Rhipicephalus microplus gut tissue로부터 상피 세포를 분리하기 위해 modified density centrifugation gradient-based 방법을 사용 하였다. 표면 결합 단백질은 스트리타비딘 자성 비드를 통해 바이오 티 닐화되고 정제되어 하류 적용에서 이용되었다.
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이 논문에서
요약
초록
Rhipicephalus microplus - 가축 진드기는 여러 병원균의 벡터 인 가축에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충입니다. 진드기 장 상피 세포의 표면에 위치한 BM86과 같은 백신 후보 물질의 발견에 초점을 맞추어 유해한 영향을 줄이기위한 가축 진드기 관리에 전념했다. 현재 연구는 cDNA 및 게놈 라이브러리의 활용에 초점을 맞추고 다른 백신 후보 물질을 스크리닝합니다. 진드기 배아 세포의 분리는 진드기 배트 세포막에서 표면 단백질의 조성을 조사하는데 중요한 이점을 구성한다. 이 논문은 semi-engorged R. microplus 의 진드기 장 내용물로부터 상피 세포를 분리하기위한 새롭고 실현 가능한 방법을 구성한다 . 이 프로토콜은 TCEP와 EDTA를 사용하여 상피 세포를 상피 세포지지 조직과 불연속 밀도 원심 분리 그라데이션에서 분리합니다다른 세포 유형에서 상피 세포를 분리하는 것. FACS 또는 LC-MS / MS 분석에서 다운 스트림 응용 프로그램을 허용 streptavidin - 링크 마그네틱 비즈를 사용하여 세포 표면 단백질은 biotinylated 및 진드기 상피 세포에서 분리되었습니다.
서론
Rhipicephalus microplus 는 가축 진드기 (babineiosis), 아나 플라스마 증 및 말 피토 플라스마 증 1 , 2 , 3 , 4를 매개로하여 열대 및 아열대 지역의 소 산업에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충이다. 화학 살비제의 사용과 같은 기존의 방법은 우유 및 육류의 화학적 잔류 물의 존재와 화학적 내성 진드기의 유행 증가와 같은 암시 적 단점을 가지고 있지만 해로운 진드기를 통제하기위한 노력이 해로운 영향을 줄이기 위해 노력해왔다 5 , 6 , 7 . 결과적으로, 자연 저항성 소, 생물학적 방제 (biopesticides) 및 백신의 사용과 같은 진드기 제어의 대안적인 방법의 개발이 연구되어왔다ines 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .
백신 후보 물질로 활용 될 수있는 단백질을 추구함에있어 현재의 연구는 진드기 장에 초점을 맞추고있다. 중추의 벽은 얇은 기저 층 (basal lamina) 위에 놓여있는 단일 층의 상피 세포로부터 만들어지며, 기저 층의 바깥 쪽은 근육 네트워크를 형성합니다. 빛과 전자 현미경 관측에 따르면 중뇌는 예비 세포 (미분화), 분비 세포, 소화 세포의 3 가지 유형으로 구성되어 있습니다. 세포 유형의 수는 생리 학적 단계에 따라 상당히 다양합니다. 분비 세포와 소화 세포는 모두 예비 세포 18 , 19 , 20 에서 유래합니다.
cDNA 라이브러리의 구축진드기의 구성을 조사하여 장내 백신 후보 물질 2 , 3 , 4 로 Bm86과 같은 항원 단백질을 밝혀 냈습니다. 당 단백질 Bm86은 진드기 배아 세포 표면에 국한되어 백신 접종 된 소의 가축 진드기 ( R. microplus )에 대한 방어 면역 반응을 유도한다. 면역화 된 숙주에 의해 생성 된 항 -Bm86 IgG는 진드기에 의해 섭취되고, 진드기 장 세포의 표면에서이 항원을 인식하고,이어서 진드기 장 조직의 기능 및 완전성을 방해한다. Bm86 항원 기초 백신 횟수, 체중 및 후속 틱 4 세대 감소 유충 감염의 결과를 engorging 여성의 생식 능력을 감소시킴으로써, R.의 microplus 및 Rhipicephalus annulatus의 효과적인 제어를 보여준다. 그러나 Bm86 계 백신은 모든 진드기 단계에 효과적이지 않으며R.의 microplus의 일부 지리적 균주에 대한 불만족스러운 효과를 보여, 결과적으로 쇠고기와 낙농 산업은 가난, (4)이 백신 2를 채택했다.
진드기로부터 상피 세포를 분리하는 능력은 상이한 환경 조건 하에서 형태 및 생리를 포함한 단백질 막 조성을 결정하기위한 연구의 진행을 가능하게하는 중요한 혁신이다. 여기에 설명 된 방법은 킬레이트 화제 인 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)와 환원제 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)을 사용하여 상피를 상피지지 조직 10 에서 방출합니다. 상피는 동요에 의한 조직의 기계적 파괴 후 Percoll에서의 불연속 그라디언트 원심 분리에 의해 회복된다. 이 논문은 진드기 창자의 분리를위한 실현 가능하고 참신한 기술을 설명한다.세포. 이러한 상피 세포의 표면에서 분리 된 Biotinylated 세포 표면 단백질은 FACS 및 / 또는 LC-MS / MS 분석과 같은 다운 스트림 응용 프로그램에서이어서 분석 할 수 있습니다.
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프로토콜
1. R. microplus 의 Gut Epithelium 해부
- 실험 당일에 가축에서 반 엔 다당류 진드기를 수집합니다. 호스트에서 제거한 후 24 시간 이내에 진드기를 해부합니다.
- 92mm x 16mm 페트리 접시 바닥에 덕트 테이프를 붙입니다. 슈퍼 접착제 한 방울을 테이프에 추가하십시오. 진드기, 복부면을 슈퍼 접착제 위에 놓고 2 분 동안 건조시킵니다.
- 페트리 접시에 인산염 완충 식염수 (PBS) 100 ML을 부어, 또는 진드기가 완전히 잠길 때까지.
- 크기 11의 메스를 사용하여 눈의 꼭대기에서 진드기의 양쪽에있는 하단 꽃줄로 잘라냅니다.
- 살균 포셉을 사용하여 scutum 및 alloscutum을 완전히 제거하여 내부 장기를 노출시킵니다.
- 오염을 방지하기 위해 미세한 흰색 실 모양의 기관 (기관) 및 기타 막을 제거하십시오.
- 포셉을 사용하여 위 부분을 집어 넣고시체. 다른 조직이 해부되지 않도록 나머지 조직을 제거하십시오.
- 염화칼슘과 단백 분해 효소 칵테일 (PIC)이 포함 된 마그네슘 설페이트가없는 얼음처럼 차가운 Hank 's Balanced Salt Solution (HBSS)에 보관하십시오. 드라이 아이스로 용기를 고정시키고 -20 ° C에서 보관하십시오.
참고 : 장 절제술 및 진드기 내부 장기의 세부 사항을 지원하기는 D 소넨샤인, 19 "진드기의 생물학 '의 3.1 장을 참조하십시오.
2. 상피 세포 해리
- 50 ML 튜브 내부 70 μm의 셀 스트레이너에 해부 직감을 부어.
- 용액이 깨끗해질 때까지 PIC가있는 50 mL의 차가운 HBSS로 창자 조직을 씻어 낸다. 그러면 내장은 흰색 / 깨끗한 모양을 취한다.
- PIC와 30 ML 얼음 추위 HBSS의 용기를 다시 일시 중지하고 부드럽게 혼합하고 4 X에서 500 XG 10 분 원심 분리 용기를 펠렛. 뜨는 물을 제거하고 세 번 반복 세척 과정.
- 250 μm 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 여과하고, 흐름을 통과시키고 70 μm 셀 스트레이너를 통해 여과하여 남아있는 흐름을 수집합니다.
- 단일 세포를 펠렛으로 20 분 동안 4 ° C에서 500 XG에서 현탁액을 원심 분리하십시오.
밀도 원심 분리 구배를 이용한 단일 상피 세포의 분리
- AP15 사전 여과지를 통해 여과하여 밀도 원심 분리 구배 ( 예 : Percoll)를 준비하십시오. mqH 2 0 (v / v)에 40 % 및 20 % Percoll을 준비하고 그라디언트를 쌓기 전에 4 ° C에서 1 시간 동안 냉각하십시오.
- 연동 운동 사용펌프를 최저 속도로 놓고, 16 mL 초 원심 분리 관에 40 % 밀도 원심 분리 그라디언트 3 mL를 놓고 얼음에 15 분 동안 침전되도록합니다. 펌프의 속도는 분당 1mL 미만의 유속으로 이어집니다.
- 45 ° 각도로 튜브를 기울이면 연동 펌프를 사용하여 40 % 층 상단에 20 % 밀도 원심 분리 그라데이션을 겹쳐 놓습니다. 펌프의 속도는 분당 1 mL 이하로 유지되어야합니다. 레이어가 얼음에 15 분 동안 정착 수 있습니다.
- 연동 펌프를 분당 1mL 미만의 유속으로 사용하여 20-40 % 밀도 원심 분리 그라데이션에 진드기 직감 세포가 들어있는 DMEM 배지 3 mL를 섞으십시오.
- 최대 가속과 최소 감속을 위해 원심 분리기를 프로그래밍하십시오. 10 분 동안 600 XG에서 원심 분리하십시오. DMEM : 20 % 밀도 원심 분리 그라데이션과 20 % : 40 % 밀도 원심 분리 그라데이션 사이의 중간 단계를 수집하여 상피 단일 세포를 분리합니다. 이후의 분석을 위해 수집 된 interphases를 4 ° C에 보관하십시오.
4. 세포 분리의 평가
- 혈색소
- 알코올로 혈구 미터 슬라이드를 청소하십시오.
- 세포를 위아래로 부드럽게 pipetting하여 세포를 다시 정지시킵니다. 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 세포 현탁액과 장소의 피펫 100 μL.
- 0.4 % Trypan Blue 400 μL를 첨가하십시오. 부드럽게 튜브를 flicking하여 섞는다.
- 천천히 hemocytometer의 두 챔버를 채우기 위해 Trypan 블루 - 처리 세포 현탁액 100 μL를 피펫.
- hemocytometer를 10X 객관적으로 hemocytometer의 그리드 라인에 초점을 맞추고 가벼운 현미경 아래에 놓습니다.
- 휴대용 집계 카운터를 사용하여 16 개의 사각형 집합 내의 살아 있지 않은 셀을 계산합니다. 같은 광장 안에서 파란색 죽은 세포를 세어보세요. 16 세트의 4 세트가 계산 될 때까지 계속 계산하십시오.
- 다음 공식을 사용하여 mL 당 총 세포를 계산하십시오 :
47eq1.jpg "/> - 다음 공식을 사용하여 세포 생존률 백분율을 계산하십시오.
- 세포 격리 시각화
- 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 HBSS 9 μL에 고립 된 세포의 1 μL를 희석. 미세 원심 분리 관을 천천히 섞어서 섞으십시오.
- 유리 슬라이드의 중간에 HBSS에 고립 된 세포 5 μL 피펫. 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 함께 3 방울의 마운팅 매질을 적용하십시오.
- 5 분 동안 실온에서 슬라이드를 품어. 조심스럽게 공기 방울을 피하면서 준비 위에 커버 슬립을 놓습니다.
- DAPI로 염색 된 세포를 형광 현미경 하에서 360 nm 여기시키고 460 nm에서 방출하는 것으로 시각화하십시오.
5. 세포 표면 단백질 Biotinylation
- Biotin (유형 A) 접합을 사용하여 단일 세포 상피 세포 100 μL를 Biotinylate키트를 제조사의 지시에 따라 1 : 1 표면 단백질 대 접합체의 몰비
- 세포 용해를 위해 PBS, 1 % 트리톤 X - 100, 10 % 글리세롤, 100 μm의 산화 glutathione 및 PIC의 100 μL를 biotinylated 세포에 추가합니다. 10 분마다 부드럽게 혼합하면서 얼음에 1 시간 동안 품어 낸다.
- 불용성 물질을 펠렛에 20 분 동안 4 ° C에서 20,000 XG에서 biotinylated 세포를 원심 분리기. 세포질 및 biotinylated 막 단백질을 포함하는 뜨는을 수집합니다.
- Bradford 분석법을 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오.
6. Biotinylated 표면 단백질의 분리
- 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 Streptavidin 자기 구슬 50 μL를 추가합니다.
- 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣고 튜브 측면에 비드를 수집합니다. 뜨는 부분을 버리고 버린다.
- 1000 μL의 TBS, 0.1 % Tween-20을 튜브에 첨가하십시오. 부드럽게 혼합하고 자석 스탠드로 비즈를 수집하십시오.디. 뜨는 부분을 버리고 버린다.
- 씻은 자기 구슬과 1x PBS에서 300 μL로 희석 biotinylated 세포 표면 단백질 40 μg을 결합하십시오. 교반과 함께 상온에서 2 시간 동안 품어 낸다.
- 자성 스탠드로 구슬을 수집하고, 뜨는을 제거하고 버립니다.
- 튜브에 TBS, 0.1 % Tween-20 300 μL를 가하고 가볍게 혼합하여 구슬을 다시 정지시킵니다. 구슬을 모으고 상징액을 버리고 버린다. 이 세척 단계를 두 번 반복하십시오.
- 자성 구슬에 0.1 M 글리신 산도 2.0의 100 μL를 추가하고 실온에서 5 분 품어. 구슬을 수집하고 elotated biotinylated 표면 단백질을 포함하는 뜨는을 제거하십시오.
- 4 ~ 20 % Tris-MOPS SDS-PAGE 젤에서 분리 된 표면 단백질을 시각화합니다.
7. Biotinylated 표면 단백질의 평가
- 점 얼룩
- 니트로 셀룰로스 멤브레인의 7cm x 3cm 스트립을 자릅니다.
- 10 μg 총 진드기 적용t 내용물 (위의 1.8에서)과 10 μg의 biotinylated 표면 단백질을 막으로 옮긴다. 실온에서 15 분간 건조시킨다.
- 용기에 옮기고 100 mL의 블로킹 완충액에 담근다. 1 시간 동안 교반하면서 실온에서 배양하십시오. 블로킹 버퍼를 버립니다.
- 교반과 함께 5 분 동안 100 μL PBS, 0.05 % 트윈 -20에 nitrocellulose 막을 씻으십시오. 세척 완충액을 버리고 세 번 세척을 반복하십시오.
- 실온에서 교반하면서 2 시간 동안 100μL PBS, 0.05 % Tween-20에서 1/5000 Streptavidin-horseradish 과산화 효소 (HRP)를 배양하고 남아있는 용액을 버린다.
- 교반하에 5 분 동안 PBS, 0.05 % Tween-20 100 μL에서 니트로 셀룰로스 멤브레인을 씻으십시오. 세척 완충액을 버리고 세 번 반복합니다.
- 검출을 위해 4- 클로로 -1- 나프톨 1 정을 얼음 냉 메탄올 10 mL에 녹인다. TBS 20 mL에 메탄올 스톡 4 mL를 넣는다. 신선한 30 % 과산화수소 및 immedia 10 μL를 추가하십시오니트로 셀룰로스 멤브레인에 적 용하십시오.
- 기질이 불용성 청색 최종 생성물을 생성 할 때까지 실온에서 교반하면서 인큐베이션한다. 이것은 2-15 분 사이에 걸릴 수 있습니다.
- 검출 용액을 버리고 100 μL mqH 2 O에서 멤브레인을 3 번 씻으십시오.
- ELISA 분석법
- 100 mM 탄산염 코팅 완충액 400 μL로 각 시료 200 ng을 희석하고 ELISA 플레이트 (평평한 바닥 판)의 첫 번째 행 (A #)의 2 차선을 코팅하십시오.
- 행 (BH)에있는 모든 다른 해당 우물에 100 MM 탄산염 코팅 버퍼의 100 μL를 추가합니다.
- 행 A의 각 우물에서 100 μL를 pipetting하여 행 B로 전송하여 각 샘플의 연속 dilutions을 준비 pipetting하여 부드럽게 혼합하고 거품을 피하십시오. 행 H에있는 각 우물에서 최종 100 μL를 버리고, 각 행 아래로 희석액을 반복합니다.
- parafilm와 접시를 덮고 4 ° C에서 밤새 품어.
- 외판을 닦으십시오.PBS 200 μL, 0.05 % Tween-20 / 웰 당 3 회.
- 코팅 된 우물에 차단 버퍼 200 μL를 추가하고, Parafilm으로 덮고 4 ° C에서 밤새 품을 수 있습니다.
- 1 / 15,000 Streptavidin-HRP를 블로킹 완충액으로 희석하고 플레이트의 각 웰에 100 μL를 첨가한다. parafilm으로 덮고 4 ° C 밤새 인큐베이션하십시오.
- 플레이트를 200 μL PBS, 0.05 % Tween-20에서 5 번 씻으십시오.
- 감지하려면 우물 당 TMB 시약 100 μL를 추가하십시오. 충분한 색 발색 후, 보통 10-15 분 사이에 반응을 멈추기 위해 1 M 인산 100 μL를 첨가한다.
- λ = 450nm에서 각 웰의 흡광도를 읽으십시오.
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결과
상피 세포는 R. microplus 의 장 조직으로부터 그림 1에 제시된 도식에 따라 분리되었다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 진드기 배 상피 세포의 대표적인 형광 현미경 이미지를 도 2A에 나타내었다 및 2B. 세포 격리가 semi-engorged R. microplus에서 수행됨에 따라 세포는 표본 전체에 단수 롭고 구형이며 매끄러운 표면 형태와 일정한 크기로 나타납니다. 소화관 세포 집단의 크기와 유형의 차이는 진드기가 완전히 충혈 된 성인으로 진행되면 더욱 분명해진다.
...
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토론
가축 진드기 침입은 살 처분제 1 , 4 의 사용에 의존하는 가장 보편적 인 관리 방법과 함께 전 세계의 열대 및 아열대 지역의 소 산업에서 주요한 문제를 구성합니다. Bm86은 이전에 Bm86 지리적 인 순서 변화와 규칙적인 부스팅 4에 대한 요구 사항으로 인해 백신 전략으로서의 제한된 성공으로 R. microplus의 감염 10 에 대한 방어 항원으로 진드기 장 상피 세포 내에서 확인되었다.
상피 분리 방법론에 초점을 맞춘 이전의 간행물은 주로 척추 동물 또는 곤충류 9 , 11 , 12 ,
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자들은이 연구에 활용 된 Rhipicephalus microplus ticks와 Lucas Karbanowicz가 비디오 촬영에 도움을 주도록 Biosecurity Tick Colony (Queensland Agriculture & Fisheries, Australia)에 감사 드리고자합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM 탄산염 버퍼 | 3.03 g, Na2CO3, 6.0 g NaHCO3, 1000 ml 증류수 pH 9.6 | ||
| 밀봉 캡이 있는 16 mL 원심분리 튜브 | Thermo Scientific | 3138-0016 | 그래디언트 250 µ 전에 얼음으로 냉각 |
| ; M 셀 스트레이너 | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) 액체 기판 시스템 ELISA | Sigma | T0440 | 4C |
| 30 % 과산화수소 | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20 % Tris-MOPS 젤 | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol 정제 | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50mL 팔콘 튜브 | 코닝 블루 | 30 x 115mm 스타일. 폴리프로필리엔 원추형 튜브. | |
| 70 &마이크로; M 세포 여과기 | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 여과지 | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| 해부 현미경 | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | 올림푸스 | 2.2.1.195 | 세포 이미지 소프트웨어 |
| 덕트 테이프 | 홈 핸디맨 | 48mm x 25mm 덕트 테이프 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM - 프로토콜 EDTA |
| Amresco | 0105-500G | ||
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| 형광 현미경 | 올림푸스 | BX51 | |
| 오로쉴 | |||
| Dumont | #9 Dumont - Switerzland | ||
| 글리세롤 | Sigma-Aldrich | G5516 | 분자생물학용 글리세롤 >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| 휴대용 카운터 | 사무국 | JA0376230 | |
| 행크' s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – 프로토콜 적혈구 계를 위한 얼음 차갑 |
| Optik Lakor | - | - | |
| L-글루타티온 산화 | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| 자기 분리 스탠드 | Novagen-4-Tube | 자기 분리 랙 | |
| 메탄올 | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | 용 일체형 정수 시스템 |
| 66485 | 30cm x 3M 순수 니트로셀룰로오스 멤브레인 | ||
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml 증류수) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| 연동 펌프 | Masterflex | 7518-10 | |
| 인산 | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS 차단 버퍼 | Thermo-Scientific | 37573 | 4C에서 보관. 차단 버퍼 |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | 그림 – -20 °에 저장; C |
| 퀵 스타트 Bradford 염료 시약 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| 퀵 스타트 BSA 표준 | Biorad | 500-0207 | BSA 표준 Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM 염색 키트 | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ 초원심분리기 | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue - Ultra Fast Mini | UHU UHU | Super Glue 1mg. Ultra Fast Mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | 써모 피셔 | 20490 | |
| 트리톤 X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| 트윈-20 | 시그마 | P2287-500ML | |
| 볼텍스 믹서 | Ratek | VM1 | |
| 수조 | 그랜트 | GD100 |
참고문헌
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