이 문서는 퍼스널 케어 제품 (Pcp) 에스트로겐 수용 체 알파 (ERα) 또는 베타 (ERβ)를 결속 하는 ligands를 측정에 대 한 최적화 된 효 모 에스트로겐 화면을 표시 합니다. 메서드는 두 색도계 기판 옵션, 학부 과정에서 사용 하기 위해 6 일 냉장된 인큐베이션 및 데이터 분석을 위한 통계 도구를 통합합니다.
방법 논문
학부 교육 연구소에 대 한 효 모 에스트로겐 화면 최적화를 사용 하는 퍼스널 케어 제품에서 Estrogenic Ligands를 검출
이 논문에서
요약
초록
효 모 에스트로겐 화면 (예) 환경 샘플에서 estrogenic ligands를 검출 하는 데 사용 하 고 내 분 비 장애의 연구에 광범위 하 게 적용 되었습니다. Estrogenic ligands는 자연적이 고 인공 "환경 에스트로겐" (EEs) 퍼스널 케어 제품 (Pcp), 플라스틱, 농약, 및 식품을 포함 한 많은 소비자 제품에서 발견 포함 되어 있습니다. EEs는 인간과 다른 동물에서 신호, 잠재적으로 비 옥을 감소 하 고 질병 위험 증가 호르몬을 방해. EEs 및 기타 내 분 비 방해 화학 물질 (EDCs) 공중 보건의 중요성에도 불구 하 고 내 분 비 장애 일반적으로 학부 교육 과정에 포함 되지 않습니다. 이 결점은 또한 학부 학생 들에 게 접근할 수 있으면서도 참여 원칙을 설명 하는 관련 실험실 활동의 부족 때문에 부분적으로. 이 문서를 에스트로겐 수용 체 알파 (ERα) 또는 베타 (ERβ) 퍼스널 케어 제품에 ligands를 측정에 대 한 예는 최적화 된 제공 합니다. 메서드가 두 색도계 기판 중 통합 (ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 또는 chlorophenol 레드-β-D-galactopyranoside (CPRG))는 β-galactosidase에 의해 죽 습, 6 일 냉장된 인큐베이션 단계 LacZ 계산과 관련된 4-매개 변수 로지스틱 회귀 분석에 대 한 R 코드에 대 한 학부 실험실 과정, 자동화 된 응용 프로그램에서 사용을 촉진 한다. 프로토콜 개발 하 고 있는 그들은 제품의 에스트로겐 모방에 대 한 그들의 선택의 화면 실험 학부생 수 있도록 설계 되었습니다. 이 과정에서 그들은 내 분 비 장애, 세포 배양, 수용 체 바인딩, 효소 활동, 유전 공학, 통계, 그리고 실험 설계에 대해 알아보십시오. 동시에, 그들은 또한 근본적이 고 광범위 하 게 적용 가능한 실험실 기술을 연습와 같은: 계산 농도; 만드는 솔루션; 시연 메 마른 기술; 직렬 diluting 표준; 구성 하 고 표준 곡선; 보간 식별 하는 변수 및 컨트롤; 수집, 조직, 및 데이터 분석 구성 하 고 해석 그래프; 그리고 micropipettors, 광 등 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여. 따라서,이 분석 결과 구현 기반 학습 환경 과학 및 건강에 새로운 문제를 탐험 하는 동안에 종사 하는 학생 들을 장려 한다.
서론
효 모 에스트로겐 화면 (예)는 estradiol (e 2 또는 17β-estradiol) 행렬, 물, 식물 조직, 소비자 제품 및 식품1,2,3,를 포함 하 여 다양 한 모방 ligands를 계량에 널리 사용 됩니다. 4. 샨 다, 이러한 ligands "환경 에스트로겐 (EEs)." 라고 예는 낮은 비용, 대안 생체 외에서 vivo에서 테스트 같은 설치류 uterotrophic5,6 분석 결과 및 분석 결과7먹이 무지개 송어로 원래 개발 되었다. 이 테스트의 목표는 제품 포함 자극 또는 에스트로겐-종속 메커니즘을 차단 하는 화학 물질 결정 하는. EEs의 탐지는 중요 한, 그들은 신호, 태아의 개발 중 특히 정상적인 내 인 성 에스트로겐을 방해할 수 있습니다 때문입니다. 이 방해는 비만, 불 임, 암, 그리고 인지 손실8의 위험을 증가 시켜 건강을 타협.
EEs 및 다른 EDCs 공중 보건의 중요성에도 불구 하 고 내 분 비 장애 일반적으로 학부 교육 과정에 포함 되지 않습니다. 이 부족은 또한 학부 학생 들에 게 접근할 수 있는 동안 참여 원칙을 설명 하는 활동의 부족 때문에 부분적으로 이다. 또한, 예 프로토콜의 여러 변형이 존재9,10,11,,1213, 그리고이 다양성은 분석 결과 최적화에 대 한 시간이 실험실 코디네이터는 명확 하 게 관련 기술에서 훈련. 마지막으로, 네 분석 실험은 일반적으로 이상의 1 긴 하루 또는 완료 O/N 외피와 함께 2 일 연속. 이 타이밍은 일반적으로 한 번만 나 학부 실험실 과정의 형식으로 호환 되지 않습니다 / 몇 시간 주.
이러한 요구에 대응,이 원고는 개인 배려 제품 (Pcp)3 , 매주 실험실 회의 수용 하기 위해 6 일 냉장 단계에 대 한 ethanolic 추출 방법을 포함 하는 최적화 된 96 잘 예 프로토콜을 보고 합니다. 절대 에탄올은 다양 한 극 지와 비 극성 용액을 해산 할 수 있는 다양 한 유기 용 매 이다. 또한, 그것은 학부 과정에 적합 하기 때문에 그것은 쉽게 사용할 수, 상대적으로 비 독성, 저렴 한, 혼합할 수 있는 물; 그것은 또한 특별 한 장비 없이 쉽게 증발. 그러나, 에탄올 강하게 소수 성 내 분 비 분리기 또는 많은 오일과 왁 스를 추출 하기 위한 이상적인, Pcp. 가난한 추출 효율에 일반적인 재료 되 고 후자의 두 틀린 부정적인 결과의 모험을 증가 한다. 마음에이 제약 조사 그 주소 샘플 특성 추출 절차 (예를 들어, ethanolic 추출 또는 고체 상 추출)를 선택 하 고 연구 목적 (연구 학부 교육 대)을 충족 해야 합니다.
예는 재조합 Saccharomyces cerevisiae 원래 Tulane 대학에서 박사 찰스 밀러에 의해 만들어진에 의존 합니다. 밀러 그 외 여러분 보십시오 (2010 년) 엔지니어링된 플라스 미드14의 완전 한 지도 위해. 익스프레스 인간의 핵 ERα 또는 ERβ (또한 부르는 ESR1 그리고 ESR2, 각각) 효 모 constitutively이 플라스 미드와 변형 (ERα)에 대 한 갈 락 토스 또는 포도 당 또는 갈 락 토스 (ERβ)에 대 한 포함 된 미디어에 성장 될 때. Estrogenic 화학 미디어에 있다면, 그들은 β-galactosidase (lacZ) 식 estrogenic 화학 물질의 농도에 비례 하는 수준을 활성화 하는 리간드-수용 체 복합물을 만드는 수용 체에 바인딩합니다. 효 모 세포는 다음 출시 축적 된 β-galactosidase lysed. 세포의 용 해 버퍼는 ONPG 또는 CPRG, β-galactosidase 노란색 또는 빨간색 제품을 각각 산출 하 여 죽 습 포함 되어 있습니다. 색도계 제품 microwell 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 흡 광도 측정 하 여 측정할 수 있습니다. 색상 변경의 정도 누 룩 노출 되었다 estrogenic ligands의 농도에 비례.
테스트 중인 샘플에서 발생 하는 배경 흡 광도 대 한 잠재력에 따라 기판 (CPRG 또는 ONPG) 선택 합니다. 예를 들어 식물 추출 됩니다 추가 하기도 노란색 색조 미디어 경우 인위적으로 estrogenicity 측정을 웃 기는 ONPG (405에서 계량 nm) β-galactosidase는 기판으로 사용 됩니다. 와 식물 추출 물, CPRG (574에 계량 nm) 더 적절 한 색도계 기판 있을 수 있습니다. CPRG는 ONPG 보다 더 비싼 하지만 10 분의 1 몰에 사용 됩니다. 이 문서는 주치의의 estrogenicities ONPG와 CPRG를 사용 하 여 정량 추출 물을 선물 한다.
ERα 및 ERβ를 사용 하 여 환경 샘플의 estrogenicity를 측정 이러한 수용 체 중 하나만 사용 하 여 보다 더 포괄적인 접근 이다. 동물,이 수용 체 차동 조직 배포, 규제 활동, 및 바인딩 선호도 estrogenic 안티 estrogenic ligands15전시. 예를 들어 식물 기반 에스트로겐 일반적으로 바인딩할 ERβ 더 강력 하 게2, 합성 화학 물질 중 ERα 또는 ERβ에 대 한 선호를 표시할 수 있습니다 또는 두 수용 체 똑같이 잘15를 바인딩할 수 있습니다. 따라서, 한 에스트로겐 수용 체에 바인딩은 반드시 다른 바인딩을 예언 하지 않습니다.
EEs는 식물 뿐만 아니라 많은 소비자 제품 (예, 농약, 세제, 접착제, 윤활제, 플라스틱, 식품 및 의약품)에서 발견, 제시 데이터 Pcp. 선택을 사용 하 여 가져온 Pcp는 경쟁력, 쉽게 사용할 수 있는, 예산 친화적인, 그리고 학부생을 위한 환경 관련. 학생 가정 실험실에서 테스트에서 그들의 좋아하는 Pcp를가지고 초대 될 수 있습니다. 그들은 또한 높은 Pcp의 가설 기반 비교를 생성 하 여 독성 점수 낮은 환경 실무 그룹16 에 의해 개발 된 피부 깊은 데이터베이스를 검색할 수 있습니다. 이 방법에서는, 학생 들은 동시에 고급 실험실 능력; 개발할 수 있습니다. 자율, 기반 학습;에 관여 환경 과학 및 건강에 새로운 문제를 탐구 하 고.
프로토콜
1. 시 약
- 6.7 g 효 모 질소 기본, 20 g 포도 당 또는 갈 락 토스, 20mg 아데닌 황산 (추가 200 mg/100 mL 재고 용액 10 mL), 20 mg uracil (추가 200 mg/100 mL 재고 용액 10 mL) 혼합 하 여 포도 당 그리고 갈 락 토스 미디어 준비 60 mg 신 (1 g/100 mL 수성 재고 솔루션의 6 mL 추가), 그리고 이온 물 여과 (0.2 µ m 필터)에 의해 1 L. Sterilize의 마지막 볼륨에 20mg 히스티딘 (추가 1 g/100 mL 수성 재고 솔루션의 2 개 mL). 몇 주 동안 4 ° C에서 미디어를 저장할 수 있습니다.
- Estradiol (e 2) 표준 녹이는 가루 E2 무수 에탄올에 적절 한 작동 농도를 희석 하 여 준비 (227.5 nM & 9.75 nM) 50% 에탄올에.
참고: estradiol 1mg의 유리병으로 구입한 경우 해산 estradiol 분말 유리병에 직접 1 mL 에탄올을 추가 합니다. 이 3.67 m m 재고 # 1을 생성합니다. 주식의 36.71 μ M #2 1 mL을 990 μ 에탄올에 #1 주식의 10 μ 희석. 그런 다음 희석 367.13 nM 주식 # 3의 1 mL을 990 μ 50% 에탄올에 #2 주식의 10 μ. 작업 주식을 하려면 619.7 μ 주식 #3 227.5 nM 일 주식 ERα을 표현 하는 효 모와 표준 곡선을 만드는 데 사용의 1 mL를 만들려고 380.3 μ 50% 에탄올을 희석. 26.56 μ 주식 #3 1 mL의 9.75 nM 작업 ERβ을 표현 하는 효 모와 표준 곡선을 작성 하는 데 사용 하도록 973.44 μ 50% 에탄올을 희석. 표준 parafilm와-20에 게 인감 또는-70 ° C
주의: e 2는 발암 의심된 물질 및 생식 toxicant. 그것은 흡입, 삼 켜, 또는 피부를 통해 흡수 하는 경우에 유해한입니다. E2 모유 어린이 태아에 해를 일으킬 수 있습니다. E2 수생 생활에 매우 독성이 있다. 적절 한 개인 보호 (장갑, 연기 후드, 먼지 마스크)을 사용 하 고 임신과 수 유 동안 노출을 피하십시오. 유해 폐기물으로 e 2를 처분 하 고 환경에 공개 하지 마십시오. - 마지막에 이온된 수에 8.52 g Na2HPO4, 5.52 g NaH2포4•H2O, 95.21 mg MgCl2, 745.5 mg KCl, 2 세대 N-lauroylsarcosine 나트륨 소금, ONPG (400 mg) 및 CPRG (77.7 m g)를 혼합 하 여 LacZ 버퍼를 준비 -20 ° c.에 20 mL aliquots에 1 나 저장소 LacZ 버퍼의 볼륨
참고: 20 mL aliquot는 충분 한 96 잘 접시입니다. - 105.9 g 1 나 게 실시간의 최종 볼륨을 이온된 수에 탄산 나트륨을 혼합 하 여 탄산 나트륨을 준비
- 준비 물에서 1 M dithiothreitol (DTT). -20 ° c.에 DTT의 25 µ L aliquots 고정
주의: DTT는 급성 피부 및 눈 자극. 적절 한 개인 보호 장비 (장갑, 연기 후드, 먼지 마스크)를 사용 하 여 피부와 눈 접촉, 흡입 및 섭취를 피하기 위해.
참고: 각 약 수 한 96 잘 접시 충분 하다.
2. 샘플 및 추출 컨트롤 준비
- 샘플 테스트를 선택 합니다.
참고:이 문서 15 Pcp, 비누, 헤어 크림, 샴푸, 선스크린, 립밤, 재단, 면도 크림, 매니큐어, 그리고 로션을 포함 하 여에 대 한 데이터를 제공 합니다. - 15 mL 원뿔 튜브에 무수 에탄올 10 mL에 1 g 샘플의 결합. 15 mL 원뿔 튜브에서 에탄올의 11 mL의 구성 된 부정적인 추출 제어를 준비 합니다. 필요에 따라 복제를 준비 합니다.
참고: 제시 실험 설계에 대 한 모든 15 Pcp 및 triplicate 추출 제어 솔루션의 3 aliquots 준비 되었다, 저조한 총 48 샘플, 각각의 섹션 4에에서는 프로토콜을 사용 하 여 3 중에서 분석 했다. 단일 플레이트 triplicates에서 최대 23 샘플을 수용할 수 있습니다. 무수 에탄올은 쉽게 증발 하기 때문에이 단계에서 사용 됩니다. 부정적인 추출 제어를 사용 하 여 에스트로겐 원뿔 튜브에서 샘플에 leaching 하지는 확인. - 수동 진동 및 vortexing의 조합에 의해 또는 다중 튜브 vortexer에 튜브를 떨고 하 여 30 분 동안 튜브 내용을 균질.
- 원심 10 분 Decant 대 양동이 분리기에 최대 허용 속도에 원뿔 튜브 각 튜브에서 상쾌한 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 원뿔 관으로. 유리 섬광 유리병으로 각 50 mL 튜브의 빈 내용입니다.
- 두고 튜브 에탄올을 완전히 증발 수 있도록 1 주일에 대 한 환기 후드에서 엽니다. 또는, 통풍된 후드 또는 회전 증발 기 질소 아래에 샘플을 건조. 빛 민감한 성분의 저하를 방지 하려면 (예를 들어, 통풍된 후드 문에 장소 불투명 원단) 빛에서 건조 샘플을 보호 합니다.
- 50% 에탄올과 균질에 소용돌이의 1.0 ml 샘플 reconstitute
3. 배양 및 효 모14 Subculturing
- 30 ° c.에 필터 살 균 포도 당 미디어에서 효 모 배양에 의해 활성 효 모 문화 ( S. cerevisiae14의 재조합 W303a 변형)을 유지 신선한 필터 살 균 포도 당 미디어에서 매주 효 subculture
- 2 박 (약 42 시간) 예 판 준비 전에 subculture 무 균 기술을 사용 하 여 필터 살 균 포도 당 미디어의 10 mL를 활성 효 모 문화의 0.1 mL를 추가 하 여 효 모. 이틀 동안 30 ° C에서 품 어. 만약 효 모는 성장 얕은 문화로 살 균 250 ml 삼각 플라스 크를 흔들어 필요 하지 않습니다.
참고: 효 모도 저장할 수 있습니다 냉장된 한 판에 몇 달 동안. 장기 저장을 위해 (년), O/N 문화 15-50% 메 마른 글리세롤, 소용돌이, 및 결합-70 ° c.에 동결 살 균 글리세롤을 준비 하려면 주사기를 사용 하 여 느슨하게 모자 cryovial 고 압력솥에 300 µ L 글리세롤을 전송. 그럼 1200 µ L O/N 효 모 문화 무 균 기술을 사용 하 여 추가 합니다.
4. 준비 예 판 (분석 결과 1 일)
- 살 균 비 커, 무 균 기술을 사용 하 여 희석 610에서 0.065 0.005의 광학 밀도 단계 3.2에서에서 효 모 살 균 하는 필터 갈 락 토스 미디어에 nm (OD610).
- 명확한 폴리스 티 렌 격판덮개로 각 효 모 샘플 triplicate 갈 락 토스 공백 함께 3 중에 pipetting 120 μ에 의해 광학 밀도 확인 (접시 필요가 없습니다 살 균 수). 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 희석된 효 모 문화 누 룩의 net OD610 를 결정 하기 위해 효 모 OD610 독서에서 갈 락 토스의 0.065 0.005 빼기 OD610 판독의 net OD610 있는지 확인 합니다. 각 96 잘 접시 적어도 30 mL 희석 효의 최종 볼륨을 준비 합니다.
참고: 595 610 nm 사이의 흡 광도 측정 하는 분 광 광도 계 필터는이 측정을 위해 사용할 수 있습니다.
- 명확한 폴리스 티 렌 격판덮개로 각 효 모 샘플 triplicate 갈 락 토스 공백 함께 3 중에 pipetting 120 μ에 의해 광학 밀도 확인 (접시 필요가 없습니다 살 균 수). 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 희석된 효 모 문화 누 룩의 net OD610 를 결정 하기 위해 효 모 OD610 독서에서 갈 락 토스의 0.065 0.005 빼기 OD610 판독의 net OD610 있는지 확인 합니다. 각 96 잘 접시 적어도 30 mL 희석 효의 최종 볼륨을 준비 합니다.
참고: 폴 리 프로필 렌 플레이트 압력가 마로 소독 두 누적된 판 호 일에 포장 하 여 멸 균. 상단 플레이트 샘플 접시 뚜껑 역할 수 세척, 다시 압력가 하는, 그리고 다시.
참고: 직렬 희석 완료 되 면 우물 g 1-3에서에서 205 μ를 삭제 합니다. 이 단계의 끝에, 모든 표준 웰 스 120 μ를 포함 해야 합니다. 직렬 희석 표 1에 나열 된 마지막 E2 농도 얻을 것입니다. 직렬 희석 단계에 대 한 멸 균 팁 멀티 채널 pipettor를 사용 하 여 도움이 됩니다.
참고: 차량 제어 웰 스는 효 모 세포 및 미디어와 관련 된 배경 흡 광도 측정 하는 데 사용 됩니다. 또한, 테스트 샘플의 OD610 값을 비교 하 여 검출 될 수 있다 세포 독성 또는 성장 촉진 효과와 차량 제어 우물의 우물을 테스트 합니다.
참고: 기록해 샘플 또는 부정적인 추출 컨트롤이 추가 되는 각 음에. 추적 하는 웰 스 샘플 하 고는 하지 않는, 팁의 신선한 상자와 함께 시작 하 고 접시에 해당 우물의 위치와 상자에 동일한 위치에서 도움말을 사용 하 여 있다. 한 96 잘 접시는 3 중에서 최대 23 샘플을 수용할 수 있습니다.
5. 처리 예 판 (분석 결과의 주 2)
- 30 ° C에서 17 h 부 화 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거 합니다. 접시는 즉시에서 처리 될 것입니다, 5.1.1 단계로 진행 합니다. 접시는 나중에 처리 됩니다, 5.1.2 단계로 진행 합니다.
- 멀티 채널 pipettor 우물, 각 행의 내용을 믹스를 사용 하 여 그리고 명확 하 고, 폴리스 티 렌, 96-잘 microplate의 해당 각 우물에서 효 모 현 탁 액의 50 µ L을 전송.
참고: 폴리스 티 렌 접시 살 균 될 필요가 없습니다 하지만 뚜껑이 있어야 한다. 사용 하 여 새로운 피펫으로 팁 웰 스의 각 행에 대 한 교차 오염 우물을 피하기 위해 팁만 triplicate 세트 사이 변경 해야 8 팁 멀티 채널 피 펫과 triplicates에 걸쳐 pipetting, 경우.- 새로운 플레이트를 레이블을 지정 합니다. 5.2 단계로 진행 합니다.
- 저장 처리 하기 전에 격판덮개, 플라스틱 랩에 포장. 6 4 ° C에서 래핑된 플레이트를 냉장 디 그 후, 냉장고에서 플레이트를 제거, 그들 풀 다 그리고 단계 5.1.1 에서처럼 pipetting에 의해 모든 우물의 내용을 전송. 5.2 단계로 진행 합니다.
- 멀티 채널 pipettor 우물, 각 행의 내용을 믹스를 사용 하 여 그리고 명확 하 고, 폴리스 티 렌, 96-잘 microplate의 해당 각 우물에서 효 모 현 탁 액의 50 µ L을 전송.
- 1mm DTT의 최종 농도 대 한 해 동된, 실내 온도 LacZ 버퍼의 20 mL를 1 M DTT의 20 µ L를 추가 합니다. 잘 믹스 LacZ 버퍼입니다. 다중 채널 피 펫을 사용 하는 경우 시 약 저수지로 분배.
주의: 장갑을 착용 하 고 가능한 경우 후드, DTT와 함께 작동 - 어느 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 또는 pipettor 반복, 폴리스 티 렌 판 모든 우물에 DTT ONPG 및 CPRG를 포함 하는 LacZ 버퍼의 200 µ L을 추가 하 고 측정 한 즉시 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 모든 우물의 OD610 기록. 추가 번호판에 대 한 필요에 따라 반복 합니다.
참고: OD610 판독 LacZ 계산 (단계 6.1)의 분모에 사용 됩니다. 이러한 이유로, 읽기 pipetting 직후와 셀 정착 하기 전에 얻거나 LacZ 버퍼에 의해 lysed. OD610 값 샘플 웰 스에 대 한 눈에 띄게 높거나 차량 제어 웰 스에 대 한 OD610 값 보다 낮은 경우, 샘플 추출은 성장 촉진 또는 효 모 세포 독성 각각. 계산 셀 밀도 작은 차이 웰 스, 하지만 차이가 어느 방향으로 30%를 초과할 경우 전체 수정 것 이다 LacZ 추가 50% 에탄올에 (단계 2.6)에서 재구성된 샘플 희석 그리고 3.2 단계로 반환 하 여이 샘플을 다시 테스트 12. - 커버 뚜껑 접시. 그 표현 ERα14 30 ° C (ONPG)에 대 일 분 또는 3 h (CPRG)에 대 한 효 모에 포함 된 접시를 품 어. 그 표현 ERβ14 30 ° C (ONPG)에 대 일 분 또는 4 h (CPRG)에 대 한 효 모에 포함 된 접시를 품 어.
참고: CPRG를 사용할 경우 보육 시간 있습니다 유연; 잠복기 2-4 h에 대 한 분석 결과 감도 증가 하는 더 이상 외피와 두 수용 체와 적당 한 결과 생성 합니다. - 플레이트 잠복기 후 각 우물에 탄산 나트륨의 100 µ L을 추가 하는 멀티 채널 피 펫 또는 반복 pipettor을 사용 합니다. 탄산 나트륨 pH를 제기 하 고 β-galactosidase 반응 중지.
- 측정 하 고 OD405 (ONPG)에 대 한 또는 플레이트 분 광 광도 계를 사용 하 여 모든 우물 (CPRG)에 대 한 OD574 기록.
6입니다.LacZ 값 계산
참고: LacZ 값 각 샘플에 대 한 색상 변경의 정도 계량 하 고 제공 하는 몇 가지 변수를 고려 하 여 별도 분석 실험 간의 값을 비교 하는 정규화 된 방법 (예, 효 모 광 밀도, 미디어 광 밀도, 그리고 보육 시간 이 같은 접시에 우물 마다 다릅니다)12.
- 미디어 (갈 락 토스) 제어 웰 스 (h 10-12), triplicate OD610 값의 의미를 계산 하 고 계산 triplicate OD405 또는 차량 (50% 에탄올) 컨트롤 (h 1-3)에 대 한 OD574 값의 의미. 사용 하 여 이러한 의미와 부 화 시간 (t) 접시에 대 한 시간에 색상 (단계 5.5) LacZ 값 (각 잘에서 색상 변경의 정도 해당) 계산을 변경 모든 표준에 대 한 및 샘플 우물 다음과 같은 방정식을 사용 하 여:
- 또는 LacZ 표준 및 샘플에 대 한 값을 계산할 부록 1 에서 자동된 응용 프로그램을 사용 합니다.
참고: 응용 프로그램 함께 사용 하는 접시 레이아웃 동일 접시 레이아웃 그림 1에 제시 해야 합니다. 일부 샘플 우물 사용 되지 않은 경우 빈 우물에서 흡 광도 신호는 부록 1 LacZ 응용 프로그램에 붙여넣을 흡 광도 데이터 집합에서 자리 표시자로 유지 됩니다. 이 응용 프로그램에서 접시의 공간 레이아웃을 유지 하 고 그들의 원하는 위치에 미디어 컨트롤 웰 스는 되도록 합니다. 또한, 빈 셀이 응용 프로그램이 실행 되지 않습니다.
- 또는 LacZ 표준 및 샘플에 대 한 값을 계산할 부록 1 에서 자동된 응용 프로그램을 사용 합니다.
- 각 샘플에 대 한 각 E2 표준 triplicate LacZ 값의 의미를 계산 합니다. LacZ 평균값 µ L-1으로 보고 h-1. 로그 변환 표준, 각 E2의 농도 그리고 template.csv 파일 (부록 2)에서 같이 형식의 스프레드시트 문서를 생성.
7. 샘플 Estradiol 등가물 (EEQs) 4-매개 변수 로지스틱 회귀를 사용 하 여 보간
참고: EEQs e 2를 사용 하 여 만든 표준 곡선의 LacZ 값 샘플 LacZ 값 (색상 변경) 관계. EEQs는 따라서 얼마나 많은 샘플은 e 2의 알려진 농도 같은 색상 변경 응답을 유도 하는 데 필요한 결정 합니다.
- EEQs 테스트 샘플을 계산 하려면 먼저 표준 곡선을 플롯. E2 표준 (y 축) 및 해당 로그 변환 E2 농도 (x 축) 4-매개 변수 로지스틱 회귀 모델에 대 한 평균 LacZ 값에 맞게.
- 테스트 샘플 LacZ 값 EEQs을 보간 하는 모델을 사용 합니다. 부록 2에 설명 된 대로 통계 소프트웨어를 사용 하 여 EEQs의 로지스틱 회귀 계산을 수행 합니다.
8. 표준화 주치의 샘플 질량에 EEQs (ng/mL)
- EEQs 주치의 샘플에 추가 금액에 관련 된 각 단계 4.5에서에서 잘, 증식 EEQ (ng/mL) 샘플 웰 스 (325 µ L)으로 도금 총 볼륨 그리고 다음 추출된 샘플 추가 볼륨을 나누어 각 음 (5 µ L)에.
참고:이 값은 추출 된 샘플의 mL 당 EEQ를 나타냅니다. 주치의의 1 g를 사용 하 여 샘플 준비, 이러한 값 그램 주치의 (ng/g) 당 EEQ를 또한 나타냅니다. 이 방식으로 표현, EEQ 값 (ng/g) 비교 될 수 있다 다른 Pcp. EEQ (ng/g) 값이 연구에서 테스트 하는 퍼스널 케어 제품 표 2에 표시 됩니다 및 전체 프로토콜에 걸쳐 수집 된 샘플 데이터는 에 포함 되어 있습니다. 부록 3.
결과
15 Pcp의 triplicate 샘플의 estrogenicities이 예 프로토콜을 사용 하 여 평가 되었다. 밀러 그 외 여러분 에 의해 설명 했 듯이 (2010 년), ERβ을 표현 하는 효 모와 분석 ERα (그림 2)14를 표현 하는 효 모와 분석 보다 더 중요 한 크기 순서 보다는 더 많은 했다. 따라서, estrogenic 활동 더 자주 표현 하는 ERβ 효 모 (표 2)와 함께 발견 되었다. 8 Pcp ERβ estrogenic 활동을 전시 하 고 5 Pcp ERα estrogenic 활동을 전시. 헤어 크림, 선크림, 로션, 그리고 입술 크림 샘플 재단, 면도 크림, 매니큐어 했다만 시험된 농도에서 ERβ와 estrogenic 반면 estrogenic 두 수용 체와 함께 했다. 7 다른 Pcp (4 샴푸, 비누 2, 및 1 립밤) 시험된 농도에서 두 수용 체와 estrogenic 아니었다.
수용 체의 감도 차이, 뿐만 아니라 각 샘플에 대 한 EEQs 분석 결과 (표 2)에 사용 되는 색도계 기판 (ONPG 또는 CPRG)에 따라 달랐다. 하나의 샘플 제외한 모든 ONPG를 사용 하 여 결정 하는 EEQs CPRG를 사용 하 여 결정 보다 높았다. 또한, 추출 복제 사이 변이 EEQs ERβ와 CPRG 측정에 대 한 최저 고 ERα와 ONPG (표 2) EEQs에 대 한 최고 결정.
색도계 기판 비교, 이외에 현재 연구의 1 목표 보육 학부 실험실 과정의 일정와 호환 되는 기간 시간을 테스트 했다. 전형적인 예 분석 결과 17 h 외피 바로 뒤 LacZ 버퍼에 대 일 분-4 h, 보육 주간 세션 단일 제약 교육 실험실에서 구현할 수 있는 필요 합니다. 교육에서이 분석 결과의 사용을 촉진 하는 분석 결과 17 h 부 화 후 6 d 냉각 기간 (5.1.2 단계)를 도입 하 여 수정 되었습니다. 냉장 된 격판덮개에서 표준 곡선 비 냉장 접시에서 그들에 대 등 했다 (그림 2 & 3), 매개 변수 4-매개 변수 로지스틱 회귀 모델을 사용 하 여 추정의 표준 오류 모두 했다를 제외 하 고 nonrefrigerated 플레이트 (표 3)에 대 한 보다 냉장된 번호판에 대 한 작은. 따라서, 오류 감소 6 d에 대 한 번호판을 냉동 고 EEQ 예측의 정확도 향상 시킵니다.
그림 1입니다. Microwell 플레이트 레이아웃과 표준 희석 곡선 예 분석 결과 대 한 준비. E2 표준 (밝은 회색 웰 스), 샘플 및 네거티브 추출 컨트롤 (화이트 웰 스), 그리고 차량 (h 1-3) 및 갈 락 토스 미디어 (h 10-12) 컨트롤 (어두운 회색 웰 스) 모두 3 중에서 테스트 되었습니다. E2 표준 곡선 (밝은 회색 우물) 우물 A1 a 3와 G3 통해 웰 스 B1에 효 120 µ L를 통해에 효 320 µ L를 도금 하 여 건설 되었다. E 2의 다음, 5 µ L (227.5 ERα을 표현 하는 효 모에 대 한 nM; 9.75 ERβ을 표현 하는 효 모에 대 한 nM) 우물 A1 a 3 통해 효 모에 추가 되었습니다. 효 모 + E2 정지 205 µ L를 각 우물에서 표 1에 나열 된 마지막 E2 농도 저조한 아래, 잘 옮겨서 순차적으로 희석 되었다. 참고는, 연속적인 희석 과정의 끝에, 205 µ L 폐기 해야 각 우물에서 120 µ L의 최종 볼륨을 달성 하기 위해 G3 통해 g 1은 우물에서. 샘플 및 부정적인 추출 제어 웰 스는 누 룩의 320 µ L를 각 추출 물 (50% 에탄올에 용 해)의 5 µ L을 추가 하 여 준비 되었다. 차량 제어 웰 스 (h 1-3) 효 320 µ L를 50% 에탄올의 5 µ L을 추가 하 여 준비 했다. 모든 샘플 및 제어 우물 pipetting, 혼합 했다 그리고 205 µ L을 제거 하 고 120 µ L 잘 볼륨을 조정 하려면 삭제 했다. 마지막으로, 미디어 컨트롤 우물 H10-12로 갈 락 토스 미디어의 120 µ L를 도금 하 여 준비 되었다. 부록 1 , 부록 2, e 2는 R-기반 응용 프로그램에서 LacZ 계산기를 사용 하 여 표준 곡선과 차량 및 갈 락 토스 미디어 컨트롤 해야 될 도금 같이. 샘플 및 부정적인 추출 컨트롤 도금의 순서 언급으로 화이트 웰 스에 도금 될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 4-매개 변수 로지스틱 회귀를 통해 생성 된 예 판에 대 한 표준 곡선. 두 기판 (ONPG & CPRG) 두 인간 에스트로겐 수용 체 (ERα 또는 ERβ) 모두 (A) 없이 중 하나를 표현 하는 누 룩을 사용 하 여 테스트 및 17β-estradiol 및 샘플 17 h 부 화 후 (B) 6 d 냉각 기간을 추출. 모든 E2 표준 및 미디어와 차량 제어 3 중에서 테스트 되었습니다. 포인트는 LacZ 값 β-galactosidase에 의해 유도 된 색상 변경의 정도 반영 하는 어디 triplicate LacZ 값의 의미를 나타냅니다. 로지스틱 회귀 모델 매개 변수는 표 3에 나와 있습니다. ONPG = 직교-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorophenol 레드-β-D-galactopyranoside. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 개발된 예 판 예. 두 기판 (ONPG & CPRG) 표현 하는 인간 에스트로겐 수용 체 (ERα 또는 ERβ), 누 룩을 사용 하 여 테스트 (왼쪽) 없이 또는 17β-estradiol 또는 샘플 17 h 부 화 후 (오른쪽)는 6 일 냉동 기간으로 추출. 모든 E2 표준, 미디어 및 차량 컨트롤 triplicates에서 테스트 되었습니다. 플레이트 각 플레이트 및 컨트롤 (50% 에탄올 + 오른쪽에 왼쪽 및 갈 락 토스 미디어에 효 모) 그림 1에 따라 각 격판덮개의 맨 아래 행의 맨 위 행에서 가장 높은 E2 농도와 배열 되었다. ONPG = 직교-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorophenol 레드-β-D-galactopyranoside.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 표준 번호 | [E2] ERα 효 모 (오후)에 대 한 | [E2] ERβ 효 모 (오후)에 대 한 |
| 1 | 3500 | 150 |
| 2 | 2208 | 94.6 |
| 3 | 1393 | 59.7 |
| 4 | 878 | 37.6 |
| 5 | 554 | 23.7 |
| 6 | 349 | 15 |
| 7 | 220 | 9.45 |
표 1입니다. 최종 농도의 E2 표준 예에 사용 합니다.
가루 E2 무수 에탄올에 용 해 되었고 다음 작업 227.5의 재고 농도 희석 (ERα을 표현 하는 효 모)에 대 한 및 9.75 nM (ERβ을 표현 하는 효 모)에 대 한 50% 에탄올에.작업 주식 갈 락 토스 미디어에 효 모를 포함 하는 미 판 우물에 추가 되었고 순차적으로 테이블에 표시 된 농도에 희석.
| 테스트 샘플 | 시험 조건 | Pcp의 estrogenic 등가물 (EEQs) | |||||
| PCP # | 샘플 유형 | 수용 체 | 기판 | EEQ 1 (ng/g) | EEQ 2 (ng/g) | EEQ 3 (ng/g) | 의미 하는 EEQ (ng/g) |
| 1 | 헤어 크림 | ERΑ | ONPG | ND | 0.379 | ND | < 0.379 |
| 1 | 헤어 크림 | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 1 | 헤어 크림 | ERΒ | ONPG | 0.528 | 0.338 | 0.363 | 0.410 |
| 1 | 헤어 크림 | ERΒ | CPRG | ND | 0.215 | ND | < 0.215 |
| 4 | 썬 스크린 | ERΑ | ONPG | 6.803 | 1.390 | ND | < 4.097 |
| 4 | 썬 스크린 | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 4 | 썬 스크린 | ERΒ | ONPG | 1.321 | 0.838 | 0.818 | 0.992 |
| 4 | 썬 스크린 | ERΒ | CPRG | 0.651 | 0.591 | 0.725 | 0.656 |
| 7 | 재단 | ERΑ | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 7 | 재단 | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 7 | 재단 | ERΒ | ONPG | ND | 0.158 | ND | < 0.158 |
| 7 | 재단 | ERΒ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | 면도 크림 | ERΑ | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | 면도 크림 | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | 면도 크림 | ERΒ | ONPG | ND | 0.256 | 0.295 | < 0.276 |
| 9 | 면도 크림 | ERΒ | CPRG | 0.507 | 0.392 | 0.560 | 0.486 |
| 10 | 매니큐어 | ERΑ | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 10 | 매니큐어 | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 10 | 매니큐어 | ERΒ | ONPG | 0.916 | 0.503 | 0.554 | 0.658 |
| 10 | 매니큐어 | ERΒ | CPRG | 0.532 | 0.628 | 0.594 | 0.585 |
| 11 | 로션 | ERΑ | ONPG | ND | ND | 2.327 | < 2.327 |
| 11 | 로션 | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 11 | 로션 | ERΒ | ONPG | 범위를 초과 | 2.599 | 1.845 | > 2.222 |
| 11 | 로션 | ERΒ | CPRG | -- | 1.986 | 1.236 | 1.611 |
| 13 | 썬 스크린 | ERΑ | ONPG | 14.069 | 11.494 | 10.189 | 11.917 |
| 13 | 썬 스크린 | ERΑ | CPRG | 4.773 | 5.790 | 5.850 | 5.471 |
| 13 | 썬 스크린 | ERΒ | ONPG | 범위를 초과 | 2.580 | 범위를 초과 | > 2.580 |
| 13 | 썬 스크린 | ERΒ | CPRG | 0.292 | 0.240 | ND | < 0.266 |
| 15 | 립밤 | ERΑ | ONPG | ND | ND | 0.431 | < 0.431 |
| 15 | 립밤 | ERΑ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 15 | 립밤 | ERΒ | ONPG | 1.202 | 1.060 | 0.887 | 1.050 |
| 15 | 립밤 | ERΒ | CPRG | 0.820 | 0.871 | 0.851 | 0.847 |
표 2입니다. 0이 아닌 EEQs와 Pcp의 EEQs입니다. 3 aliquots 15 Pcp 및 세 개의 추출 컨트롤의 무수 에탄올에 무 균, 증발 되었고 각각의 예 분석 결과 사용 하 여 3 중에 분석 48 샘플의 총 50% 에탄올에서 재구성. 8 Pcp 했다 1 0이 아닌 EEQ 7 Pcp 했다 시험된 농도에서 estrogenic 수 찾을 수 없습니다. 각각 별도 접시에 3 중에서 테스트, EEQ 1, EEQ 2와 EEQ 3 각 주치의의 3 aliquots를 참조 하십시오. EEQ 1, EEQ 2와 EEQ 3 값은 각 약 수에 대 한 triplicates의 수단입니다. 분석 결과에서 사용 하는 효 모 1/2 isoforms 인간 에스트로겐 수용 체 (ERα 또는 ERβ)의 표현. 두 색도계 기판, ONPG 및 CPRG, 냉장 되지 않은 프로토콜을 사용 하 여 테스트 되었습니다. EEQs e 2의 7 농도의 각각에서 LacZ 값 (R2 값 ≥ 0.98)와 4-매개 변수 로지스틱 회귀를 사용 하 여 결정 했다. ND = 분석 결과의 검출 한계 아래.-= 손실된 복제.
| 시험 조건 | 모델 매개 변수 | ||||||
| 수용 체 | 기판 | 6 d 4 ° C에서 체포 | 모델 R2 | 성장 율 (LacZ 단위/ng/ml) | 굴절 지점 (ng/mL) | 낮은 우리 (LacZ 단위) | 위 점근 (LacZ 단위) |
| ERΑ | ONPG | 아니요 | > 0.99 | 8.548 ±1.633 | -0.512 ±0.025 | -1.623 ±4.408 | 128.11 ±6.31 |
| ERΑ | ONPG | 예 | > 0.99 | 7.618 ±0.758 | -0.587 ±0.014 | -8.378 ±2.223 | 99.53 ±2.528 |
| ERΑ | CPRG | 아니요 | > 0.99 | 8.256 ±2.182 | -0.610 ±0.033 | 0.853 ±3.333 | 62.52 ±3.473 |
| ERΑ | CPRG | 예 | > 0.99 | 5.068 ±0.616 | -0.523 ±0.022 | -3.147 ±1.946 | 68.06 ±3.069 |
| ERΒ | ONPG | 아니요 | > 0.99 | 1.041 ±2.004 | -0.898 ±4.410 | -32.98 ±86.62 | 248.6 ±778.9 |
| ERΒ | ONPG | 예 | > 0.99 | 4.327 ±1.289 | -1.736 ±0.087 | 4.654 ±3.087 | 66.37 ±10.75 |
| ERΒ | CPRG | 아니요 | 0.99 = | 5.673 ±1.764 | -1.914 ±0.052 | 3.925 ±1.679 | 28.05 ±2.334 |
| ERΒ | CPRG | 예 | > 0.99 | 4.412 ±1.142 | -1.894 ±0.051 | 2.052 ±1.303 | 22.64 ±2.047 |
테이블 3입니다. 매개 변수 4-매개 변수에 표준 곡선에 대 한 로지스틱 회귀 모델 그림 2. 두 기판, ONPG 및 CPRG, 누 룩 없이 고 17 h 부 화 후 6 일간 냉장 기간 1 2 인간 에스트로겐 수용 체 (ERα 또는 ERβ)의 표현을 사용 하 여 테스트 되었습니다. 매개 변수는 ±standard 오류 추정으로 보고 됩니다.
부록 1 LacZ 값 계산에 대 한 응용 프로그램. 응용 프로그램을 사용 하려면 먼저 다운로드 무료 자바 소프트웨어 ( 테이블의 자료에서 언급된). 다음 LacZ 응용 프로그램을 엽니다. 접시 레이아웃 응용 프로그램과 함께 사용 동일 접시 레이아웃 그림 1에 제시 해야 합니다. 일부 샘플 우물 사용 되지 않은 경우 빈 우물에서 흡 광도 신호는 LacZ 응용 프로그램에 붙여넣을 흡 광도 데이터 집합에서 자리 표시자로 유지 됩니다. 이 응용 프로그램에서 접시의 공간 레이아웃을 유지 하 고 그들의 원하는 위치에 미디어 컨트롤 웰 스는 되도록 합니다. 또한, 빈 셀이 응용 프로그램이 실행 되지 않습니다. (ONPG)에 대 한 OD405 읽기 또는 OD574 읽기 (CPRG)에 대 한 "컨트롤 (ctrl) + v" 키보드 명령을 사용 하 여 모든 우물의 붙여넣기 또는 "command + v를" 사용 하는 컴퓨터 플랫폼에 따라. 색상을 생산 하는 분석 결과 대 한 시간 에 부 화 시간을 입력 (단계 5.4;에서 40 분 예를 들어 0.66667 h). 다음을 클릭 합니다. 단계 5.3에서에서 OD610 독서에 붙여 넣으십시오. 전송을 클릭 합니다. LacZ 결과 표시 될 것 이다 그리고 "컨트롤 (ctrl) + c"를 누르거나 "명령 + c"는 사용 중인 컴퓨터 플랫폼에 따라 복사할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
부록 2 EEQs 계산 통계 소프트웨어 옵션. EEQs 세 가지 표시 옵션 중 하나를 사용 하 여 계산할 수 있습니다. 1을 사용 하 여에 대 한 방향입니다. JMP 소프트웨어 또는 2입니다. R 코드는 부록 2에 제공 됩니다. R 코드 또한 3으로 변환 되었습니다. https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/에서 사용할 수 있는 응용 프로그램 형식입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
부록 3 데이터 수집 기질으로 효 모 그 표현 ERα와 CPRG를 사용 하 여 샘플. 측정610 명이 각각 7 E2 표준, 차량 및 미디어 컨트롤,574 명이 하 고 단일 대표 주치의 샘플 계산된 LacZ 값과 함께 포함 되어 있습니다. 표준의 LacZ 값 단계 7A에 설명 된 대로 표준 곡선의 4-매개 변수 로지스틱 회귀 모델을 만드는 데 사용 되었다 & 위 B. 모델 미 판 우물에서 ng/mL에서 대표 하는 샘플의 EEQs의 triplicate 견적 보간에 사용 되었다. 이러한 값 다음 EEQs 샘플 (단계 8.1)의 ng/g로 변환 했다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
토론
예 물, 음식, 식물 조직, 개인 케어 제품 등 환경 샘플에서 estrogenic ligands를 검출 하는 데 사용 하는 저렴 한 비용 방법입니다. 데이터 되 게 여기 비교 2 에스트로겐 수용 체 (ERα 및 ERβ), 2 기질 (ONPG 및 CPRG), 그리고 2 타임 라인 (냉장 없이 2 d 프로토콜)과 7 일 프로토콜 냉장 예 분석 결과 통해 퍼스널 케어 제품에 estrogenicity를 측정. 한 번만 만족 하는 학부 실험실 과정에 의해 부과 된 또한 시간 제약와 호환 되는 동안 7 d 냉장된 프로토콜 사용 하 여 CPRG 및 ERα 및 ERβ를 가장 잘 표현 하는 효 모 EEQs 단정 / 여러 h 주. 사실, 냉장 없이 2 d 분석 결과에 비해, 7 일간 냉장된 분석 결과와 연관 되었다 감소 분산 판 복제에 걸쳐. 또한, 표준 곡선의 선형 부분 약간 냉장된 분석 결과 사용 하 여 수집 된 데이터에 대 한 확장 되었다. 표준 곡선의 선형 부분 분석 결과 검색 범위를 정의 하 고 샘플 EEQs 보간 하는 데 사용할 수 있는 표준 곡선의 유일한 부분입니다.
테스트 샘플 중 하나를 제외한 모든, CPRG를 사용 하 여 측정 하는 EEQs ONPG와 정량 보다 낮은 했다. 와 높은 멸종 계수 및 낮은 Km V최대, CPRG ONPG17보다 10 배 더 과민 하다. 따라서, CPRG 더 낮은 농도에서 사용할 수 있습니다 그리고 β-galactosidase의 낮은 금액을 감지 하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 이유로 CPRG ONPG,1819통해 일반적으로 기본 설정입니다. 그러나, 큰 기판 감도 낮은 EEQ 값 CPRG을 검색 설명 하지 않는다. 다른 저자2,18에 의해 설명 했 듯이 ONPG 발견 높은 EEQ 값 분석 결과, 매트릭스 방해가 때문일 수 있었다. 퍼스널 케어 제품 추출 물에서 노란 안료 ONPG 감지 하는 EEQ 값을 부 풀 려 수 있습니다. 다른 그들의 실험 디자인2, 실험에 있는 격판덮개의 수를 두 배로 하는 방법에에서 안료 컨트롤을 포함 하 여이 문제를 피할 수 있다. 매트릭스 간섭 문제가 있을 수 있습니다, 비록 더 비싼 ONPG 보다 긴 부 화 시간을 요구 한다 CPRG 예 분석 결과 대 한 바람직 기판 될 수 있습니다. 또한, β-galactosidase에 의해 기판의 분열에 의해 유도 된 색상 변경 쉽게 결과 시각화 하기 위해 학생 들을 위한 CPRG와 함께 더 극적 이다.
밀러 외. (2010), 누가이 프로토콜에 사용 되는 누 룩을 설계, 표현 ERβ 30 x 17β estradiol ERα, 우리의 데이터14에 의해 입증 발견을 표현 하는 효 모 보다 더 민감한 했다 그 누 룩을 지적 했다. 플라스 미드 건설, 밀러 그 외 여러분 에서 잠재적인 뉘앙스를 제외 하 고 (2010 년) 감도14에이 차이 설명할 수. 한 차이 두 플라스 미드 구조 ERβ 식 포도 당 또는 갈 락 토스에 의해 규제 됩니다 반면 ERα 식 갈 락 토스에 의해 통제 된다 이다. 예 시험에 사용 된 효 모 포도 당 미디어에서 교양 있으며 그들이 분석 결과의 시작에서 희석 하 때만 갈 락 토스를 주어진. 따라서, ERβ을 표현 하는 효 모 복사본 수가 수용 체 단백질 estrogenic ligands에 높은 감도 부여 함으로써 분석 결과의 시작 이전에 축적 수 있습니다.
ERα 표현 효 낮은 감도 감지 ERα ERβ와 비교 측정 샘플에서 estrogenicity의 더 높은 속도 설명할 수 있다. 가능성을 증가 하는 샘플 EEQs 검색 됩니다, 사용자 수 다른 추출 용 매 및 방법 또는 높은 볼륨 샘플의 누 룩을 추가. 높은 샘플 볼륨을 사용 하는 경우는 같은 양의 표준 및 샘플 분석 결과에 사용할 수 있습니다 표준 E2의 농도 조정 되어야 한다. 더 많은 샘플을 추가 한 한계 효 모 30 대 35 ° C20의 외피 온도에 더 나은 공차와만 6-10%의 에탄올을 참을 수입니다. 효 모에 에타 놀의 효과 제어 하려면 조사 triplicate "효 모 만" 웰 스 플레이트 레이아웃을 고이 "효 모 만" 웰 스의 OD610 즉시 비교 차량 제어 우물의 OD610 은 확인 후에 LacZ 버퍼의 추가. 또는, 에탄올에 용 해 하는 샘플 건조 microwell 접시와 효 모 추가 되기 전에 떨어져 증발 하는 에탄올에 추가할 수 있습니다. Dimethylsulfoxide (DMSO)는 또한 사용 예에 예제 용 매 분석 실험, 하지만 효 모와 DMSO의 최종 작업 농도 112에 국한 되어야 합니다.
예 시험 환경 샘플에서 estrogenicity을 탐지 하기 위한 강력한 검사 도구입니다. 특히, 예 진 식14를 에스트로겐 응답 요소와 상호 작용 하는 핵 스 트로 겐 수용 체를 바인딩하는 ligands를 감지 합니다. 그러나, 예는 또한 중요 한 제한이 있습니다. 예에 스 막 에스트로겐 수용 체 등 비 핵 메커니즘 또는 활성 제 단백질 1 (AP-1) 녹음 방송 요인에와 같은 추가 요소를 포함 하는 메커니즘을 통해 작동 하는 검색 하지 않습니다. 또한, 효 모 하지 않아도 동일한 대사 용량 포유류 세포로, 때문에 예 estrogenic 되도록 신진 대사 활성화를 필요로 하는 ligands를 검색할 수 없습니다.
또한, 예 분석 결과 구별할 수 없습니다 쉽게 복잡 한 샘플에서 estrogenic 및 안티 estrogenic ligands. 대신, net estrogenicity estrogenic 안티 estrogenic ligands의 합계 효과 측정 합니다. ER 길 항 근의 농도 정량 또는 혼합물의 금지 활동을 평가, 분석 결과 표준 길 항 제 (17β-estradiol)와 다양 한 테스트 샘플 농도12효 모 배양 하 여 수정할 수 있습니다. 이 프로세스 샘플에 길 항 근 주 작동 근 유도 기자 활동을 점감 할 수 있다 하는 경우를 결정 하 고 샘플에서 응급실 길 항 근의 존재를 식별 하는 데 유용한 화면을 제공 합니다.
일부 샘플 추출 및 샘플 준비 단계를 수정 해야 할 수도 있습니다 있지만 여기에 제시 된 프로토콜 샘플 형식의 다양 한을 수용할 수 있습니다. 예를 들어 EEQs 중 널리 다양 한 몇 가지 개인 케어 제품의 복제. 더 가변 샘플 기름 작은 물방울을 포함 하는 경향이 나 그렇지 않으면 하지 완전히 균질, 나타내는 diethyl 에테르 같은 더 질 성 용 매 도움이 될 것 이다. 또는 오일과 왁 스 퍼스널 케어 제품에 샘플 100% 에탄올 대신 50% 에탄올으로 추출 하 여 제외 될 수 있습니다.50% 에탄올 추출 더 많은 수용 estrogenic ligands (예를 들어, 일부 안료) 캡처할 것입니다. 그러나, 50% 에탄올 100% 에탄올 보다 더 느리게 증발 하 고 따라서 추출 시간을 확장할 수 있습니다. 또한, (비누) 등 일부 샘플 했다 감소 셀 밀도 측정 (OD610)에서 발생 하는 효 모 세포 독성. 여우 외. (2008) 같은 샘플 희석 하 고 셀 밀도 차이 차량 제어 웰 스12에 비해 30%를 초과 하는 경우 다시 테스트 해야 좋습니다.
예 시험 분석 연구 목적으로 사용 하는 경우 샘플 풀의 희석 곡선 선제 추출 단계 4.5에서에서 누 룩을 추가할 수의 적절 한 볼륨을 결정 하기 위해 테스트할 수 있습니다. 또는, 추출 물 시험 될 수 있다 동시에 여러 볼륨 (예:5 µ L, 20 µ L 추출 단계 4.5에서에서 효 모에 추가) 또는 주문 크기 (예를 들어, 0.2 µ L, 2 µ L, 및 20 µ L)에 걸쳐 있는 희석. "적절 한" 볼륨 추출의 표준 곡선의 선형 부분을 따라 LacZ 값을 일치 하 여 estrogenicity를 식별 하는 있습니다. 최적화는 효 모 세포 독성, false 네거티브, 또는 표준 곡선을 초과 하는 estrogenicity 등을 너무 많이 또는 너무 작은 샘플을 추가 하 여 발생 하는 문제를 방지할 수 있습니다. 위에서 설명 했 듯이, ligand의 다른 양의 효 모는 접시에 걸쳐 일관 된 볼륨 및 농도의 에탄올 또는 다른 차량에 노출 되도록 사용 하는 경우 샘플 및 E2 표준의 볼륨을 조정 합니다.
False 네거티브를 위한 잠재력에도 불구 하 고 예 분석 결과 확인 되었습니다 계층 3 테스트 도구로 내 분 비 분리기에 대 한 Schug 그 외 여러분 에 의해 (2013), 누가 내 분 비 장애 (TiPED)21에 대 한 포괄적인 계층 프로토콜을 개발. 학부 교육에 대 한 분석 결과 내 분 비 장애, 세포 배양, 수용 체 바인딩, 효소 활동, 유전 공학, 통계, 그리고 실험 설계에 관련 된 개념을 교육에 대 한 유용 합니다. 분석 결과 사용 하 여 학생 또한 직렬 표준; diluting 등 근본적이 고 광범위 하 게 적용 가능한 실험실 연습 추출 샘플; 만드는 솔루션; 구성 하 고 표준 곡선; 보간 계산 농도; 만드는 솔루션; 시연 메 마른 기술; 배양 세포; 식별 하는 변수 및 컨트롤; 수집, 조직, 및 데이터 분석 구성 하 고 해석 그래프; 그리고 micropipettors, 광 등 일반적인 실험실 장비를 사용 하 여.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 프로젝트는 시작 자금 TME 및 AMR 루이지애나 기술 대학, Furman 대학에서 각각에 의해 투자 되었다. AMR 및 국립 과학 재단 그리고 루이지애나 Regents 보드에서 TME 여행 수상에서 TME 루이지애나 EPSCoR Pfund 그랜트, 남쪽의에 관련 된 대학에서 TME 2015 교수 발전 보조금에 의해 제공 된 추가적인 자금에 남쪽의 대학입니다. 우리 감사 박사 데이비드 Eubanks (Furman) 통계 분석 및 씨 크리스토퍼 무어에 대 한 "우리에 게 주는 손을" 촬영 하는 동안.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Vortex Mixer (단일 또는 다중 튜브용) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | 모든 믹서로 충분합니다. |
| 버킷 원심분리기 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | 4000rpm에서 원추형 튜브를 원심분리할 수 있는 경우 모든 버킷 원심분리기로 충분합니다. |
| 분젠 버너 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | 모든 분젠 버너로 충분하거나 알코올 버너(Fisher Scientific 04-245-1)를 대신 사용할 수 있습니다. |
| 인큐베이터 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | 30°C를 유지할 수 있는 경우 모든 인큐베이터로 충분합니다. |
| 마이크로플레이트 리더 | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | 405, 574 및 610 nm의 파장에서 흡광도를 측정할 수 있는 경우 다른 브랜드의 플레이트 리더로 충분합니다. |
| Gen5 마이크로플레이트 리더 및 이미저 소프트웨어 | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | 필요한 소프트웨어는 플레이트 리더의 제조업체 및 모델에 따라 다릅니다. GEN5 소프트웨어는 BioTek 플레이트 리더와 함께 사용하도록 고안되었습니다. |
| 냉장고 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | 4°C를 유지할 수 있는 경우 모든 냉장고로 충분합니다. |
| 1 - 10 mL 혈청학 피펫과 호환되는 피펫터 또는 PipetAid | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | 1 및 10 mL 혈청학 피펫과 호환되는 경우 모든 피펫터로 충분합니다. |
| P10 마이크로피펫터 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | 5 마이크로를 분주할 수 있는 경우 모든 마이크로피펫터로 충분합니다. |
| P200 마이크로파이펫터 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | 최대 200μm까지 분주할 수 있는 경우 모든 마이크로파이펫으로 충분합니다. |
| P300 멀티채널 피펫 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | 50 - 205 &m.l.l를 분주할 수 있는 경우 모든 멀티채널 피펫터로 충분합니다. |
| 리피터 | 피펫 Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | 100 - 320 &마이크로를 전달할 수 있어야 합니다. l; 이 피펫터는 멀티채널 피펫터를 대신 사용할 수 있기 때문에 선택 사항입니다. |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Supplies | |||
| Sterile 15 mL conical tubes with caps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
| 유리 섬광 바이알 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
| 폴리스티렌 96-well, 뚜껑이 있는 평평한 바닥 마이크로플레이트(비멸균) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
| 폴리프로필렌 96웰, 뚜껑 없는 평평한 바닥 마이크로플레이트 | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
| 100mL 유리 비커 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | 고압멸균이 가능한 경우 모든 유리 비커로 충분합니다. |
| 250 mL 유리 삼각 플라스크 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | 모든 유리 삼각 플라스크는 오토클레이브가 가능한 경우 충분합니다. |
| 멸균, 접착성, 다공성 필름 | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
| 금속 집게 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | 모든 금속 집게로 충분합니다. |
| 시약 저장 탱크 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
| 여과 장치 (0.2 µ m) | 피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
| 분출 병 (에탄올 용) | 피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com) | 02-897-10 | 모든 실험실 분출 병으로 충분합니다. |
| 오토클레이브 저장 병 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | 모든 오토클레이브 유리 저장 병으로 충분합니다. |
| 10 mL 유리 혈청학적 피펫 (멸균) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | 모든 유리 혈청학적 피펫으로 충분합니다. |
| 1 mL 유리 혈청학 피펫 (멸균) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | 모든 유리 혈청학 피펫으로 충분합니다. |
| P10 마이크로피펫터 팁 | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | 위의 마이크로피펫터와 호환되는 경우 모든 팁으로 충분합니다. |
| P200 마이크로피펫터 팁 | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | 위의 마이크로피펫터와 호환되는 경우 모든 팁으로 충분합니다. |
| P300 마이크로피펫 팁 | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | 위의 마이크로피펫터와 호환되는 경우 모든 팁으로 충분합니다. |
| 반복 피펫터를 위한 주사기 팁 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | 연발 피펫터를 사용하는 경우에만 필요합니다. |
| 멸균 페트리 접시 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | 모든 멸균 페트리 접시로 충분합니다. |
| Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Yeast | |||
| Saccharomyces cerevisiae 균주(예: /em, W303a) | American Type Culture Company(ATCC) () | MYA-151 | 재조합 효모도 저자의 요청에 따라 사용할 수 있습니다. |
| ER&알파에 대한 수용체/리포터 플라스미드; | 애드진 (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (플라스미드 #23061) | |
| ER&beta에 대한 수용체/리포터 플라스미드; | 애드진 (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (플라스미드 #23062) | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| Chemicals | |||
| Difco 한천 | BD (www.bd.com) | 214530 | |
| 주의: Dithiothreitol은 급성 피부와 눈 자극제입니다. 적절한 개인 보호 장비(장갑, 흄 후드, 방진 마스크)를 사용하여 피부와 눈의 접촉, 흡입 및 섭취를 피하십시오. | |||
| 오르토 니트로 페닐 -&베타 ; -D- 갈락 토피라 노사이드 | 시그마 (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
| 클로로 페놀 레드 -&베타 ; -D- 갈락 토피라 노사이드 | 시그마 (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
| 효모 질소 염기 | 시그마 (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
| 포도당 | 시그마 (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
| 갈락토스 | 시그마 (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
| 아데닌 황산 | 염 시그마 (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
| 우라실 | 시그마 (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
| 류신 | 시그마 (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
| 히스티딘 | 시그마 (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
| 17 β-Estradiol& 주의; | 시그마 (www.sigmaaldrich.com) MP 바이오메디컬 | E8875-250 마그네슘 0219456401 - 1 mg | 주의: 에스트라디올은 발암 물질 및 생식 독성이 의심되는 물질입니다. 흡입, 삼키거나 피부를 통해 흡수되면 해롭습니다. 에스트라디올은 모유를 먹는 어린이와 태아에게 해를 끼칠 수 있습니다. 에스트라디올은 수생 생물에 매우 유독합니다. 적절한 개인 보호구(장갑, 흄 후드, 방진 마스크)를 사용하고 임신 및 수유 중에는 노출을 피하십시오. 에스트라디올은 유해 폐기물로 처리해야 하며 환경에 방출되어서는 안 됩니다. |
| 100% 에탄올 | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
| 인산나트륨 일염기성 일수화물 | 시그마(www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
| 인산나트륨이염기성(무수) | 시그마(www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
| 염화마그네슘 | 시그마(www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
| 염화 | 칼륨시그마 (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
| 사르 코실 (N- 라우로 일 사르코신 나트륨 염) | 시그마 (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
| 탄산 나트륨 | 시그마 (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| 소프트웨어 | |||
| Excel 스프레드시트 소프트웨어 | Microsoft | Excel은 데이터 출력을 관리하고 R 분석을 위한 .csv 파일을 생성하는 데 편리한 스프레드시트 소프트웨어입니다. | |
| Java 소프트웨어(부록 1 응용 프로그램에 필요) | Oracle Corporation | 부록 1의 응용 프로그램을 사용하여 LacZ 값을 계산하려면 먼저 무료 Java 소프트웨어(https://www.java.com/en/download/)를 다운로드한 다음 부록 1에서 LacZ 응용 프로그램을 엽니다. 응용 프로그램에서 만든 LacZ 결과는 PC 키보드에서 "control (ctrl) + c"를 누르거나 Mac 키보드에서 "command + c"를 눌러 복사 할 수 있습니다. | |
| JMP 통계 소프트웨어 버전 13.0.0 | SAS Institute | 부록 2에는 JMP를 사용하여 LacZ 데이터를 4개 매개변수 로지스틱 회귀 곡선에 맞추는 지침이 포함되어 있습니다. 곡선은 에스트라디올 표준 곡선을 기준으로 테스트 샘플 에스트라디올 등가물(EEQ)을 보간하는 데 사용됩니다. | |
| R 통계 컴퓨팅 및 그래픽 소프트웨어 | R Foundation | Free R 소프트웨어는 https://www.r-project.org/. 에서 다운로드 할 수 있습니다. R을 사용하여 LacZ 데이터를 4개 매개 변수 로지스틱 회귀 곡선에 맞추기 위한 지침과 코드는 부록 2에 나와 있습니다. |
참고문헌
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- Schug, T. T., et al. Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals. Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).
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