Method Article

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제 Rhipicephalus microplus 상피 직감 세포

DOI:

10.3791/55747

⸱

July 23rd, 2017

 ,  , 
1Queensland Alliance for Agriculture & Food Innovation, The University of Queensland, 2Centre for Comparative Genomics, Murdoch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rhipicephalus microplus gut tissue로부터 상피 세포를 분리하기 위해 modified density centrifugation gradient-based 방법을 사용 하였다. 표면 결합 단백질은 스트리타비딘 자성 비드를 통해 바이오 티 닐화되고 정제되어 하류 적용에서 이용되었다.

Abstract

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Rhipicephalus microplus - 가축 진드기는 여러 병원균의 벡터 인 가축에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충입니다. 진드기 장 상피 세포의 표면에 위치한 BM86과 같은 백신 후보 물질의 발견에 초점을 맞추어 유해한 영향을 줄이기위한 가축 진드기 관리에 전념했다. 현재 연구는 cDNA 및 게놈 라이브러리의 활용에 초점을 맞추고 다른 백신 후보 물질을 스크리닝합니다. 진드기 배아 세포의 분리는 진드기 배트 세포막에서 표면 단백질의 조성을 조사하는데 중요한 이점을 구성한다. 이 논문은 semi-engorged R. microplus 의 진드기 장 내용물로부터 상피 세포를 분리하기위한 새롭고 실현 가능한 방법을 구성한다 . 이 프로토콜은 TCEP와 EDTA를 사용하여 상피 세포를 상피 세포지지 조직과 불연속 밀도 원심 분리 그라데이션에서 분리합니다다른 세포 유형에서 상피 세포를 분리하는 것. FACS 또는 LC-MS / MS 분석에서 다운 스트림 응용 프로그램을 허용 streptavidin - 링크 마그네틱 비즈를 사용하여 세포 표면 단백질은 biotinylated 및 진드기 상피 세포에서 분리되었습니다.

Introduction

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Rhipicephalus microplus 는 가축 진드기 (babineiosis), 아나 플라스마 증 및 말 피토 플라스마 증 1 , 2 , 3 , 4를 매개로하여 열대 및 아열대 지역의 소 산업에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충이다. 화학 살비제의 사용과 같은 기존의 방법은 우유 및 육류의 화학적 잔류 물의 존재와 화학적 내성 진드기의 유행 증가와 같은 암시 적 단점을 가지고 있지만 해로운 진드기를 통제하기위한 노력이 해로운 영향을 줄이기 위해 노력해왔다 5 , 6 , 7 . 결과적으로, 자연 저항성 소, 생물학적 방제 (biopesticides) 및 백신의 사용과 같은 진드기 제어의 대안적인 방법의 개발이 연구되어왔다ines 4 , 5 ,

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Protocol

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1. R. microplus 의 Gut Epithelium 해부

  1. 실험 당일에 가축에서 반 엔 다당류 진드기를 수집합니다. 호스트에서 제거한 후 24 시간 이내에 진드기를 해부합니다.
  2. 92mm x 16mm 페트리 접시 바닥에 덕트 테이프를 붙입니다. 슈퍼 접착제 한 방울을 테이프에 추가하십시오. 진드기, 복부면을 슈퍼 접착제 위에 놓고 2 분 동안 건조시킵니다.
  3. 페트리 접시에 인산염 완충 식염수 (PBS) 100 ML을 부어, 또는 진드기가 완전히 잠길 때까지.
  4. 크기 11의 메스를 사용하여 눈의 꼭대기에서 진드기의 양쪽에있는 하단 꽃줄로 잘라냅니다.
  5. 살균 포셉을 사용하여 scutum 및 alloscutum을 완전히 제거하여 내부 장기를 노출시킵니다.
  6. 오염을 방지하기 위해 미세한 흰색 실 모양의 기관 (기관) 및 기타 막을 제거하십시오.
  7. 포셉을 사용하여 위 부분을 집어 넣고시체. 다른 조직이 해부되지 않도록 나머지 조직을 제거하십시오.
  8. 염화칼슘과 단백 분해 효소 칵테일 (PIC)이 포함 된 마그네슘 설페이트가없는 얼음처럼 차가운 Hank 's Balanced Salt Soluti....

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Results

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상피 세포는 R. microplus 의 장 조직으로부터 그림 1에 제시된 도식에 따라 분리되었다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 진드기 배 상피 세포의 대표적인 형광 현미경 이미지를 도 2A에 나타내었다 및 2B. 세포 격리가 semi-engorged R. microplus에서 수행됨에 따라 세포는 표본 전체에 단수 롭고 구형이며 매끄러운 표면 형태와 일정한 크기로 나타납니다. 소화관 세포 집단의 크기와 유형의 차이는 진드기가 완전히 충혈 된 성인으로 진행되면 더욱 분명해진다.

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Discussion

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가축 진드기 침입은 살 처분제 1 , 4 의 사용에 의존하는 가장 보편적 인 관리 방법과 함께 전 세계의 열대 및 아열대 지역의 소 산업에서 주요한 문제를 구성합니다. Bm86은 이전에 Bm86 지리적 인 순서 변화와 규칙적인 부스팅 4에 대한 요구 사항으로 인해 백신 전략으로서의 제한된 성공으로 R. microplus의 감염 10 에 대한 방어 항원으로 진드기 장 상피 세포 내에서 확인되었다.

상피 분리 방법론에 초점을 맞춘 이전의 간행물은 주로 척추 동물 또는 곤충류 9 , 11 , 12 ,

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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저자들은이 연구에 활용 된 Rhipicephalus microplus ticks와 Lucas Karbanowicz가 비디오 촬영에 도움을 주도록 Biosecurity Tick Colony (Queensland Agriculture & Fisheries, Australia)에 감사 드리고자합니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% Trypan BlueThermoFisher Scientific15250061
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브Eppendorf3322
100mM 탄산염 버퍼3.03 g, Na2CO3, 6.0 g NaHCO3, 1000 ml 증류수 pH 9.6
밀봉 캡이 있는 16 mL 원심분리 튜브Thermo Scientific3138-0016그래디언트 250 µ 전에 얼음으로 냉각
; M 셀 스트레이너Thermo Fisher87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) 액체 기판 시스템 ELISASigmaT04404C
30 % 과산화수소LabsceneBSPA5.500
4-20 % Tris-MOPS 젤Gen ScriptM42015
4-Chloro-1-naphthol 정제Sigma-AldrichC6788
50mL 팔콘 튜브코닝 블루30 x 115mm 스타일. 폴리프로필리엔 원추형 튜브.
70 &마이크로; M 세포 여과기BD Falcon352350
AP15 여과지MilliporeAO1504200
Biotin (Type A) Conjugation KitAbcamAb102865
해부 현미경OlympusSZX7
DP Manager 올림푸스2.2.1.195세포 이미지 소프트웨어
덕트 테이프홈 핸디맨48mm x 25mm 덕트 테이프
Dulbecco' s Modified Eagle MediumGibco11995-065DMEM - 프로토콜 EDTA
Amresco0105-500G
F96 Maxisorp Immuno PlateNunc439454
Fetal Bovine SerumSigma-Aldrich12003CFCS
형광 현미경   올림푸스 BX51
오로쉴
Dumont#9 Dumont - Switerzland
글리세롤Sigma-AldrichG5516분자생물학용 글리세롤 >99%
GlycineSigma-Aldrich410225
휴대용 카운터사무국JA0376230
행크' s Balanced Salt SolutionSigma Life SciencesH9394HBSS – 프로토콜 적혈구 계를 위한 얼음 차갑
Optik Lakor--
L-글루타티온 산화Sigma-AldrichG4376
자기 분리 스탠드Novagen-4-Tube자기 분리 랙
메탄올Sigma-Aldrich179337
Milli-Q WaterMilliporeZRXQ003WW용 일체형 정수 시스템
6648530cm x 3M 순수 니트로셀룰로오스 멤브레인
PageRuler Prestained protein LadderThermo-FisherSM0671
PBS1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml 증류수) pH 7.4
PercollSigma-AldrichP1644-500ML
연동 펌프Masterflex7518-10
인산Sigma-AldrichP6560
Pierce Protein-Free T20 PBS 차단 버퍼Thermo-Scientific375734C에서 보관. 차단 버퍼
프로테아제 억제제 칵테일Sigma-AldrichP8215-5ML그림 – -20 °에 저장; C
퀵 스타트 Bradford 염료 시약 1xBiorad500-0205For Bradford Assay
퀵 스타트 BSA 표준Biorad500-0207BSA 표준 Bradford Assay
ScalpelLab. CoSize 11 Scalpel
SilverQuest TM 염색 키트InvitrogenLC6070
Simply Blue TM Safe Stain InvitrogenLC6060
Sorvall C6+ 초원심분리기Thermo Scientific46910
Streptavidin (HRP)AbcamAB7403
Streptavidin Magnetic BeadsNew England BiolabsS1420S
Super Glue - Ultra Fast MiniUHU UHUSuper Glue 1mg. Ultra Fast Mini
Table-top CentrifugeEppendorf22331
TCEP써모 피셔20490
트리톤 X-100Biorad161-0407
트윈-20시그마P2287-500ML
볼텍스 믹서RatekVM1
수조그랜트GD100
, , , 용 액체 기판 시스템 DAPI Sigma-Aldrich F6057-20ML DAPI 겸자가 있는 플루드 게 초순수 니트로셀룰로오스 멤브레인 생명 과학

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
  2. De Rose, R., et al.

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Rhipicephalus microplusEpithelial Gut CellsBiotinylated Cell Surface ProteinsPercoll GradientStreptavidin Magnetic BeadsCell Surface Protein IsolationTick Gut Epithelial CellsFluorescence MicroscopySDS PAGE AnalysisELISA Detection

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