 2 개의 웰이 필요합니다 (RNA의 경우 1 개, FACS 분석의 경우 1 개).
    8. 셀에서 샘플 수집측정 된 시간 지점. 세포주기 진행의 적절한 프로필을 얻기 위해 1.5 시간에서 3 시간마다 권장됩니다.
      1. RNA 추출의 경우, 배지를 제거하고 2mL의 예열 된 1x PBS로 잘 헹구고 우물에 적합한 RNA 분리 시약 ( 예 : TRIzol) 1 mL를 첨가하십시오 (화학 물질의 안전 캐비닛에서 마지막 단계 수행). 피펫 위아래로 분리하고 세포를 용해, 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 세포 lysate을 전송, RT에서 5 분 품어 추가 사용까지 ° C에서 튜브 ° C.
      2. FACS 분석을 위해 2 ML pre-warm 1x PBS로 잘 헹구고, 세포를 분리하기 위해 미리 데워진 Trypsin-EDTA 용액 (0.3 mL / well)을 첨가하고, 1 mL의 완전한 배지를 첨가하여 trypsin-EDTA를 차단하고 별도의 15 mL 튜브.
        1. 세포를 원심 분리기 (300 XG, 5 분, RT), 세포 펠렛을 저장하고 뜨는을 폐기하십시오. 세포를 고정하기 위해 부드럽게 튜브를 vortexing하여 1x PBS에 냉장 70 % (V / V) 에탄올 1 ML에 세포를 resuspend하고, 응용 프로그램에 얼음에 그들을 놓으십시오4 ℃에서 저장하기 약 15 분 전에 또는 FACS에 의한 추가 분석을위한 염색 (1.4-1.5 단계에서 기술).
  2. G1 / S 경계에서 U2OS 세포의 HU 기반 동기화 및 방출
    1. 단계 1.1에서 설명한대로 전체 세포 배양 배지를 준비합니다.
    2. 6 잘 접시 (우물 당 2 ML 완전한 배양 매체)에서 우물 당 종자 0.25 X 10 6 U2OS 세포. 실험에 필요한 우물의 수를 계산하려면 선택한 시점 당 2 개의 우물 (RNA 추출을위한 1 개의 우물 및 세포주기 모니터링을위한 1 개의 우물)이 필요하고 비동기 적으로 성장하는 세포의 2 개의 추가 우물이 FACS 분석 보정 설정을 정의하는 데 필요합니다.
    3. 37 ° C에서 6-well 플레이트를 밤새 배양하여 세포를 부착 시키십시오 (5 % CO 2 의 가습 분위기에서).
    4. 다음날 아침 웰에서 완전 배지를 제거하고 2 mL웰 당 미리 예열 된 FBS-없는 DMEM- 글루타민 배지를 첨가 하였다. 37 ° C에서 추가 24 시간 동안 세포를 인큐베이션하고 5 % CO2의 가습 분위기에서하십시오.
      참고 :이 단계는 2 (FACS 설정을 정의하기 위해 저장된 것)를 제외한 모든 웰에서 수행하십시오. 효율적인 동기화가 세포를 HU와 함께 단순히 배양함으로써 달성되면 세럼 철수 단계는 생략 될 수있다.
    5. HU로 G1 / S 세포주기 정지.
      1. 사용하기 전에 신선한 HU 스톡 용액 (500 mM)을 준비하십시오. HU 분말 76.06 mg에 H 2 O 2 mL를 넣고 완전히 용해 될 때까지 혼합한다. 0.2 μm의 공극 크기 필터를 통해 여과하여 용액을 소독하십시오. 4 MM의 최종 HU 농도에 대한 필터 멸균 HU 재고 솔루션 400 μL와 완벽한 매체 50 ML을 섞는다.
      2. FACS 설정을 정의하는 데 필요한 2 개의 우물을 제외한 모든 우물에서 배지를 제거하고 새로 준비된 4 mM HU 함유 완전 배지 (2 mL / well)로 교체하십시오.
      3. 24 시간 동안 세포를 인큐베이션한다.HU 함유 배지 (37 ℃, 5 % CO 2 의 가습 분위기).
    6. HU 매개 체포에서 세포 방출. 웰에서 HU 함유 배지를 제거하고 예열 된 1x PBS (매회 2 mL)로 웰을 2 회 헹구십시오. 웰당 완전 배지 2 mL를 첨가한다. FACS 설정을 위해 저장된 2 개의 샘플뿐만 아니라 0 시간 지점 (RNA 추출을위한 1 개와 FACS에 의한 세포주기 정지 확인을위한 1 개)을 위해 2 개의 샘플을 수집하십시오. 인큐베이터에 남아있는 웰을 놓습니다.
    7. 세포주기 진행의 적절한 분포를 얻기 위해 1.5-3 시간마다 샘플을 수집하십시오. 각 시점에서 1.1.8.1-1.1.8.2에서 설명한대로 시료 추출 (RNA 추출 및 FACS 분석 용)을 수행합니다.
  3. DNA 손상 제로 치료
    주 : 세포주기 사건에서 화합물 ( 예 : DNA 손상 인자)의 효과를 밝히는 것이 목적 일 때마다, 앞에서 설명한 동기화 방법 중 하나는유전 독성 제제로 세포를 처리하는 것과 결합된다. 동기화 방법을 선택하려면 분석하고자하는 셀주기의 위상을 고려하는 것이 중요합니다. 일반적으로, Thy-Noc 절차는 G1 단계 또는 S 단계 진입에서 화합물의 효과를 연구하는 데 적합 할 수 있지만 HU 매개 동기화는 S 단계에서 G2 단계 또는 유사 분열에 대한 영향을 연구하는 데 더 적합 할 수 있습니다.
    1. G1 위상 또는 S 위상 진입에서 유전 독성 물질의 효과 분석
      1. 1.1.2에서 설명한대로 셀을 동기화하십시오. ~ 1.1.6.
      2. 노 코다 졸 (nocodazole)에서 세포를 방출하고 1.1.7에서 설명한대로 세포를 다시 판다. 37 ℃에서 3 시간 동안 5 % CO 2 의 가습 된 분위기에서 배양하여 첨가제를 첨가하기 전에 부착시킨다 (필요한 항온 배양 기간은 세포주에 따라 다를 수 있음).
      3. 이전에 1.1.8에서 설명한대로 에이전트를 추가하고 샘플을 수집하십시오.
    2. SG에서 유전 독성 물질의 영향 분석2 단계 또는 M 진입
      1. 1.2.2에서 설명한대로 셀을 동기화하십시오. 1.2.5로
      2. 1.2.6에서 설명한대로 HU에서 세포를 방출하십시오. 즉시 상담원을 추가하십시오.
      3. 이전에 1.8에서 설명한대로 샘플을 수집합니다.
  4. propidium iodide (PI) 염색 및 FACS 분석에 의한 세포주기를 통한 세포 동기화 및 진행 모니터링
    참고 : 모든 시점에서 수집 된 샘플과 FACS 설정을 정의하는 데 필요한 샘플은 고정 된 후 4 ° C에 저장할 수 있습니다 (1.1.8.2 참조). PI 용액으로 염색을 수행 한 다음 실험의 모든 샘플을 동시에 FACS 분석합니다. PI는 600 nm 부근에서 넓은 방출 피크를 갖는 535 nm에서 여기 될 때 높은 형광 신호를 생성하는 이중 가닥 DNA의 주요 그루브로 인터 칼 레이션된다. PI는 또한 이중 가닥 RNA에 결합 할 수 있기 때문에 최적의 DNA 분해능을 위해 RNase로 세포를 처리해야합니다.
    1. 새로 만들어진 PI 염색 액을 준비하십시오. PI 저장 용액은 PI 분말을 PBS ( 예 : 5 mg / mL)에 용해시켜 제조 할 수 있습니다. 저장 용액을 4 ° C (어둠)에 보관하십시오. 염색 액은 PI (140 μM), 시트르산 나트륨 (38 mM) 및 Triton X-100 (0.01 % v / v)로 구성됩니다.
    2. 적절한 표면 ( 예 : 오븐)을 37 ° C로 예열하십시오.
    3. 원심 분리 고정 세포 (450 XG, 5 분, RT), 상층 액 (에탄올)을 따라 내고 1X PBS로 한 번 씻어.
    4. 세포를 다시 원심 분리하고 PBS를 제거하고 샘플 당 PI 염색 용액 300 μL를 추가합니다 (FACS 설정을위한 샘플 중 하나를 제외하고이 샘플에 PBS를 넣으십시오).
    5. FACS 튜브 (5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브)에 세포를 전송합니다.
    6. 37 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 샘플을 혼합하고 품어 각 샘플에 RNase A 1 μL를 추가합니다. 시료는 4 ° C에서 최대 2 ~ 3 일 동안 빛으로부터 보호하여 보관할 수 있습니다.
    7. 플로우에 의한 샘플의 DNA 함량 분석cytometry. PI로 염색 된 비동기 샘플로 FACS 분석 보정 설정을 정의합니다. PI (autofluorescence) 검사를 위해 빈 샘플 (PI 염색 용액없이)을 사용하십시오. 유동 세포 계측법에 의한 DNA 내용물의 PI 염색 - 중재 분석의 기초는 이전에 설명되어 있습니다 9 .
  5. 이중 인산 -H3 (Ser 10) / PI 염색에 의한 유사 분열 지수 측정
    참고 : 유사 분열을 진행하는 세포는 세린 10 (pH3)에서 인산화 - 히스톤 H3에 특이적인 항체로 유세포 분석기로 쉽게 검출 할 수 있습니다. 수반되는 PI 염색은 세포 집단의 DNA 함량에 근거한 분포를 결정하는데 유용합니다. FACS 설정의 최적 구성에는 5 개의 시료가 필요합니다 : blank, PI 전용, pH3 전용, 2 차 항체 만 및 이중 염색.
    1. 고정 세포 (450 XG, 5 분, 4 ° C)를 원심 분리기 및 뜨는 폐기. 15 mL 튜브에서 염색을 수행하기위한 다음 단계가 설명되어 있습니다.
    2. 1을 더하여 세포를 씻는다.펠렛 및 원심 분리기 (450 xg, 5 분, 4 ° C)에 ML PBS - T (PBS + 0.05 % 트윈 -20). 뜨는 제거하십시오.
    3. PBS-T + 3 % BSA 100-200 μL에 희석 한 항 -pH3 항체를 첨가하고 RT에서 2 시간 동안 흔들어 주면서 (4 ℃에서 O / N) 배양한다.
    4. 2 ML PBS - T (PBS + 0.05 % 트윈 -20)와 원심 분리기 (450 XG, 5 분, 4 ° C)를 추가합니다. 뜨는 제거하십시오.
    5. 펠렛에 2 ML PBS - T를 추가하여 한번 더 씻어, 원심 분리기와 뜨는을 폐기하십시오.
    6. PBS - T + 3 % BSA 100-200 μL에 희석 한 (1 : 500) 항생제 (anti-rabbit AlexaFluor 488 선택 pH3 항체의 경우)를 첨가하고 RT (또는 O / N 4 ℃에서). 빛으로부터 시료를 보호하십시오.
    7. 단계 1.5.4에서 설명한대로 원심 분리로 PBS-T (2 mL)로 두 번 씻는다.
    8. 설명 된대로 PI 염색을 수행하십시오 (1.4.1 ~ 1.4.6 단계).

2. 유전자 발현 분석을위한 샘플 수집 및 처리

  1. 갖다1.5 mL의 microcentrifuge 시료는 냉동실에서 RNA 분리 시약으로 추출하여 화학 물질에 대한 안전 캐비닛 내부의 RT에서 해동 시키십시오.
  2. 각 샘플에 400 μL의 클로로포름을 첨가하고 완전히 혼합 될 때까지 격렬히 흔들어주세요. (그러나 와동하지 마십시오). RT에서 5 분 동안 표본을 품어 낸다.
  3. benchtop microcentrifuge에서 15 분 (≥8,000 xg, 4 ° C) 동안 튜브를 원심 분리하십시오.
  4. 수성 (상) 단계를 새로운 1.5 ML microcentrifuge 튜브로 옮기고 전달 된 부피를 등록하십시오 (절차를 단순화하기 위해 실험의 모든 샘플에서 동일한 부피를 수집하는 것이 좋습니다).
  5. 혼합하면서 수성 상에 1 부피의 100 % 에탄올을 천천히 (1 방울 씩) 첨가한다. 원심 분리하지 마십시오.
  6. 상업용 RNA mini prep 키트로 다음 단계를 수행하십시오. 형성 될 수있는 침전물을 포함하여 각 시료를 최대 700 μL까지 2 mL 수집 튜브 (제조업체가 제공)의 스핀 컬럼에 피펫 팅하십시오.
  7. 닫기뚜껑과 원심 분리기 (≥8,000 g, RT)를 15 초간 씻는다. 플로우 스루를 폐기하십시오. 나머지 샘플 (있는 경우)을 사용하여 이전 단계를 반복하십시오.
  8. 다음 단계를 위해 적절한 RNA 농도를 얻기 위해 30 ~ 40 μl의 핵산 분해 효소가없는 H 2 O로 각 시료를 용리하고 RNA 세척 및 용출에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
  9. 흡광도 측정에 의한 시료의 RNA 농도와 순도를 결정하십시오 ( A 260/280 비율 2.0-2.1은 RNA 샘플의 양호한 순도를 나타냄). RT-qPCR 분석에 사용할 때까지 -80 ° C에서 RNA 샘플을 저장하십시오.
  10. cDNA 로의 RNA 전환 및 그 후의 정량적 PCR을 위해, 샘플 당 1 μg의 RNA를 취하고 제조업 자의 지시에 따라 레트로 트랜스 클리 티아 제 반응을 준비한다. 얻은 cDNA 샘플은 4 ° C (2 일간) 또는 -20 ° C (장기간) 보관할 수 있습니다.
    참고 : 실시간 PCR을위한 샘플 준비, 프라이머 디자인 및 기타 고려 사항은참고 문헌 22 , 23 .

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 동기화를위한 Thy-Noc 및 HU 기반 프로토콜의 도식적 표현.

그림 1 은 U2OS 세포 동기화 및 후속 샘플 수집에 필요한 단계를 요약하여 세포주기를 통한 진행을 확인하고 유전자 발현 분석을 수행합니다.

Phospho-H3 및 PI 염색은 동기화 방법을 선택하는 좋은 평가 변수입니다.

세포 동기화 절차는 배양 된 세포의 본질적 이질성으로 인해 각 세포주에 대해 평가되고 최적화되어야합니다. 유사 분열의 동기화는 일반적으로 Thy-Noc 프로토콜을 통해 이루어지며 노코 다졸 처리 후 유사 분열 세포의 농축은 전형적인...

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Discussion

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세포주기에서 일시적인 역할과 특정 역할에 관여하는 미세 조정 된 유전자의 분석에는 균일 한 세포 집단이 필요합니다. 많은 연구자들은 이러한 목적을 위해 오래 동안 종양 세포주를 일상적으로 사용하고 있으며 정의 된 세포주기 단계에서 가능한 한 많은 세포를 축적하려는 목적으로 동기식 (또는 부분적으로 동시적인) 세포군을 얻기위한 다양한 방법이 개발되었습니다. 더욱이, 잘 확립 된 동기화 접근법을 개선하고 최적화하기 위해 많은 노력이 기울여왔다. 그럼에도 불구하고, 모든 동기화 프로토콜에는 세포 배양의 이질성, 동기화 절차의 차선의 효율성, 또는 화학 물질 동기화 제가 세포 기능에서 갖는 이차 효과에 기인 할 수있는 결점이있다. 셀 동기화 프로토콜을 적용 할 때 이러한 제한 사항을 고려해야합니다. 연구자는 자신의 구체적인 동기화 방법을 확인해야합니다.ic 세포 유형 또는 실험. 똑같은 방법으로 다른 세포주를 재배해도 몇 가지 이유로 동기화 속도가 달라질 수 있습니다. 한편, 세포주기의 길이는 선택된 세포주에 따라 다를 수있다. 다른...

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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Zubiaga 및 Altmeyer 연구소의 구성원에게 도움이되는 토론과 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 바스크 정부 (IT634-13 및 KK-2015 / 89)와 바스크 국 UPV / EHU (바스크 정부)의 스페인 교육부 (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE) UFI11 / 20).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, 고포도당, GutaMAX 보충제Thermo Fisher Scientific61965-059
FBS, 적격, EU 승인, 남미 원산지Thermo Fisher Scientific10270-106
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0.25% 트립신-EDTA(1x), 페놀 레드Thermo Fisher Scientific25200-072
티미딘시그마T1895-5G갓 준비했습니다. 약간 따뜻하게 하면 티미딘을 녹이는 데 도움이 될 수 있습니다.
NocodazoleSIGMAM-1404DMSO의 재고 용액은 -20 º에 저장됩니다. 작은 부분 표본의 C
HydroxyureaSIGMAH8627
Streptomyces caespitosus SIGMAM42871.5 mM 스톡 용액 멸균 H2O에서 빛으로부터 보호하고 4 º에서 보관; C
디메틸 설폭사이드SIGMAD2650
프로피듐 요오드화물SIGMAP4170멸균 PBS의 저장 용액 5 mg/ml, 4 º에 보관; C는 빛으로부터 보호됩니다.
PBS pH 7.6집에서 만든
에탄올PANREACA3678,2500
클로로포름SIGMAC2432
구연산나트륨PANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAse AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol 시약LifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
고용량 cDNA 역전사 키트Thermo Fisher Scientific4368814
Anti-Cyclin E1 항체Cell Signaling41291:1000 5% 우유, o/n, 4 º에 희석; C
반대로 Cyclin B1 항체세포 신호41351:1000 5% 우유, o/n, 4 º에 있는 희석; C
Anti-β-actinSIGMAA-54411:3000 5% 우유에 희석, 1시간, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antibotyMillipore06-570프로토콜에 명시
Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 항체InvitrogenR37116프로토콜에 명시
Secondary anti-mouse-HRP 항체Santa Cruz Biotechnologysc-36975% 우유에 1:3000 희석, 1시간, RT
Forward E2F1 항체(인간)                                      TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
역 E2F1 항체 (인간)                                      CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 항체 (인간)                                      GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
역 E2F7 항체 (인간)                                      TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGAGABiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antibody (human)                                      AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioPrimerQuest 도구 (https://eu.idtdna.com/site)에 의해 설계됨
역방향 p21Cip1 항체 (인간)                                      TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP 항체 (인간) 참조 유전자                                       BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
역 TBP 항체 (인간)                                       BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L 항체 (인간) 참조 유전자    CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                                 BiolegioDesigned by PrimerQuest 도구 (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L   항체 (인간)      카카그가가트가가그타태그                               BiolegioDesigned by PrimerQuest 도구 (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR 마스터 믹스Thermo Fisher Scientific4368702
FACS 튜브 Sarstedt551578
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 mm TC-Treated Culture DishCorning
Corning Costar cell culture plates 6 wellCorning3506
Refrigerated Bench-Top MicrocentrifugeEppendorf5415 R
냉장 벤치탑 원심분리기 Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop Lite 분광 광도계Thermo ScientificND-LITE-PR
BD FACS칼리버 유세포 분석기BD Bioscience
QuantStudio 3 Real-Time PCR 시스템Thermo Fisher ScientificA28567
됨 됨

References

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