Method Article

인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

DOI:

10.3791/55762

⸱

June 14th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Cardiovascular Tissue Bank of Milan, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 3Department of Clinical Sciences and Community Health, Cardiovascular Section, University of Milan, 4Department of Cardiovascular Disease, Development and Innovation Cardiac Surgery Unit, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 승모판의 단백질 조성은 여전히 ​​부분적으로 알려지지 않았는데, 그 이유는 세포질이 낮아 단백질 생합성이 낮기 때문에 분석이 복잡하기 때문입니다. 이 연구는 승모판 프로테옴의 분석을 위해 단백질을 효율적으로 추출하기위한 프로토콜을 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 성 프로테옴의 분석은 복잡한 생물학적 시스템에 존재하는 단백질의 대규모 동정 및 정량화를 가능하게하는 기술의 개발로 인한 질병의 근원적 인 분자 기작을 밝히는데 도움이 될 수 있습니다. 단백질 학적 접근으로부터 얻은 지식은 잠재적으로 질병의 기초가되는 병원성 메커니즘에 대한 더 나은 이해, 새로운 진단 및 예후 질환 표지자의 확인 및 치료 목표의 희망을 가능하게한다. 그러나, 심장 승모판 막은 proteoglycan과 collagen-enriched extracellular matrix의 세포질이 낮기 때문에 proteomic analysis에서 매우 어려운 표본이됩니다. 이것은 전 지구적인 단백질 분석을 위해 단백질을 추출하는 것을 어렵게 만든다. 이 작품은 양적 proteomics 및 immunoblotting과 같은 후속 단백질 분석과 호환 프로토콜입니다. 이것은 데이터의 상관 관계를 허용 할 수있다.g 단백질 발현을 정량적 mRNA 발현 및 비 정량 면역 조직 화학적 분석에 대한 데이터로 비교 하였다. 사실, 이러한 접근법은 함께 수행 될 때 mRNA에서 번역 후 단백질 변형에 이르기까지 질병을 근본으로하는 분자 메커니즘에 대한보다 포괄적 인 이해로 이어질 것입니다. 따라서이 방법은 심장 판막 생리 병리학의 연구에 관심이있는 연구자들에게 적합 할 수있다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최근의 증거는 mRNA 합성 후 발생하는 많은 조절 기작의 역할에 대한 이해를 변화시켰다. 사실, 번역, post-transcriptional 및 proteolytic 프로세스는 단백질의 풍부와 기능을 조절할 수 있습니다. transcript level이 protein abundance의 주된 결정 인자라고 가정 할 때, mRNA 농도가 상응하는 단백질의 그것들에 대한 proxies라고 말하는 dogma는 부분적으로 수정되었다. transcript level은 단지 단백질의 양을 부분적으로 예측할 뿐이며, post-transcriptional events 세포 1 , 2 내의 단백질을 조절합니다.

또한, 단백질은 궁극적으로 세포의 기능을 지시하고 따라서 autocrine, paracrine 및 내분비 요인에 대한 응답으로 역동적 인 변화를 겪을 수있는 표현형을 지시합니다. 혈액 매개 매개체; 온도; 약물 치료; 질병이 생기다.ment. 따라서, 단백질 수준에 초점을 맞춘 표현 분석은 proteome을 특성화하고 질병 병인의 일부로 발생하는 중대한 변화를 밝혀내는 데 유용합니다 3 .

따라서 기존의 기술적 어려움에도 불구하고 건강과 질병 상태를 명확히하기 위해 프로테오믹스가 제시하는 기회는 엄청납니다. proteomics가 기여할 수있는 연구 분야 중 특히 유망한 분야 : 모든 수준 ( 즉, 전체 세포 또는 조직, 세포 내 구획 및 생물학적 유체)에서 단백질 발현의 변화 여부 확인; 질병의 진단 및 예후에 유용한 새로운 바이오 마커의 확인, 확인 및 확인; 약물 효과 및 독성 평가뿐만 아니라 치료 목적으로 사용될 수있는 새로운 단백질 표적의 확인 4 .

복잡성 포착프로테옴은 기술적 도전을 나타냅니다. 현재의 프로테오믹스 도구는 변경된 단백질 수준의 확인, 정량화 및 검증을 위해 대규모의 높은 처리량 분석을 수행 할 수있는 기회를 제공합니다. 또한, 가장 풍부한 단백질로 인한 간섭을 피하기위한 분획 화 및 농축 기술의 도입은 가장 풍부한 단백질을 포함시킴으로써 단백질 확인을 향상 시켰습니다. 마지막으로 proteomics는 단백질 기능의 중요한 조절 자로서 점차적으로 출현하는 번역 후 변형의 분석에 의해 보완되었다.

그러나 분석중인 생물 표본의 시료 준비 및 단백질 회수는 여전히 proteomic 워크 플로우의 제한 단계로 남아 있으며 가능한 함정 가능성을 높입니다. 사실, 최적화되어야하는 대부분의 분자 생물학 기술에서 첫 번째 단계는 조직 균질화이온 및 세포 용해, 특히 증폭 방법이 존재하지 않는 저농도 단백질의 분석에 유용합니다. 또한, 단백질의 화학적 특성은 자체 복구에 영향을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 고도로 소수성 인 단백질의 분석은 isoelectric focusing 동안 쉽게 침전되기 때문에 매우 어렵습니다. 반면에 trans-membrane 단백질은 거의 용해되지 않습니다 (참고 문헌 5에서 검토). 또한, 조직 조성의 가변성은 보편적 인 추출 방법을 개발하는데 중요한 장벽이된다. 마지막으로, 거의 모든 임상 표본의 수량이 제한되어 있기 때문에 최소 샘플 양에서 최대 회수 및 재현성으로 단백질 준비를 할 수 있어야합니다.

이 작품은 proteomic 분석을위한 매우 도전 샘플을 나타내는 정상적인 인간의 심장 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 정상적인 승모판은좌심방과 심장 좌심실 사이에있는 렉스 구조 ( 그림 1 ). 심방에서 심실까지의 혈류를 조절하고 역류를 방지하며 전신에 적절한 수준의 산소 공급을 보장하여 적절한 심 박출량을 유지하는 데 중요한 역할을합니다. 그러나, 세포질이 적고 구성 요소가 거의없는 "비활성"조직으로 주로 간주됩니다 (주로 세포 외 기질에 있음). 이는 정상 상태에서 상주 판막 간질 세포 (VIC)가 낮은 단백질 생합성 률로 정지 상태를 나타 내기 때문입니다.

그러나 병리학 적 상태에서는 해면질 내의 VIC 수가 증가하고 단백질 합성이 다른 기능적 및 표현형 변화와 함께 활성화된다는 것이 입증되었습니다. 따라서, 최소한의 데이터를 사용할 수 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다.문헌은 병리학 승모판의 분석에 초점을 맞추고 있는데, 증가 된 수의 활성화 된 VIC가 확인 된 단백질의 상대적으로 많은 수를 설명 할 수있다.

결론적으로, 본 프로토콜은 승모판 막 단백질 성분의 연구를 통해 승모판 막 질환의 원인이되는 병원성 기전을 이해하는 데 도움이 될 수있다. 실제로, 근본적인 병리학 적 과정에 대한 더 깊은 이해는 혈류 역학적 인 고려 사항에 대한 현재의 적응증이있는 판막 질환의 임상 관리를 개선하는 데 도움이 될 수있다.

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Protocol

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이 프로토콜에서는 정상적인 심 초음파 검사의 매개 변수에도 불구하고 기술적 또는 기능적 이유로 기관 이식에서 제외 된 다기관 기증자로부터의 다기관 외과 (4 ~ 12 시간의 냉증 허혈 시간, 평균 6 ± 2 시간) 동안 인간의 심장을 수집합니다. 그들은 대동맥 및 폐동맥 판막의 은행 업무를 위해 Monzino Cardiologic Centre (Milan, Italy) 밀라노 심장 혈관 조직 은행으로 보내집니다. 승모판 후엽은 임상 목적으로 사용되지 않으므로 기증자의 친척으로부터 정보에 입각 한 동의를 얻은 후 대동맥 및 폐동맥 판막 분리시 수집됩니다. 이식 및 연구를위한 조직은 부모의 동의가 있어야 수집됩니다. 동의서에서 그들은 윤리적위원회의 지침에 따라 인간의 임상 적 사용 ( 즉, 미생물 학적, 기능적 및 혈청 학적 문제)에 적합하지 않은 경우에만 연구를위한 심장 조직의 사용을 허가합니다 (또는 사용하지 않음).몬 지노 심장 센터.

1. 승모판 준비

  1. 장기 explantation (4 ~ 12 시간의 냉증 허혈 시간) 후 최대한 빨리 인간 승모판을 수확.
  2. 클린 룸에서 차가운 (4 ° C) 용액 ( 즉, 염분 용액 또는 균형 잡힌 Eurocollins 또는 위스콘신)이 담긴 운반 백에서 심장을 제거합니다. 버킷에 넣고 밸브 준비를 위해 바이오 안전성 캐비닛 (biohazard vertical air flow, 클래스 A, GMP (Good Manufacturing Practices) 분류)에 넣으십시오.
  3. 캐비닛에 멸균 일회용 드레이프에 심장을 놓습니다. 멸균 일회용 메스를 사용하여 정점에서 약 4cm 떨어진 좌우 심실의 레벨에서 심장을 주축에 수직으로 완전히 자릅니다.
  4. 왼쪽 가슴 지붕을 표시하는 오름차순 대동맥과 폐동맥을 이동하십시오.
  5. 멸균 된 오토 클레이브 가능한 포셉과 피크를 사용하여좌측 심방 루프는 승모판이 보이도록 만들고 위대한 승모 전단 (전방)과 작은 승모 전단 (후방)을 식별 할 수 있도록합니다.
    참고 : 전 측방 및 후방 측방 판막은 전방 판막과 후방 경계의 경계를 정의합니다.
  6. 무균 autoclavable 가위와 비 외상성 집게를 사용하여, 전체 승모판 주위의 좌심방과 심실 벽 두께를 해부 .
  7. mitro-aortic valve continuity를 확인하십시오.
    참고 : 좌심실에는 전체 승모판과 코드가 포함되어 있습니다.
  8. 후부 승모판 판 전단에서 앞쪽 승모판 전단지를 분리하고, 심실 (삽입)과 함께 삽입을 따라 후부 전단지를 절단.
  9. 생리 식염수에서 후방 전단지를 씻으십시오. 전단지를 작은 조각 (<1cm 2 )으로 자른 다음 개별적으로 알루미늄 호일로 포장하십시오. 액화 질소로 그들을 고정하십시오.
    주의 : 액체 질소를 사용할 때는 조직의 안전 절차를 따르십시오.
    1. 절차가 끝나면 70 % 이소 프로필 알콜 용액과 6 % 과산화수소 용액으로 캐비닛 테이블을 살균하십시오.

2. 단백질 추출

  1. 집게를 사용하여 액체 질소에 저장된 시료를 채취하고 즉시 알루미늄 호일에 싸서 드라이 아이스에 놓습니다. 시료를 옮길 때 시료를 녹이지 마십시오.
  2. 분쇄하기 전에 분쇄기 시스템 ( 예 : CryoGrinder)의 도자기 / 지르코늄 모르타르와 유봉을 액체 질소가 들어있는 듀어 플라스크 (~ 500 mL)에 넣음으로써 시료와 함께 냉장하십시오.
    주의 : 액체 질소를 사용할 때는 조직의 안전 절차를 따르십시오.
  3. 박격포와 유봉을 드라이 아이스가 들어있는 폴리스티렌 상자에 넣으십시오. 알루미늄 호일에서 샘플을 꺼내어 박격포에 넣으십시오.
  4. 갈아 입히기그는 유봉을 회전시키기 위해 스크루 드라이버를 사용하여 박격포에 대 한 큰 유봉을 샘플링한다. 연삭 과정 중에 샘플을 사전 냉각 된 주걱 끝과 섞는다.
    1. 작은 유봉으로 반복하십시오.
  5. 튜브를 뒤집어서 모르타르 위에 올려 놓고 시료를 튜브로 옮기려면 함께 뒤집어서 이전에 계량 한 튜브 ( 예 : 15 mL 원심 튜브)에 지상 샘플을 옮기십시오. 박격포에서 모든 재료를 회수하려면 사전 냉각 된 주걱을 사용하십시오.
    1. 샘플을 옮길 때 샘플이 녹지 않도록 샘플을 드라이 아이스에 보관하십시오.
  6. 샘플 순 중량을 계산하십시오.
  7. 각 시료 다음에 박격포와 유봉을 깨끗이하고 고압 증기 멸균 또는 200 ° C에서 2 시간 가열하여 오염 제거하십시오.
  8. 원심 분리기 튜브에서 분쇄 한 시료를 균질 기의 유리 튜브로 옮긴다.
  9. 여과 된 요소 쇄석 추가유리 조직에 분말 조직 10mg 당 200uL의 우레아 완충액 (8M 우레아, 2M 티오 우레아, 4 % w / v CHAPS, 20mM 트리스 및 55mM 디티 오 트레이 톨)을 넣었다.
    참고 : 원심 분리 관에 남아있는 잔유 가루 시료는 계산 된 부피의 우레아 완충액의 일부를 사용하여 회수 할 수 있습니다.
  10. 붕규산 유리 몰탈과 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 유봉이 장착 된 교반기를 사용하여 시료를 균질화하십시오. 비틀린 동작 (1,500 rpm)으로 샘플을 천천히 10 번 누르십시오.
  11. 상층 액을 회수하고 깨끗한 1.7 mL 원심 분리 튜브로 옮긴다. 다시 신선한 우레아 완충액으로 나머지 시료를 추출하고 첫 번째 추출 중에 사용 된 부피의 절반을 더하십시오.
  12. 2.10 단계를 반복하십시오.
  13. 상등액을 회수하고 2.11 단계의 상등액과 합칩니다. 30 분 동안 튜브 rotator에 결합 된 뜨는을 놓으십시오.
  14. 튜브를 13,000 xg 및 4 ° C에서 30 분간 원심 분리하십시오.
  15. 상청액을제조자의 지시에 따라 Bradford 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 측정한다. 샘플을 사용할 때까지 -80 ° C에 보관하십시오.

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Results

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요소 버퍼에서 단백질의 추출 및 용해는 등전두 초점 (2 차원 전기 영동 (2-DE) ) 및 액상 등전점 (IEF) 12 에 기반한 proteomic 방법과 직접 호환되며 Laemmli 버퍼 13 에서 희석 한 후 면역 블로 팅 프로 테아 제 억제제 칵테일을 함유하고있다.

겔이없는 질량 분석기 기반의 방법 ( 즉, 데이터 독립 질량 분광법 분석 (LC / MS E ) 및 2 차원 LC / MS E (2D-LC / MS E )에 결합 된 액체 크로마토 그래피 15 ) 기술 된 우레아 완충액에서, 우레아 및 티오 우레아를...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 한 가지 중요한 단계는 액체 질소를 사용하여 시료를 동결시키고 그라인더 시스템을 냉각시키는 것입니다. 액체 질소를 사용하면 생물학적 분해를 방지하고 분말 파우더를 효율적으로 사용할 수 있지만 안전한 취급을위한 특수 교육이 필요합니다.

이 프로토콜에는 작은 시료를 표준 박격포와 유봉에서 복구하기가 어렵 기 때문에 시료 분쇄를위한 분쇄기 시스템이 있습니다. 이 경우 작은 샘플이 모르타르 표면에 미세한 분말로 퍼지기 때문에 수집이 어려워집니다. 또 다른 장점은 분쇄기가 모터 구동되어 재현성있는 방식으로 더 많은 샘플을 처리 할 수 ​​있고 피로를 추가하지 않아도된다는 것입니다. 분쇄기의 사용에 대한 하나의 한계는 박격포가 박격포에 효과적으로 눌려 지도록 작아야하는 시료 크기 (100mg 이하)입니다. 또한, 분쇄기 구성 요소는 세척을위한 사용 사이에서 실온으로 가온되어야합니다 지. 결과적으로, 절차는 시간 소모적이며 많은 샘플이 매일 처리되는 경우 많은 세...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이탈리아 보건부는이 연구를 지원했습니다 (RC 2013-BIO 15). 그녀는 훌륭한 기술 지원을 해주신 Barbara Micheli에게 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
식염수 0.9% NaCl
Eurocollins ASALF30874046균형 장기의 수송 매체. 400mL의 유로콜린 A와 100mL의 유로콜린 B를 결합하여 균형 잡힌 배지인 유로콜린
유로콜린 BSALF30874022균형 장기의 수송 매체를 얻습니다. 400mL의 Eurocollins A와 100mL Eurocollins B를 결합하여 균형 잡힌 배지 Eurocollins
WisconsinBridge lifeRM/N 4081Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow airBurdinolaClass A GMP classification
Dewar FlaskThermo ScientificNalgene 4150-1000
Cryogrinder systemOPS diagnosticsCG 08-01모르타르, 유봉 및 스크루 드라이버가 포함 된 그라인더 시스템
스테인레스 스틸 집게
스테인레스 스틸 주걱
일회용 멸균 메스MedisafeMS-10
스테인레스 스틸 가위오토 클레이브 가능
스테인레스 스틸 픽오토 클레이브 가능
일회용 멸균 드레이프Mon & Tex3.307.08
이소프로필 알코올70% 이소프로필 알코올
살균 용액 과산화6% 과산화수소
마이크로피펫, 1mL, 팁
포함 15mL 원심분리기 튜브VWR international9278
1.7mL 원심분리기 튜브VWR 국제PIER90410
요소 버퍼8 M 요소, 2 M 티오우레아, 4 % w/v CHAPS, 20 mM 트리즈마, 55 mM 디티오트레이톨
우레아 시그마 알드리치U6504-1KG요소 버퍼
티오우레아시그마 알드리치T8656요소 버퍼
CHAPS시그마 알드리치C3023-5GR요소 버퍼
에 사용DithiotreitolSigma aldrichD0632-5G요소 버퍼
주사기에 사용 50 mLPIC를 필터링하는 데 사용됩니다
. m 필터MilliporeSLGP033RB요소 완충액
PFTE Pestle, 2mLKartell6302Potter-Elvehjem 균질화기
붕규산 유리 모르타르Kartell6102Potter-Elvehjem 균질화기
교반기 VELPscientifica교반기 DLHPotter-Elvehjem Bradford 단백질 분석에 의한 균질화에 사용
Bio-Rad 실험실5000006
튜브 로테이터Pbi InternationalF205
액체 질소
알루미늄 호일
아이스
폴리스티렌 상자
드라이 아이스
원심 분리기13,000 x g 냉동고에서 1.7 mL 원심분리 튜브의 원심분리용
-80° C
정밀 균형
멸균 용 오토 클레이브
액체 질소
장갑
전문 강제 환기 및 자연 공기 대류 오븐살균
프로테아제 억제제 칵테일Sigma aldrichP8340-5ML100X 솔루션
ProteoExtract 단백질 침전 키트Calbiochem539180
RapiGestWaters186001861
Cytoscapewww.cytoscape.org버전 2.7유전자 온톨로지 분석을 위한 소프트웨어 플랫폼
BiNGOhttp://apps.cytoscape.org/apps/bingo 버전 3.0.3플러그인 유전자 온톨로지 분석용
AlphaB Crystallin/CRYAB 항체Novus BiologicalsNBP1-97494
Septin-11 항체Novus BiologicalsNBP1-83824Septin-11
FHL1 항체Novus BiologicalsNBP-188745FHL-1
Dermatopontin 항체Novus BiologicalsNB110-68135더마토폰틴에 대한 토끼 다클론 항체
염소 안티 마우스 IgG HRP시그마 알드리치A4416-0.5ML면역 블로팅을 위한 2차 항체
염소 안티 토끼 IgG HRPBio-Rad 실험실170-5046면역 블로팅을 위한 2차 항체
수소 요소 버퍼 0.22 µ의 일부 용 극저온 장갑 CryAB 에 대한 마우스 단클론 항체 에 대한 토끼 다클론 항체 에 대한 토끼 다클론 항체

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