생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

Peter Szaraz; Yarden S. Gratch; Farwah Iqbal; Clifford L. Librach

doi:10.3791/55757

방법 논문

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

DOI:

10.3791/55757

⸱

2017년 8월 9일

Peter Szaraz^*¹^,² , Yarden S. Gratch^*¹ , Farwah Iqbal¹^,² , Clifford L. Librach¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Create Fertility Centre, ²Department of Physiology, University of Toronto, ³Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, ⁴Department of Physiology, University of Toronto, ⁵Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

초록

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심근 경색과 이후 허 혈 성 캐스케이드 congestive 심장 마비, 전세계 사망률의 주요 원인으로 이어지는 cardiomyocytes의 광범위 한 손실 될. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 현재, 침략 적 기술을 대체 하 세포 기반 치료를 위한 유망한 옵션입니다. MSCs 엽 계보, 심장 세포 유형, 등으로 분화 할 수 있다 하지만 기능 세포로 완전 한 차별화가 아직 달성 하지. 차별화의 이전 방법 약리학 대리인 또는 성장 요인에 근거 했다. 그러나, 더 순수 관련 전략 cardiomyogenic 변환을 MSCs를 사용할 수도 있습니다. 여기, 우리가 cardiomyocyte 같은 계약 셀 생산 cardiomyocyte 급지대 레이어에 MSC 집계를 사용 하 여 차별화 방법 제시.

인간 탯 줄 혈관 주위 세포 (HUCPVCs) 보다 잠재적인 큰 차별화를가지고 표시 되었습니다 일반적으로 MSC 종류, 골 MSCs (BMSCs) 등을 조사. Ontogenetically 젊은 소스로 서, 우리는 이전 소스에 비해 첫 삼분기 (FTM) HUCPVCs의 cardiomyogenic 잠재력 조사. FTM HUCPVCs는 그들의 utero immunoprivileged 속성 경작 하는 때 유지 하는 MSCs의 소설, 풍부한 소스 생체 외에서. 이 분화 프로토콜, FTM 및 용어를 사용 하 여 (즉, myocyte 증강 2 C, 심장 분 T, 무거운 체인 심장 myosin, 신호 규제 단백질 α, 비율과 connexin 43) cardiomyocyte 마커의 증가 식에 표시 된 대로 HUCPVCs BMSCs에 비해 크게 증가 cardiomyogenic 차별화를 달성. 그들은 또한 그들의 더 낮은 HLA A 식 및 높은 HLA-G 식 시연으로 상당히 낮은 immunogenicity를 유지. 잠재력과 셀 클러스터 심장 급지대 레이어에 공동 문화의 1 주 안에 계약, 그렇게 할 첫 번째 MSC 종류 되 고 생성 된 집계 기반 차별화 적용, FTM HUCPVCs 증가 집계 형성을 보였다.

우리의 결과이 차별화 전략 효과적으로 FTM HUCPVCs 같은 젊은 MSCs의 cardiomyogenic 잠재력을 활용 하는 체 외에서 사전 차별화 그들의 재생 효능 비보를 증가 하는 잠재적인 전략 될 수 보여줍니다.

서론

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심부 전 (CHF) 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인으로 지속합니다. CHF는 종종 cardiomyocytes의 대규모 손실과 심근 경색 (MI)¹의 병 적인 결과로 흉터 조직 세포 무료의 개발에 따라 발생 합니다. 마음은 부분적으로 자체 갱신 기관, 풍요로 움과 노인된 환자에서 종종 손상 후 복구에 대 한 부족 한 되는 기능에 거주 줄기와 조상 세포 수영장 크게 조직 재생을 실행에 대 한 책임 감소 한다. 따라서, 손상 된 심근으로 건강 한 기증자 세포의 이식 관련 된 실험적 치료 개발에 큰 관심이입니다. 그것은 기증자 세포 조직, 구조를 복원 뿐만 아니라 또한 영향을 받는 심근의 기능 회복을 달성.

기본 심장 심장 조직-거주자를 고용 하 고 생 골 수 유래 줄기 세포 후 부상에 대 한 복구²^,^,³⁴. 재생 세포 호스트 및 기증자 파생 모두 해야 합니다 적절 한 표현 형 및 효율적이 고 안전 하 게 손실 된 세포를 대체 하는 능력과 함께 개장 심근의 microenvironment에서 기능 능력을가지고. 차별화 방법 체 ....

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프로토콜

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동물을 대상으로 한 모든 연구는 ARRIVE 지침에 따라 수행 및 보고되었습니다⁴⁸. 모든 연구는 기관 연구 윤리 위원회의 승인(REB 번호 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, 토론토 대학교, 토론토, 캐나다). 모든 동물 절차는 University Health Network(캐나다 토론토)의 동물 관리 위원회의 승인을 받았으며 모든 동물은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8^판(National Institutes of Health 2011)에 따라 인도적인 치료를 받았습니다.

1. 조직 배양

배양 FTM HUCPVC, 용어 HUCPVC(이전에 확립됨, 각각에 대해 3개의 독립적인 라인≥⁴² 및 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 칵테일이 보충된 알파 최소 필수 배지(MEM)의 시판되는 BMSC입니다. Dulbecco의 Modified Eagle 배지에서 배양 쥐 1차 심근세포 및 MSC-심근세포 공동 배양: 10% FBS 및 1% P/S.
를 함....

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결과

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HUCPVC는 BMSC에 비해 더 높은 응집체 형성 전위와 CD49f 발현 수준을 나타냅니다.

hMSC(즉, FTM HUCPVC, HUCPVC 및 BMSC)의 분화를 유도하기 위해 미분화 MSC 또는 MSC 함유 행잉 드롭(표 1)의 단일 세포 현탁액을 랫드 1차 심근세포 단층으로 옮겨 각각 직접 공동 배양 또는 응집 공동 배양을 확립했습니다. 세 가지 다른 MSC 유형은 직접 공동 배양에서 유사한 풍부함과 출현을 보였습니다(그림 1A). 응집체 공동 배양에서 매달린 방울을 심장 세포에 옮긴 후 2-3일 후(표 1), FTM 및 용어 HUCPVC는 BMSC(180μm ± 30.......

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토론

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줄기 세포의 심근 분화 MSC 소스에서 cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하는 데 사용 되 고 여러 가지 다른 전략으로 2 년간 개발 되었습니다. 그러나 이러한 전략은,, 많은, 고 사용 조건이 자주 하지는 환경 이식 세포 발생에서 vivo에서의 대표.

기존의 방법 달리 여기에 제시 된 프로토콜 기본 심장 급지대 레이어 및 MSC 집계 형성의 조합을 사용 합니다. 기본 심장 급지대 레이어는 hMSCs 이식 시에 노출 되는 것과 유사한 차별화 환경을 제공. 집계 생성 그라디언트와 산소와 영양소, 혈통 헌신 시작에 유도 영향을 미칠 수 있는 환경. Hypoxic 늘어진 사용 하 여 PSC 및 ESC 기반 심장 차별화 전략 및 집계 형성 줄기 세포⁵^,^,⁵²⁵³에이 유도 효과 설립 했다. 또한, .......

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공개 사항

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닥터 클 리 포드 L. Librach는 특허의 공동 소유자: 격리의 첫 번째 임신 탯 조직에서 파생 된 셀의 사용 방법, 캐나다와 호주에 부여.

감사의 글

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저자는 다음 직원을 감사 하 고 그들의 공헌에 대 한 인사를 연구: 매튜 Librach, 라일라 Maghen, 타 냐 A. Baretto, Shlomit Kenigsberg, 그리고 앙드레 Gauthier 피셔. 이 작품은 온타리오 연구 기금-연구 우수성 (ORF-다시, 라운드 #7)과 만드는 프로그램 i n c.에 의해 지원 되었다

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신/EDTA	Gibco	25200056	세포 해리용
Alpha-MEM	Gibco	12571071	HUCPVC 및 BMSC 배양 배지용.
PE 결합 항인간/마우스 CD49f 항체	Biolegend	313612	Integrin 마커
	FC		Connexin 43 마커
	Genway Biotech Inc.	GWB-66FBD2	원성 마커
	Abcam	ab7904	FC
FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a 항체	AbD Serotec/Bio-Rad	MCA2518F	에 대한 심장 마커
	R& FC	및 FACS
FITC 결합 인간 TRA-1-85/CD147 항체	R& FC	및 FACS
Anti-connexin 43/GJA1 항체	Abcam	ab11370	. ICC
염소 항토끼 IgG(H+L) 교차 흡수 2차 항체, Alexa Fluor 555	Life Technologies	A-21428	ICC
항육종 알파 액티닌[EA-53] 항체	Abcam	ab9465	aSARC. ICC
Goat anti-mouse IgM 중쇄 교차 흡수 2차 항체, Alexa Fluor 555	Life Technologies	A-21426	ICC
Mef2C(D80C1) XP 토끼 항체	New England BioLabs Ltd.	5030S	ICC
당나귀 항 토끼 IgG (H + L) 2 차 항체, Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-21206	ICC
Anti-nuclei (HuNu) (클론 235-1) 항체	EMD Millipore	MAB1281	ICC
MZ9.5 실체 현미경	Leica		이미징 골재.
1.5ml 원심분리기 마이크로튜브	Axygen	MCT-150-C	형광 염료로 MSC를 염색합니다.
ImageJ			오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어.
아리아 II			UHN SickKids FC 시설. 셀 정렬용.
골수 중엽 기질 세포	Lonza	PT-2501	BMSC,
소 혈청 알부민	시그마-알드리치	A7030-100G	, BSA. ICC
BrdU	EMD Millipore		MAB3424 주의: BrdU는 강력한 기형 유발 물질이며 돌연변이 유발 물질이 의심됩니다. 사용하기 전에 적절한 교육을 받고 SDS를 참조하십시오.
Canto II	BD		UHN SickKids FC 시설. 유세포 분석용.
cDNA EcoDry Premix	Clontech/Takara	639570	에 대한 cDNA 준비

		C10227
DMEM-F12	세포 계수 Sigma-Aldrich	D6421	쥐 1차 심근 세포 배양 배지용.
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	Gibco	10010023	D-PBS, Ca²⁺, Mg²⁺
EVOS	없음 Life Technologies		사내 형광 현미경
FACSCalibur	BD		사내. 유세포 분석용.
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IDT 프라임 타임 qPCR 프로브	통합 데이터 기술	FAM 형광단	http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor 수성 장착 매체	ThermoScientific	TA-030-FM	거치는 세포 저장용
;			UHN SickKids FC 시설. 유세포 분석용.
MoFlo Astrios	Beckman Coulter		UHN SickKids FC 시설. 셀 정렬용.
일반 염소 혈청	세포 신호 전달 기술	5425S	NGS. ICC
Nunc Lab-Tek II 챔버 커버 유리, 8-웰	Thermo Scientific Nunc	155409	용 시료 준비
			ICC
파라포름알데히드, 16% 용액, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710	ICC용 세포 고정용
페니실린/스트렙토마이신	Gibco	15140122	세포 배양 배지의 구성 요소.
프라이머	Sigma	Custom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μ mol	CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
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Trypsin	Gibco 272500108		세포 해리용
Volocity	Perkin-Elmer	Volocity 6.3	이미징 소프트웨어
0.2 μ m 기공 필터	Thermo Fisher Scientific	566-0020	조직 배양 배지 살균용
HERAcell 150i CO₂ 인큐베이터	Thermo Fisher Scientific	51026410	세포 배양용
Dulbecco의 인산염 완충 식염수	Sigma-Aldrich	D8537	PBS. 1X, 염화칼슘 및 염화마그네슘 미포함
집게	Almedic	7727- A10-704	쥐 심장을 나눠주기 위해. 유사한 집게를 사용할 수 있습니다.
가위	Fine Science Tools	14059-11	쥐 심장 다지기용. 곡선 가위를 권장합니다.
50 mL 튜브	BD Falcon	352070	심근세포 채취 및 일반 조직 배양 절차 중 채취용
15 mL 튜브	BD Falcon	352096	일반 조직 배양 절차용
6웰 플레이트	Thermo Scientific Nunc	CA73520-906	조직 배양용
10cm 조직 배양 접시	Corning	25382-428	응집체 형성용
Axiovert 40C 현미경	Zeiss		조직 배양 및 프로토콜의 나머지 부분을 통한 명시야 이미징 70
μ m cell strainer	Fisherbrand	22363548	유세포 분석 또는 분류 전 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해
Triton X-100	EMD Millipore	9410-1L	투과화 용액에 사용
	Thermo Fisher Scientific	H1399	Stain은 Cx43 국소화 시각화 중에 사용됩니다

FC APC 결합 인간 Cx43/GJA1 항체 R&를 위한 ; FITC 결합 HLA-A2 항체에 대한 D Systems FAB7737A FC FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] 항체에 대한 면역 FC APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 항체에 대한 D Systems FAB3195A 인간 세포 마커 Cx43에 대한 D Systems FAB3195F 인간 세포 마커 BD , , , 에 대한 용액을 준비하려면 qPCR CellTracker Green, CMFDA Dye, Life Technologies C7025, 세포 세포질의 형광 이미징, Countess 자동 세포 계수기, Invitrogen Inc.용 ICC LSR II 를 BD ICC OmniPur Triton X-100 계면활성제 EMD Millipore 9410-OP 투과 용액 준비 샘플에 사용됩니다. 미니 키트 qPCR Rotor-Gene SYBR Green PCR 키트를 ICC Hoechst 33342의 .

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P.

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