Method Article

인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

DOI:

10.3791/55762

⸱

June 14th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Cardiovascular Tissue Bank of Milan, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 3Department of Clinical Sciences and Community Health, Cardiovascular Section, University of Milan, 4Department of Cardiovascular Disease, Development and Innovation Cardiac Surgery Unit, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 승모판의 단백질 조성은 여전히 ​​부분적으로 알려지지 않았는데, 그 이유는 세포질이 낮아 단백질 생합성이 낮기 때문에 분석이 복잡하기 때문입니다. 이 연구는 승모판 프로테옴의 분석을 위해 단백질을 효율적으로 추출하기위한 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

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세포 성 프로테옴의 분석은 복잡한 생물학적 시스템에 존재하는 단백질의 대규모 동정 및 정량화를 가능하게하는 기술의 개발로 인한 질병의 근원적 인 분자 기작을 밝히는데 도움이 될 수 있습니다. 단백질 학적 접근으로부터 얻은 지식은 잠재적으로 질병의 기초가되는 병원성 메커니즘에 대한 더 나은 이해, 새로운 진단 및 예후 질환 표지자의 확인 및 치료 목표의 희망을 가능하게한다. 그러나, 심장 승모판 막은 proteoglycan과 collagen-enriched extracellular matrix의 세포질이 낮기 때문에 proteomic analysis에서 매우 어려운 표본이됩니다. 이것은 전 지구적인 단백질 분석을 위해 단백질을 추출하는 것을 어렵게 만든다. 이 작품은 양적 proteomics 및 immunoblotting과 같은 후속 단백질 분석과 호환 프로토콜입니다. 이것은 데이터의 상관 관계를 허용 할 수있다.g 단백질 발현을 정량적 mRNA 발현 및 비 정량 면역 조직 화학적 분석에 대한 데이터로 비교 하였다. 사실, 이러한 접근법은 함께 수행 될 때 mRNA에서 번역 후 단백질 변형에 이르기까지 질병을 근본으로하는 분자 메커니즘에 대한보다 포괄적 인 이해로 이어질 것입니다. 따라서이 방법은 심장 판막 생리 병리학의 연구에 관심이있는 연구자들에게 적합 할 수있다.

Introduction

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최근의 증거는 mRNA 합성 후 발생하는 많은 조절 기작의 역할에 대한 이해를 변화시켰다. 사실, 번역, post-transcriptional 및 proteolytic 프로세스는 단백질의 풍부와 기능을 조절할 수 있습니다. transcript level이 protein abundance의 주된 결정 인자라고 가정 할 때, mRNA 농도가 상응하는 단백질의 그것들에 대한 proxies라고 말하는 dogma는 부분적으로 수정되었다. transcript level은 단지 단백질의 양을 부분적으로 예측할 뿐이며, post-transcriptional events 세포 1 , 2 내의 단백질을 조절합니다.

또한, 단백질은 궁극적으로 세포의 기능을 지시하고 따라서 autocrine, paracrine 및 내분비 요인에 대한 응답으로 역동적 인 변화를 겪을 수있는 표현형을 지시합니다. 혈액 매개 매개체; 온도; 약물 치료; 질병이 생기다.ment. 따라서, 단백질 수준에 초점을 맞춘 표현 분석은 proteome을 특성화하고 질병 병인의 일부로 발생하는 중대한 변화를 밝혀내는 데 유용합니다 3 .

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Protocol

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이 프로토콜에서는 정상적인 심 초음파 검사의 매개 변수에도 불구하고 기술적 또는 기능적 이유로 기관 이식에서 제외 된 다기관 기증자로부터의 다기관 외과 (4 ~ 12 시간의 냉증 허혈 시간, 평균 6 ± 2 시간) 동안 인간의 심장을 수집합니다. 그들은 대동맥 및 폐동맥 판막의 은행 업무를 위해 Monzino Cardiologic Centre (Milan, Italy) 밀라노 심장 혈관 조직 은행으로 보내집니다. 승모판 후엽은 임상 목적으로 사용되지 않으므로 기증자의 친척으로부터 정보에 입각 한 동의를 얻은 후 대동맥 및 폐동맥 판막 분리시 수집됩니다. 이식 및 연구를위한 조직은 부모의 동의가 있어야 수집됩니다. 동의서에서 그들은 윤리적위원회의 지침에 따라 인간의 임상 적 사용 ( 즉, 미생물 학적, 기능적 및 혈청 학적 문제)에 적합하지 않은 경우에만 연구를위한 심장 조직의 사용을 허가합니다 (또는 사용하지 않음).몬 지노 심장 센터.

1. 승모판 준비

  1. 장기 explantation (4 ~ 12 시간의 냉증 허혈 시간) 후 최대한 빨리 인간 승모판을 수확.
  2. 클린 룸에서 차가운 (4 ° C) 용액 ( 즉, 염분 용액 또는 균형 잡힌 Eurocollins 또는 위스콘신)이....

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Results

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요소 버퍼에서 단백질의 추출 및 용해는 등전두 초점 (2 차원 전기 영동 (2-DE) ) 및 액상 등전점 (IEF) 12 에 기반한 proteomic 방법과 직접 호환되며 Laemmli 버퍼 13 에서 희석 한 후 면역 블로 팅 프로 테아 제 억제제 칵테일을 함유하고있다.

겔이없는 질량 분석기 기반의 방법 ( 즉, 데이터 독립 질량 분광법 분석 (LC / MS E ) 및 2 차원 LC / MS E (2D-LC / MS E )에 결합 된 액체 크로마토 그래피 15 ) 기술 된 우레아 완충액에서, 우레아 및 티오 우레아를.......

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Discussion

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이 프로토콜의 한 가지 중요한 단계는 액체 질소를 사용하여 시료를 동결시키고 그라인더 시스템을 냉각시키는 것입니다. 액체 질소를 사용하면 생물학적 분해를 방지하고 분말 파우더를 효율적으로 사용할 수 있지만 안전한 취급을위한 특수 교육이 필요합니다.

이 프로토콜에는 작은 시료를 표준 박격포와 유봉에서 복구하기가 어렵 기 때문에 시료 분쇄를위한 분쇄기 시스템이 있습니다. 이 경우 작은 샘플이 모르타르 표면에 미세한 분말로 퍼지기 때문에 수집이 어려워집니다. 또 다른 장점은 분쇄기가 모터 구동되어 재현성있는 방식으로 더 많은 샘플을 처리 할 수 ​​있고 피로를 추가하지 않아도된다는 것입니다. 분쇄기의 사용에 대한 하나의 한계는 박격포가 박격포에 효과적으로 눌려 지도록 작아야하는 시료 크기 (100mg 이하)입니다. 또한, 분쇄기 구성 요소는 세척을위한 사용 사이에서 실온으로 가온되어야합니다 지. 결과적으로, 절차는 시간 소모적이며 많은 샘플이 매일 처리되는 경우 많은 세.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이탈리아 보건부는이 연구를 지원했습니다 (RC 2013-BIO 15). 그녀는 훌륭한 기술 지원을 해주신 Barbara Micheli에게 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
식염수 0.9% NaCl
Eurocollins ASALF30874046균형 장기의 수송 매체. 400mL의 유로콜린 A와 100mL의 유로콜린 B를 결합하여 균형 잡힌 배지인 유로콜린
유로콜린 BSALF30874022균형 장기의 수송 매체를 얻습니다. 400mL의 Eurocollins A와 100mL Eurocollins B를 결합하여 균형 잡힌 배지 Eurocollins
WisconsinBridge lifeRM/N 4081Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow airBurdinolaClass A GMP classification
Dewar FlaskThermo ScientificNalgene 4150-1000
Cryogrinder systemOPS diagnosticsCG 08-01모르타르, 유봉 및 스크루 드라이버가 포함 된 그라인더 시스템
스테인레스 스틸 집게
스테인레스 스틸 주걱
일회용 멸균 메스MedisafeMS-10
스테인레스 스틸 가위오토 클레이브 가능
스테인레스 스틸 픽오토 클레이브 가능
일회용 멸균 드레이프Mon & Tex3.307.08
이소프로필 알코올70% 이소프로필 알코올
살균 용액 과산화6% 과산화수소
마이크로피펫, 1mL, 팁
포함 15mL 원심분리기 튜브VWR international9278
1.7mL 원심분리기 튜브VWR 국제PIER90410
요소 버퍼8 M 요소, 2 M 티오우레아, 4 % w/v CHAPS, 20 mM 트리즈마, 55 mM 디티오트레이톨
우레아 시그마 알드리치U6504-1KG요소 버퍼
티오우레아시그마 알드리치T8656요소 버퍼
CHAPS시그마 알드리치C3023-5GR요소 버퍼
에 사용DithiotreitolSigma aldrichD0632-5G요소 버퍼
주사기에 사용 50 mLPIC를 필터링하는 데 사용됩니다
. m 필터MilliporeSLGP033RB요소 완충액
PFTE Pestle, 2mLKartell6302Potter-Elvehjem 균질화기
붕규산 유리 모르타르Kartell6102Potter-Elvehjem 균질화기
교반기 VELPscientifica교반기 DLHPotter-Elvehjem Bradford 단백질 분석에 의한 균질화에 사용
Bio-Rad 실험실5000006
튜브 로테이터Pbi InternationalF205
액체 질소
알루미늄 호일
아이스
폴리스티렌 상자
드라이 아이스
원심 분리기13,000 x g 냉동고에서 1.7 mL 원심분리 튜브의 원심분리용
-80° C
정밀 균형
멸균 용 오토 클레이브
액체 질소
장갑
전문 강제 환기 및 자연 공기 대류 오븐살균
프로테아제 억제제 칵테일Sigma aldrichP8340-5ML100X 솔루션
ProteoExtract 단백질 침전 키트Calbiochem539180
RapiGestWaters186001861
Cytoscapewww.cytoscape.org버전 2.7유전자 온톨로지 분석을 위한 소프트웨어 플랫폼
BiNGOhttp://apps.cytoscape.org/apps/bingo 버전 3.0.3플러그인 유전자 온톨로지 분석용
AlphaB Crystallin/CRYAB 항체Novus BiologicalsNBP1-97494
Septin-11 항체Novus BiologicalsNBP1-83824Septin-11
FHL1 항체Novus BiologicalsNBP-188745FHL-1
Dermatopontin 항체Novus BiologicalsNB110-68135더마토폰틴에 대한 토끼 다클론 항체
염소 안티 마우스 IgG HRP시그마 알드리치A4416-0.5ML면역 블로팅을 위한 2차 항체
염소 안티 토끼 IgG HRPBio-Rad 실험실170-5046면역 블로팅을 위한 2차 항체
수소 요소 버퍼 0.22 µ의 일부 용 극저온 장갑 CryAB 에 대한 마우스 단클론 항체 에 대한 토끼 다클론 항체 에 대한 토끼 다클론 항체

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expressio....

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