Method Article

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

DOI:

10.3791/55765

⸱

June 15th, 2017

 , 
1Transgenic Animal Unit, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.

Abstract

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유전자 조작 마우스의 사용은 생체 내 및 병리학 적 생체 내 과정 모두에 대한 연구에 크게 기여했다. 수정 된 난 모세포 내로의 DNA 발현 구조물의 전 핵 주입은 과발현을위한 형질 전환 쥐를 생성하는 가장 보편적 인 기술로 남아있다. 유전자 표적화를위한 CRISPR 기술이 도입됨에 따라 수정 된 난 모세포에 전핵을 주입하여 knockout과 knockin 마우스를 생성 할 수있게되었다. 이 연구는 유전자 타겟팅을위한 사출 용 DNA의 준비와 CRISPR 가이드의 생성을 기술하고 있으며 특히 품질 관리에 중점을두고 있습니다. 잠재적 인 창시자를 확인하는 데 필요한 유전형 분석 절차가 중요합니다. CRISPR의 "멀티플렉싱"기능을 활용하는 혁신적인 유전자형 전략이 여기에 제시됩니다. 수술 절차도 요약되어 있습니다. 함께, 프로토콜의 단계는 세대의 생성을 허용합니다면역학, 신경 과학, 암, 생리학, 발달 및 기타를 포함한 수많은 연구 분야에서 마우스 식민지를 확립하는 데 사용됩니다.

Introduction

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척추 동물과 무척추 동물의 동물 모델은 알츠하이머 병과 같은 인간의 병태 생리학을 검사하는 도구가되어왔다. 그들은 질병 치료제를 찾고 궁극적으로 완치를위한 새로운 치료 전략을 개발할 수있는 귀중한 도구이기도합니다. 각 모델에는 본질적인 한계가 있지만, 전신 모델로 동물을 사용하는 것은 생물 의학 연구에 필수적입니다. 이것은 신진 대사와 복잡한 생리 환경이 조직 배양에서 완전히 모의 될 수 없기 때문입니다.

지금까지 마우스는 유전자 조작에 사용되는 가장 일반적인 포유류 종으로 남아 있기 때문에 몇 가지 장점이 있습니다. 질병과 관련된 생리적 과정과 유전자는 생쥐와 인간 사이에서 매우 잘 보존되어 있습니다. 마우스는 인간 게놈보다 일년 전에 (2002 년) 전체 유전체 염기 서열을 갖는 최초의 포유 동물이었다.나 (2003). 이 풍부한 유전자 정보 외에, 번식 능력이 좋고 발달주기가 빠르며 (수정으로부터 이유식까지 6 주) 적당한 크기입니다. 뚜렷한 외투 색상 (교차 전략에 필요)과 같은 생리적 인 지표와 결합 된 이러한 모든 장점은 마우스를 유전자 조작을위한 매력적인 모델로 만들었습니다. 주목할 만하게, 현대 유전학의 아주 이른 나이에서는, Gregor Mendel는 식물 3으로 움직이기 전에 쥐....

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Protocol

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모든 절차는 뉴 사우스 웨일즈 동물 보호 및 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. Transgene의 준비 (Random Integration)

  1. 분석 아가 로스 겔 전기 영동.
    1. 제조자의 권고 사항을 따르는 thermocycler에서 적절한 효소 (1 시간 배양) 또는 빠른 분해 효소 (15 ~ 30 분 배양)를 사용하여 도입 유전자를 제거하기 위해 플라스미드를 분해하십시오 ( 그림 2A 및 그 전설 참조).
    2. 0.5 ~ 1.0 μg / ML ethidium bromide (EtBr)로 염색 한 1 % 트리스 - 아세테이트 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (TEA) 아가로 오스 겔을 주조합니다.
      참고 : EtBr을 사용할 때는주의하십시오. 그것은 유력한 돌연변이 원입니다. 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오 (물질 안전 보건 자료 참조).
    3. 1 kb 분자량 마커를로드하십시오.
    4. 선형화 된 조각 ( 즉, 도입 유전자 및 백본)을로드하십시오.
    5. 전기 영동을 100V에서 45 분 동안 실행합니다.
    6. 자외....

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Results

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아래에서, 무작위 통합 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅의 경우 microinjection에 대한 워크 플로우가 설명됩니다 ( 그림 1 ).

figure-results-1
그림 1 : 유전자 조작 마우스의 일반적인 워크 플로. 무작위 적으로 통합하기 위해 정화 된 형질 도입 유전자는 배란 된 수양 암컷으로 난 피가 전달되기 전에 수정 된 난 모세포의 전핵으로 주입된다. 자손 분석은 빠른 게놈 DNA 추출 후 PCR로 수행됩니다. CRISPR 유전자 표적화를 위해, sgRNA는 여기에 기술 된 비 - 클로닝 방법을 사용하여 합성되고, 2 개의 가이드가 수정 된 난.......

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Discussion

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프로토콜 내 중요 단계

유전자 변형 마우스의 생성은 기술적으로 어려운 것으로 알려져 있습니다. 그러나 여기에 제시된 프로토콜은 기록적인 시간에 기술을 마스터하고 문제를 해결할 수 있도록 최적화되고 단순화 된 방법입니다. 이 기술을 성공적으로 완료하려면 두 단계가 필요합니다. 첫째, 염화 마그네슘 (MgCl 2 )없이 선형 DNA 템플릿 (sgRNA 합성 용)의 합성이 가능합니다. 그러나 포워드 프라이머의 부분 하이브 리다이 제이션이 종종 MgCl 2 가없는 경우에 방지되기 때문에 체계적으로 마스터 믹스에 MgCl 2 를 첨가하는 것이 좋습니다. 또한, 표적 게놈 서열이 기증자 템플레이트 (표적화 된 통합의 경우)의 어느 부분에도 존재하지 않는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 Cas9 핵산 분해 효소가 그것을 절단하여 HDR의 발생을 방지한다.

수정및 문제 해결

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Disclosures

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저자는 University of New South Wales의 Mark Wainwright Analytical Center를 통해 마우스에서 학술적 전이 서비스를 제공합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 지속적인 지원을 위해 동물 시설 (BRC) 직원에게 감사를드립니다. 이 작품은 국가 건강 및 의학 연구 협의회 (National Health and Medical Research Council)와 호주 연구위원회 (Australian Research Council)의 지원을 받았다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
마이크로 피펫 0.1-2.5 μ LEppendorf4920000016
Micropipette 2 - 20 μ LEppendorf4920000040
Micropipette 20 - 200 μ LEppendorf4920000067
Micropipette 100 - 1,000 μ LEppendorf4920000083
분자량 마커 BiolineBIO-33025HyperLadder 1 kb
분자량 마커 BiolineBIO-33056HyperLadder 100 bp
아가로스BiolineBIO-41025
EDTA 완충액Sigma-Aldrich9329610x - 1x
에티듐 브로마이드로Thermo Fisher Scientific15585011
SYBR 안전 겔 염색InvitrogenS33102
겔 추출 키트Qiagen28706
PCR 정제 키트(Qiaquick)Qiagen28106
진공 시스템(매니폴드)PromegaA7231
뉴클레아제가 없는 미세주입 버퍼 MilliporeMR-095-10F
Ultrafree-MC 마이크로 원심분리기 필터 Millipore UFC30GV00
Cas9 mRNASigma-AldrichCAS9MRNA
CRISPR 발현 플라스미드 (px330)Addgene42230
Nuclease free waterSigma-AldrichW4502
Phusion polymeraseNew England BiolabsM0530L
T7 Quick High Yield RNA kitNew England BiolabsE2050S
RNA 정제 스핀 컬럼 (NucAway)Thermo Fisher ScientificAM10070
ssOligosSigma-AldrichOLIGO STANDARD
Donor plasmidThermo Fisher ScientificGeneArt
HyaluronidaseSigma-AldrichH3884
KSOMaa 배아 배양 배지Zenith Biotech ZEKS-100
미네랄 오일Zenith Biotech ZSCO-100
M2 매체Sigma-AldrichM7167
사이토칼라신 BSigma-AldrichC6762
마우스피스Sigma-AldrichA5177
유리 미세모세관Sutter InstrumentBF100-78-10
Proteinase KApplichemA3830.0100
Dumont #5 forceps고급 과학 도구 91150-20
아이리스 가위파인 사이언스 도구 91460-11
선박 클램프파인 사이언스 도구 18374-43
상처 클립 고급 과학 도구 12040-01
클립 적용 고급 과학 도구 12018-12
마이크로 가위 고급 과학 도구 15000-03
소작기파인 사이언스 도구 18000-00
비흡수성 수술용 봉합사 (Ethilon 3-0)Ethicon1691H
5% CO2 인큐베이터MG ScientificGalaxy 14S
분광광도계Thermo Fisher ScientificNanodrop 2000c
ThermocyclerEppendorf6321 000.515
Electrophoresis setupup BioRad1640300
UV TransilluminatorBioRad1708110EDU
ThermocyclerEppendorf6334000069
실체 현미경OlympusSZX7
도립 현미경OlympusIX71
2x MicromanipulatorsEppendorf5188000.012
난모세포 매니퓰레이터Eppendorf5176000.025
Microinjector (Femtojet)Eppendorf5247000.013
마우스 C57BL/6J 스트레인Australian BioResourcesC57BL/6JAusb 
희석 제

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
  2. Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice. ....

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