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방법 논문

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

10.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55757

⸱

2017년 8월 9일

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 우리는 기능, 계약, cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하기 위해서는 인간 중간 엽 줄기 세포의 젊은 소스의 심장 감 별 법 잠재력을 효율적으로 활용 하는 방법을 제시 생체 외에서.

초록

심근 경색과 이후 허 혈 성 캐스케이드 congestive 심장 마비, 전세계 사망률의 주요 원인으로 이어지는 cardiomyocytes의 광범위 한 손실 될. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 현재, 침략 적 기술을 대체 하 세포 기반 치료를 위한 유망한 옵션입니다. MSCs 엽 계보, 심장 세포 유형, 등으로 분화 할 수 있다 하지만 기능 세포로 완전 한 차별화가 아직 달성 하지. 차별화의 이전 방법 약리학 대리인 또는 성장 요인에 근거 했다. 그러나, 더 순수 관련 전략 cardiomyogenic 변환을 MSCs를 사용할 수도 있습니다. 여기, 우리가 cardiomyocyte 같은 계약 셀 생산 cardiomyocyte 급지대 레이어에 MSC 집계를 사용 하 여 차별화 방법 제시.

인간 탯 줄 혈관 주위 세포 (HUCPVCs) 보다 잠재적인 큰 차별화를가지고 표시 되었습니다 일반적으로 MSC 종류, 골 MSCs (BMSCs) 등을 조사. Ontogenetically 젊은 소스로 서, 우리는 이전 소스에 비해 첫 삼분기 (FTM) HUCPVCs의 cardiomyogenic 잠재력 조사. FTM HUCPVCs는 그들의 utero immunoprivileged 속성 경작 하는 때 유지 하는 MSCs의 소설, 풍부한 소스 생체 외에서. 이 분화 프로토콜, FTM 및 용어를 사용 하 여 (즉, myocyte 증강 2 C, 심장 분 T, 무거운 체인 심장 myosin, 신호 규제 단백질 α, 비율과 connexin 43) cardiomyocyte 마커의 증가 식에 표시 된 대로 HUCPVCs BMSCs에 비해 크게 증가 cardiomyogenic 차별화를 달성. 그들은 또한 그들의 더 낮은 HLA A 식 및 높은 HLA-G 식 시연으로 상당히 낮은 immunogenicity를 유지. 잠재력과 셀 클러스터 심장 급지대 레이어에 공동 문화의 1 주 안에 계약, 그렇게 할 첫 번째 MSC 종류 되 고 생성 된 집계 기반 차별화 적용, FTM HUCPVCs 증가 집계 형성을 보였다.

우리의 결과이 차별화 전략 효과적으로 FTM HUCPVCs 같은 젊은 MSCs의 cardiomyogenic 잠재력을 활용 하는 체 외에서 사전 차별화 그들의 재생 효능 비보를 증가 하는 잠재적인 전략 될 수 보여줍니다.

서론

심부 전 (CHF) 병 적 상태와 사망률 전세계의 주요 원인으로 지속합니다. CHF는 종종 cardiomyocytes의 대규모 손실과 심근 경색 (MI)1의 병 적인 결과로 흉터 조직 세포 무료의 개발에 따라 발생 합니다. 마음은 부분적으로 자체 갱신 기관, 풍요로 움과 노인된 환자에서 종종 손상 후 복구에 대 한 부족 한 되는 기능에 거주 줄기와 조상 세포 수영장 크게 조직 재생을 실행에 대 한 책임 감소 한다. 따라서, 손상 된 심근으로 건강 한 기증자 세포의 이식 관련 된 실험적 치료 개발에 큰 관심이입니다. 그것은 기증자 세포 조직, 구조를 복원 뿐만 아니라 또한 영향을 받는 심근의 기능 회복을 달성.

기본 심장 심장 조직-거주자를 고용 하 고 생 골 수 유래 줄기 세포 후 부상에 대 한 복구2,,34. 재생 세포 호스트 및 기증자 파생 모두 해야 합니다 적절 한 표현 형 및 효율적이 고 안전 하 게 손실 된 세포를 대체 하는 능력과 함께 개장 심근의 microenvironment에서 기능 능력을가지고. 차별화 방법 체 외에서 높은 효율, 줄기 세포 기반 cardiomyocyte 생산5,6을 달성 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 심장 혈통 마커의 식 프로필 심장 계보7으로 줄기 세포 분화 과정을 정의 하는 데 사용 됩니다. 초기 분화 마커, NKX2.5, myocyte 증강 인자 2 C 등 (Mef2c), 및 GATA48,9, cardiomyogenic 프로세스의 개시의 표시 될 수 있습니다. 성숙한 cardiomyocyte 마커 차별화 효능을 평가 하기 위해 일반적으로 사용 되 있으며 신호 규제 단백질 α (SIRPA)10, 심장 분 T (cTnT)11, 무거운 체인 심장 myosin (MYH6)8,,1213, connexin 43 (Cx43)14,,1516. 배아 줄기 세포 (ESCs)와 만능 줄기 세포 (Psc)를 사용 하 여 방법 철저 하 게 최적화 하 고 되었습니다 유도 요인, 산소 및 영양소 그라디언트, 세부 사항 및 작업5,6,7,,1718의 정확한 타이밍에 관한 논의. 그럼에도 불구 하 고, esc 키 및 PSC 기반 기술을 여전히 여러 윤리 및 안전 우려, 차선 electrophysiological 및 면역 기능19,20함께 제시. 종종 이러한 세포와 함께 이식 하는 호스트 immunorejection 경험과 영구 면역 억제 필요. 이것은 주로 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 분자 호스트에 기증자 및 결과 T 세포 응답21일치. 동안 개별 MHC 종류 I 정합은 가능한 해결책, 더 접근 가능한 임상 연습 immunoprivileged 거절의 우려를 극복 하기 위해 보편적으로 셀 소스를 요구할 것입니다.

특히, BMSCs, 임상 응용, MSCs에서에서 사용에 대 한 대체 셀 소스로 199522에 그들의 초기 설명 이후 조직 재생에 사용 하기 위해 조사 했습니다. MSCs 거주 재생 세포 거의 모든 vascularized 조직23에서 찾을 수 있는 것으로 추정 된다. 원하는 소스에서 격리, 따라 MSCs 문화에 쉽게 확장 될 수 있다, 광범위 한 paracrine 용량 있고 종종 소유 immunoprivileged 또는 immunomodulatory 속성24,25. 그들의 안전과 효능 이미 표시 되었습니다 여러 전 임상 연구에서 특히 심장 재생3,26.

많은 MSC 차별화 전략 변수 효율 5 azacytidine22 와 DMSO27그리고 성장 또는 Bmp5,7,,2829 또는 angiotensin II30, 같은 morphogenic 요인 등의 약리 에이전트를 사용합니다. 그러나 이러한 전략, 기반 하지 순진한 재생 셀은 유도 또는 상해의 위치에 배달 되 고 후 발생할 가능성이 장애물 vivo에서. 더 순수 관련 전략, 더 어려운 동안 정의 및 조작, MSC 차별화 자체 조직 microenvironment에서 신호를 통해 유도 될 수 있다 전제에 기반. 이전 연구 보여주었다 심장 세포 lysates31 또는 심 실 myocardium32,33에 노출 또는 기본 cardiomyocytes 체 외 에서15,34, 접촉 MSCs에서 심장 감 적의 식을 높일 수 있습니다 직접. Cardiomyocytes39,40 BMSCs 융합 초기 심근을 생성 하는 경우, 비록 다른 MSCs35,36,,3738와 심장 부상 치료 후 자연 스러운 cardiomyogenesis를 증명 하고있다. 우리의 지식, 기능, 자발적 계약 cardiomyocytes 조직 소스 (hMSCs) 인간의 MSCs에서 하지 아직 보고 되었습니다.

현재 일치는 모든 MSCs 혈관 주위 세포23에서 발생 하는 것 이다. 영 MSCs pericyte 속성 인간 탯 조직41,,4243의 혈관 주위 지역에서 격리 될 수 있습니다. BMSCs에 비해 HUCPVCs 소유 증가 감 별 법 잠재력 및 다른 여러 재생 장점, 두 생체 외에서41,44 그리고 vivo에서45,46,47. 특히, 산 모-신생아 인터페이스 되는 소스 HUCPVCs는 MSCs의 성인 소스에 비해 상당히 낮은 immunogenicity. 우리의 연구에 초점을 맞추고 특성화 및 FTM HUCPVCs, 조사, MSCs의 막내 소스의 전 임상 응용 프로그램 우리 이전 증식 및 높은 multilineage 증가 표시는 차별화 능력, cardiomyogenic 계보41에 포함 한.

여기, 선물이 MSCs 집계의 완전 한 cardiomyogenic 차별화를 달성 하기 위해 유도 세력 제공 조건에 vivo에서 2D 부착 문화에 비해 더 나은 모델 3D 환경으로 집계 형성과 기본 심장 셀 피더 레이어를 결합 하는 프로토콜. 심장 급지대 레이어를 활용 하 여 MSCs에 대 한 궁극적인 이식 사이트의 대표 하는 환경을 제공 합니다. 사전 또는 출생 탯에서 격리 하는 MSCs의 젊은 소스 형태로 집계를 유지 하면서도 그들의 면역 권한 성인 BMSCs에 비해 심장 형에 도달 하는 높은 능력을가지고 설명 합니다. 심장 혈통 마커 유전자와 세포의 유도 식의 가파른 상승 외 (즉, cTnT와 MYH6) 및 세포 표면 단백질 (즉, SIRPA 및 Cx43) cardiomyocytes에 대 한 특정, 우리 보여 FTM HUCPVCs의 감 별 법 잠재력이이 방법으로 무력화 될 수 있습니다 그리고 그들은 저절로 cardiomyocyte 같은 셀 계약에 상승을 줄 수 있습니다.

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프로토콜

동물을 대상으로 한 모든 연구는 ARRIVE 지침에 따라 수행 및 보고되었습니다48. 모든 연구는 기관 연구 윤리 위원회의 승인(REB 번호 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, 토론토 대학교, 토론토, 캐나다). 모든 동물 절차는 University Health Network(캐나다 토론토)의 동물 관리 위원회의 승인을 받았으며 모든 동물은 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8판(National Institutes of Health 2011)에 따라 인도적인 치료를 받았습니다.

1. 조직 배양

  1. 배양 FTM HUCPVC, 용어 HUCPVC(이전에 확립됨, 각각에 대해 3개의 독립적인 라인≥42 및 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 칵테일이 보충된 알파 최소 필수 배지(MEM)의 시판되는 BMSC입니다. Dulbecco의 Modified Eagle 배지에서 배양 쥐 1차 심근세포 및 MSC-심근세포 공동 배양: 10% FBS 및 1% P/S.
    를 함유하는 영양 혼합물 F-12(DMEM-F12) 참고: 0.2μm 필터를 사용하여 배지를 살균합니다. 준비된 배지 용액을 4°C에서 최대 3주 동안 보관하십시오.
  2. 가습된 인큐베이터(95% 상대 습도, 37°C 및 5% CO2)에서 세포 배양을 유지하고 위상차 현미경으로 측정한 70-80% 포화도에서 계대를 유지합니다. 사용된 조직 배양 접시의 크기에 맞는 적절한 부피의 배지를 사용합니다(예: 10cm 접시에 10mL, 6웰 조직 배양 플레이트에 웰당 2mL). 프로토콜 기간 동안 이러한 배양 조건을 사용합니다.
  3. 해리 효소 용액(6-well 플레이트에 2mL/well)을 사용하여 계대 배양 또는 MSC-심근세포 공동 배양 설정을 위해 MSC 단층을 해리하고 37°C에서 4분 동안 배양합니다.
  4. 해리된 세포를 15mL 튜브로 옮기고 400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
  5. 세포 펠릿을 파괴하지 않고 상층액을 흡인하고 자동 세포 계수기를 사용하여 계수하기에 적합한 1mL의 배양 배지에 세포를 재현탁합니다. 다음 프로토콜 섹션에 설명된 대로 셀을 시드합니다.

2. 1차 쥐 심근세포-MSC 공동 배양 준비

  1. 1차 심근세포 분리를 위한 심장 조직을 확보합니다.
    1. CO2 질식을 사용하여 새끼 쥐(출생 후 5-6일)를 안락사시킵니다. CO2 챔버를 20% 가스 대체로 설정합니다(유속 = 0.2 x 분당 챔버 부피). 핀치 반사가 없는 것으로 exitus를 확인합니다.
    2. 멸균된 기구(예: 집게 및 구부러진 가위)를 사용하여 주요 혈관이 연결된 심방을 제거합니다41. 얼음에 1% P/S(PBS-P/S)가 포함된 멸균 PBS가 들어 있는 50mL 튜브로 심장을 옮깁니다.
    3. 심실을 반으로 자르고 얼음에 PBS-P/S 10mL를 넣은 10cm 접시에 혈액을 씻어냅니다. 구부러진 가위를 사용하여 심실 벽을 작은 조각(직경 = 2-3mm)으로 자릅니다.
    4. 혈청학 피펫을 사용하여 10-12마리의 동물의 심장 조각을 50mL 튜브로 옮기고 가라앉히십시오.
    5. 하트 조각을 제거하지 않고 가능한 한 많은 PBS-P/S를 제거하십시오. 새 PBS-P/S 10mL를 추가합니다.
  2. 심장 조직을 소화하여 심근세포를 분리합니다.
    1. 하트 조각이 가라앉도록 합니다. PBS-P/S를 PBS에 0.15% 트립신 10mL로 교체하고 37°C에서 10분 동안 흔듭니다.
    2. 상등액을 버리십시오. 2.2.1단계에서 설명한 분해를 3회 더 반복하되, 10mL의 100% FBS가 함유된 50mL 수집 튜브에 상등액을 디캔팅합니다.
  3. 세포를 원심분리하고(400 x g, 5분) 상층액을 흡인합니다. 10% FBS 및 1% P/S를 함유한 DMEM-F12의 세포를 재현탁하고 6웰 플레이트(1 x 105 cells/cm2, 웰당 배지 2mL)에 시딩합니다.
  4. 1시간 후, 부착되지 않은 세포가 포함된 배지를 50mL 튜브로 옮기고 부착된 세포를 폐기합니다. 현탁액의 세포를 계수하고 새로운 6-well plate(1 x 10,5 cells/cm, well당 10% FBS 및 1% P/S를 함유한 DMEM-F122, 2mL)에 다시 플레이트합니다.
  5. 브로모데옥시우리딘(BrdU)으로 세포 증식을 억제합니다.
    주의: BrdU는 강력한 기형 유발 물질이며 돌연변이 유발 물질이 의심됩니다. 적절한 교육이 제공되었는지 확인하고 사용하기 전에 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
    1. 세포가 부착되면 6-well 플레이트의 배지를 10% FBS, 1% P/S(웰당 배지 2mL) 및 5μM BrdU를 함유한 DMEM-F12로 교체합니다. 16 시간 (37 ° C, 5 % CO2) 동안 배양합니다.
    2. BrdU 함유 배지를 제거하고 10% FBS 및 1% P/S(웰당 배지 2mL)를 함유한 DMEM-F12로 교체합니다.
  6. 미리 염색된 MSC를 준비합니다.
    1. MSC 배양액이 10cm 접시에서 70-80% 포화도가 되면 배양 배지를 제거하고 3mL의 세포 해리 용액을 추가합니다. 접시를 37 ° C와 5 % CO2에서 5 분 동안 배양합니다.
    2. 해리된 세포를 15mL 튜브로 옮기고 400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
    3. 세포 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 흡인하고 자동 세포 계수기를 사용하여 계수하기 위해 10% FBS 및 1% P/S를 함유한 1mL의 DMEM-F12에 세포를 재현탁합니다.
    4. 10% FBS 및 1% P/S를 포함하는 DMEM-F12 1 x 106MSC/mL 농도로 세포를 희석합니다.
    5. 1.5mL 원심분리 튜브에서 1시간 동안 MSC를 비전달 형광 염료(5μM, 30분, 37°C, 5% CO2)로 배양합니다.
    6. 400 x g에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 흡인하고 1 x 10 6 MSC/mL의 세포 농도에 대해 10% FBS 및 1% P/S를 함유한 DMEM-F12에 펠릿을 재현탁합니다. 이것을 총 3회 반복합니다.
  7. MSC를 6-well 플레이트의 웰당 10 x 104 세포의 농도로 심근세포로 옮깁니다(단계 2.5.2).

3. 집합체 공동 배양 준비

  1. 10% FBS 및 1% P/S가 보충된 알파-MEM에서 MSC(2 x 104 cells/mL medium, passage # ≤ 6)의 단일 세포 현탁액을 준비합니다(단계 2.6 참조).
    참고: 세포 통과에 대한 프로토콜의 섹션 1을 참조하십시오. 또는 2.6단계에 따라 MSC를 사전 염색합니다.
  2. 10cm 조직 배양 접시의 뚜껑 내부 표면에 25μL의 세포 현탁액(500개 세포)을 떨어뜨려 응집체 형성을 시작합니다(뚜껑당 최대 50방울). PBS-P/S가 들어있는 아래쪽 뚜껑을 놓습니다.37 °C 및 5% CO2.
    에서 배양합니다. 참고: 방울 증발을 방지하기 위해 5-7mL의 PBS-P/S를 매달린 방울 아래의 배양 접시에 넣습니다.
  3. 실체현미경을 사용하여 3일 후 방울에서 응집체 형성을 관찰합니다. 50방울 중 40방울 이상에 형성된 응집체가 포함되어 있는 경우 1mL 마이크로피펫을 사용하여 뚜껑에서 방울을 채취하고 응집체를 1차 쥐 심근세포 단층(2.1-2.7단계에서 준비, 10방울/웰)으로 직접 옮깁니다. 응집체 무결성을 보존하기 위해 격렬한 피펫팅을 피하십시오.
  4. 최대 2주 동안 인큐베이터에서 응집체 공동 배양을 유지하고, 72시간마다 배지의 전체 부피(웰당 10% FBS 및 1% P/S를 함유한 DMEM-F12 2mL)를 변경합니다.
    1. 매일 명시야 현미경을 사용하여 공급세포층에 부착되는 응집체를 관찰합니다. 관찰 시 수축 집계를 기록합니다.
  5. 분석을 위해 애그리게이트를 준비합니다.
    1. 배지를 제거하고 6웰 조직 배양 접시의 웰당 PBS 2mL를 추가합니다. PBS를 제거하고 웰당 2mL의 해리 용액을 추가합니다. 37 ° C 및 5 % CO2에서 3 분 동안 배양합니다.
    2. 400 x g에서 5분 동안 원심분리기를 사용하여 세포 펠릿을 얻습니다. 후속 단계(단계 4.1, 5.1 및 6.1 참조)에 설명된 응용 프로그램에 대해 지정된 대로 매체에서 재현탁하고 70μm 세포 스트레이너를 통과합니다.

4. 유세포 분석(FC) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)

  1. 형광단 접합(FITC 또는 APC) 1차 항체(즉, FC의 경우 CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G 및 SIRPA, FACS의 경우 TRA-1-85, 1:40)를 사용하여 4°C에서 30분 동안 빛으로부터 보호하여 세포 현탁액(3% FBS를 포함하는 200μL의 PBS에 1 x 105개 세포)
    2. 을 배양합니다.
  2. 원심분리기(400 x g, 5분) 및 1mL의 PBS에서 FC의 경우 3% FBS 또는 FACS의 경우 0.5% FBS로 PBS에 세포를 재현탁합니다.
    참고: MSC의 FC는 Hong et al.에 의해 최적화되었습니다.41입니다.
  3. FC(최소 1 x 104 이벤트) 또는 FACS로 분석할 준비가 될 때까지 암흑 속에서 셀을 4°C로 유지합니다. 설명된 대로 셀을 정렬합니다41. 1시간 이내에 6-웰 플레이트(1 x 104 cells/well, 10% FBS 및 1% P/S를 함유한 DMEM-F12 2mL)에 TRA-1-85 고양성 분류 셀을 재플레이트합니다.
    참고: TRA-1-85 인간 세포 표면 항원의 게이팅 전략은 보충 그림을 참조하십시오.

5. 면역세포화학(ICC) 및 현미경 검사

  1. 공동 배양(단계 3.5.2) 또는 FACS(섹션 4)에서 얻은 세포 현탁액을 챔버 슬라이드(1 x 104 cells/well, 웰당 10% FBS 및 1% P/S를 함유한 DMEM-F12 2mL)에 다시 플레이팅합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 세포를 부착합니다(조건은 섹션 1 참조).
  2. PBS에 3mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 실온에서 15분 동안 세포를 고정합니다. 1% 소 혈청 알부민(BSA; PBS-BSA) 세척 당 5 분 동안 .
    주의: PFA를 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
  3. PBS-BSA 3mL의 세포를 0.1% Triton X-100으로 투과합니다. 세포 내 항원(예: 알파 사르코메릭 액티닌(aSarc) 및 Cx43)의 경우 실온에서 10분 동안 배양하거나 핵 내 항원(즉, Mef2c 및 인간 핵 항원(HuNu))의 경우 25분 동안 배양합니다. PBS-BSA 3mL로 3회 5회 세척합니다.
  4. 실온에서 15분 동안 5% 일반 염소 혈청(NGS)과 1% BSA가 포함된 PBS 3mL를 사용하여 비특이적 항체 반응에 대해 샘플을 차단합니다. PBS-BSA 3mL로 3회 5회 세척합니다.
    5. 1
  5. :200으로 희석된 1차 항체(즉, Mef2c, aSarc, Cx43 및 HuNu)의 세포를 4°C에서 3mL의 PBS-BSA에 밤새 배양합니다.
  6. 3mL의 PBS-BSA로 3회 세척하여 5분 동안 세척하고 실온에서 30분 동안 2차 항체로 배양합니다. PBS-BSA 3mL로 3회 5회 세척합니다.
  7. 염색된 표본을 3mL의 장착 매체에 보관하십시오.
  8. 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다. 저배율 이미징을 위해 10X 대물렌즈(NA = 0.3)와 20X 대물렌즈(NA = 0.45)를 사용합니다. GFP(ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm)에는 형광 필터 큐브 및 파장을 사용하고 사용된 2차 항체에는 RFP(ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm)에는 형광 필터 큐브 및 파장을 사용합니다(재료 및 장비 표 참조).
  9. 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미지를 정량화합니다(권장 소프트웨어는 재료 및 장비 표 참조). 형광 강도 판독값을 2차 대조군 획득으로 정규화합니다.

6. RNA 분리 및 정량적 RT-PCR

  1. 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 RNA 분리를 사용하여 미분화 MSC 배양 또는 공동 배양에서 분류된 MSC에서 RNA 샘플을 준비합니다. 샘플당 0.7mL의 세포 용해 완충액(RNA 분리 키트와 함께 제공)에 1 x 104 - 1 x 106 세포를 준비합니다.
  2. 100μL RT 반응당 최대 2μg의 RNA에서 cDNA를 준비합니다.
  3. 반응당 10ng의 cDNA를 사용하여 qPCR을 수행합니다(40 사이클, 60°C 어닐링/확장 온도).
    1. 반응당 500-nM 농도 및 1-100ng의 cDNA에서 인간 MY6H 및 cTnT에 프라이머를 사용합니다(재료 및 장비 표 참조). GAPDH, ACTB 및 HPRT를 내부 하우스키핑 노멀라이저로 사용합니다. 상업적으로 이용 가능한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포를 양성 대조군으로 사용합니다.
      참고: 미분화 MSC 유래 cDNA 샘플과 비교하여 발현의 접힘 변화를 표현합니다.

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결과

HUCPVC는 BMSC에 비해 더 높은 응집체 형성 잠재력과 CD49f 발현 수준을 나타냄:

hMSC(즉, FTM HUCPVC, term HUCPVC 및 BMSC)의 분화를 유도하기 위해, 분화되지 않은 MSC의 단일 세포 현탁액 또는 MSC를 포함하는 행잉 드롭(Table 1)을 각각 쥐 일차 심근세포 단층 위에 옮겨 직접 공배양 또는 응집체 공배양을 구축하였다. 세 가지 서로 다른 MSC 유형은 직접 공배양에서 유사한 풍부도와 외형을 나타냈다(Figure 1A). 응집체 공배양에서 행잉 드롭을 심근세포 위로 옮긴 후 2-3일이 지나자(Table 1), FTM 및 term ...

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토론

줄기 세포의 심근 분화 MSC 소스에서 cardiomyocyte 같은 세포를 생성 하는 데 사용 되 고 여러 가지 다른 전략으로 2 년간 개발 되었습니다. 그러나 이러한 전략은,, 많은, 고 사용 조건이 자주 하지는 환경 이식 세포 발생에서 vivo에서의 대표.

기존의 방법 달리 여기에 제시 된 프로토콜 기본 심장 급지대 레이어 및 MSC 집계 형성의 조합을 사용 합니다. 기본 심장 급지대 레이어는 hMSCs 이식 시에 노출 되는 것과 유사한 차별화 환경을 제공. 집계 생성 그라디언트와 산소와 영양소, 혈통 헌신 시작에 유도 영향을 미칠 수 있는 환경. Hypoxic 늘어진 사용 하 여 PSC 및 ESC 기반 심장 차별화 전략 및 집계 형성 줄기 세포5,,5253에이 유도 효과 설립 했다. 또한, ...

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공개 사항

닥터 클 리 포드 L. Librach는 특허의 공동 소유자: 격리의 첫 번째 임신 탯 조직에서 파생 된 셀의 사용 방법, 캐나다와 호주에 부여.

감사의 글

저자는 다음 직원을 감사 하 고 그들의 공헌에 대 한 인사를 연구: 매튜 Librach, 라일라 Maghen, 타 냐 A. Baretto, Shlomit Kenigsberg, 그리고 앙드레 Gauthier 피셔. 이 작품은 온타리오 연구 기금-연구 우수성 (ORF-다시, 라운드 #7)과 만드는 프로그램 i n c.에 의해 지원 되었다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% 트립신/EDTAGibco25200056세포 해리용
Alpha-MEMGibco12571071HUCPVC 및 BMSC 배양 배지용.
PE 결합 항인간/마우스 CD49f 항체Biolegend313612Integrin 마커
FCConnexin 43 마커
Genway Biotech Inc.GWB-66FBD2원성 마커
Abcamab7904FC
FITC-conjugated mouse anti-human SIRPA/CD172a 항체AbD Serotec/Bio-RadMCA2518F에 대한 심장 마커
R& FC및 FACS
FITC 결합 인간 TRA-1-85/CD147 항체R& FC및 FACS
Anti-connexin 43/GJA1 항체Abcamab11370. ICC
염소 항토끼 IgG(H+L) 교차 흡수 2차 항체, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428ICC
항육종 알파 액티닌[EA-53] 항체Abcamab9465aSARC. ICC
Goat anti-mouse IgM 중쇄 교차 흡수 2차 항체, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426ICC
Mef2C(D80C1) XP 토끼 항체New England BioLabs Ltd.5030SICC
당나귀 항 토끼 IgG (H + L) 2 차 항체, Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206ICC
Anti-nuclei (HuNu) (클론 235-1) 항체EMD MilliporeMAB1281ICC
MZ9.5 실체 현미경Leica이미징 골재.
1.5ml 원심분리기 마이크로튜브AxygenMCT-150-C형광 염료로 MSC를 염색합니다.
ImageJ오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어.
아리아 II UHN SickKids FC 시설. 셀 정렬용.
골수 중엽 기질 세포LonzaPT-2501BMSC,
소 혈청 알부민시그마-알드리치A7030-100G, BSA. ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424 주의: BrdU는 강력한 기형 유발 물질이며 돌연변이 유발 물질이 의심됩니다. 사용하기 전에 적절한 교육을 받고 SDS를 참조하십시오.
Canto IIBDUHN SickKids FC 시설. 유세포 분석용.
cDNA EcoDry PremixClontech/Takara639570에 대한 cDNA 준비
C10227
DMEM-F12세포 계수 Sigma-AldrichD6421쥐 1차 심근 세포 배양 배지용.
Dulbecco의 인산염 완충 식염수Gibco10010023D-PBS, Ca2+, Mg2+
EVOS없음 Life Technologies사내 형광 현미경
FACSCaliburBD사내. 유세포 분석용.
소 태아 혈청 (Hyclone)GE 헬스케어SH3039603FBS. 세포 배양 배지의 구성 요소.
IDT 프라임 타임 qPCR 프로브통합 데이터 기술FAM 형광단http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor 수성 장착 매체ThermoScientificTA-030-FM거치는 세포 저장용
;UHN SickKids FC 시설. 유세포 분석용.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC 시설. 셀 정렬용.
일반 염소 혈청세포 신호 전달 기술5425SNGS. ICC
Nunc Lab-Tek II 챔버 커버 유리, 8-웰Thermo Scientific Nunc155409용 시료 준비
ICC
파라포름알데히드, 16% 용액, EM GradeElectron Microscopy Sciences15710ICC용 세포 고정용
페니실린/스트렙토마이신Gibco15140122세포 배양 배지의 구성 요소.
프라이머SigmaCustom Standard DNA Oligos, Desalted, 0.2 μ molCTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk ConfocalZeissSickKids 이미징 시설
ReproCardio hiPS 세포 유래 심근세포ReproCellRNeasy에 대한 RCD001N 양성 대조군
Qiagen74106위한 RNA 분리
Qiagen204074마스터 믹스를 사용한 qPCR용
RPMI 1640GibcoA1049101MSC용, 단핵구 공동 배양 배지.
TaqMan qPCR 프라이머 어세이Thermo Fisher Scientific4444556 For qPCR
Trypan BlueLife TechnologiesT10282생존 및 계수를 위한 세포 염색
TrypsinGibco 272500108세포 해리용
VolocityPerkin-ElmerVolocity 6.3이미징 소프트웨어
0.2 μ m 기공 필터Thermo Fisher Scientific566-0020조직 배양 배지 살균용
HERAcell 150i CO2 인큐베이터Thermo Fisher Scientific51026410세포 배양용
Dulbecco의 인산염 완충 식염수Sigma-AldrichD8537PBS. 1X, 염화칼슘 및 염화마그네슘 미포함
집게Almedic7727- A10-704쥐 심장을 나눠주기 위해. 유사한 집게를 사용할 수 있습니다.
가위Fine Science Tools14059-11쥐 심장 다지기용. 곡선 가위를 권장합니다.
50 mL 튜브BD Falcon352070심근세포 채취 및 일반 조직 배양 절차 중 채취용
15 mL 튜브BD Falcon352096일반 조직 배양 절차용
6웰 플레이트Thermo Scientific NuncCA73520-906조직 배양용
10cm 조직 배양 접시Corning25382-428응집체 형성용
Axiovert 40C 현미경Zeiss조직 배양 및 프로토콜의 나머지 부분을 통한 명시야 이미징 70
μ m cell strainerFisherbrand22363548유세포 분석 또는 분류 전 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해
Triton X-100EMD Millipore9410-1L투과화 용액에 사용
Thermo Fisher ScientificH1399Stain은 Cx43 국소화 시각화 중에 사용됩니다
FC APC 결합 인간 Cx43/GJA1 항체 R&를 위한 ; FITC 결합 HLA-A2 항체에 대한 D Systems FAB7737A FC FITC-conjugated anti-HLA-G [MEM-G/9] 항체에 대한 면역 FC APC-conjugated human TRA-1-85/CD147 항체에 대한 D Systems FAB3195A 인간 세포 마커 Cx43에 대한 D Systems FAB3195F 인간 세포 마커 BD , , , 에 대한 용액을 준비하려면 qPCR CellTracker Green, CMFDA Dye, Life Technologies C7025, 세포 세포질의 형광 이미징, Countess 자동 세포 계수기, Invitrogen Inc.용 ICC LSR II 를 BD ICC OmniPur Triton X-100 계면활성제 EMD Millipore 9410-OP 투과 용액 준비 샘플에 사용됩니다. 미니 키트 qPCR Rotor-Gene SYBR Green PCR 키트를 ICC Hoechst 33342의 .

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