Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석

Summary

세포 간 접합은 유선의 단계별 기능과 발달에 필수적입니다. 이 원고는 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs) 연구를위한 상세한 프로토콜과 쥐 유방 땀샘을 이용한 공동 위치 파악을 제공합니다. 이러한 기술은 서로 다른 발달 단계에서 세포 간 접합 사이의 물리적 연관성의 역 동성을 조사 할 수있게 해줍니다.

Abstract

세포 - 세포 상호 작용은 조직의 보전과 유방의 여러 구획 사이의 장벽을 보존하는 데 중추적 인 역할을합니다. 이러한 상호 작용은 인접 세포간에 넥서스를 형성하는 접합 단백질에 의해 제공됩니다. Junctional protein mislocalization과 결합 파트너와의 물리적 연관성 감소는 기능 상실, 결과적으로 장기 기능 부전을 초래할 수 있습니다. 따라서 정상 및 질병 관련 조직에서 단백질 위치 파악 및 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)을 확인하는 것은 발달 상태의 질병이나 변화의 진행을 유도하는 새로운 증거와 메커니즘을 찾는 데 필수적입니다. 이 원고는 마우스 유선에서 PPI를 평가하는 2 단계 방법을 제시합니다. 프로토콜 섹션 1에서는 관심있는 단백질에 대해 생성 된 항체와 형광 색소로 표지 된 2 차 항체를 사용하여 동시 면역 형광 (co-immunofluorescence) (co-IF)을 수행하는 방법을 설명합니다. co-IF all단백질의 근접성을 입증해야하기 때문에 신체적 상호 작용을 연구하는 것이 가능합니다. 따라서 co-immunoprecipitation (co-IP)에 대한 자세한 프로토콜은 프로토콜 섹션 2에 나와 있습니다.이 방법은 이러한 상호 작용이 직접적인지 간접적인지를 확인하지 않고 단백질 간의 물리적 상호 작용을 결정하는 데 사용됩니다. 지난 몇 년 동안 co-IF 및 co-IP 기술은 유 전선 발달 동안 변이성 접합부 연결을 생성하면서 세포 간 접합의 특정 구성 요소가 함께 위치하고 상호 작용한다는 것을 입증했습니다.

Introduction

유선의 성장 및 발달은 주로 출생 후 발생합니다. 이 기관은 포유류의 번식을 통해 끊임없이 변모합니다 ¹ . 성인 유선 선 상피는 내막 상피 세포의 내층과 기저 세포의 외층으로 이루어져 있으며, 주로 상피 세포로 이루어져 있으며 기저막으로 둘러싸여있다. 유선 구조와 발달에 대한 좋은 검토를 위해 독자는 Sternlicht ¹ 을 참고할 수 있습니다. 글 랜드 ^{1 , 3 , 4 , 5 , 6} 의 정상적인 발달과 기능을 위해서는 gap (GJ), tight (TJ), adherens (AJ) junction을 통한 세포 - 세포 상호 작용이 필요합니다. 쥐 유선에서 이들 접합부의 주요 구성 요소는 Cx26, Cx30, Cx32 및 Cx43 (GJ)입니다. 클로 딘 -1, -3, -4, -7 그리고ZO-1 (TJ); 및 E-cadherin, P-cadherin 및 β-catenin (AJ) ^....

Protocol

이 연구에서 사용 된 모든 동물 프로토콜은 University Animal Care Committee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada)의 승인을 받았습니다.

1. 단백질 공 동화 확인

1. 조직에서 현미경 슬라이드까지
   참고 : 조직 및 섹션은 드라이 아이스로 처리해야합니다.
   1. 동물에서 유선을 절단하십시오 (이 절차에 대한 완전한 설명은 Plante et al. 참조 ⁾ . ¹⁴ .
   2. 드라이 아이스에 동결 / 장착 매체에 excised 조직을 삽입하십시오. 글 랜드를 덮기에 충분한 매질을 첨가하십시오. 배지가 고형화되면 나중에 -80 ℃에서 냉동실로 옮겨 조직을 만듭니다 ⁹ .
   3. cryomicrotome을 -35 ° C 이하로 설정하고 조직을 7-10 μm 두께의 절편으로 자르고 현미경 슬라이드 위에 놓습니다.
      참고 : 가능하면 각 슬라이드에 두 개의 섹션을 배치하십시오. 왼쪽 섹션은예를 들어 항체의 특이성과 조직의 자기 형광을 확인하....

Results

유방 내에서 GJ, AJ 및 TJ 성분이 상호 작용할 수 있는지를 결정하기 위해 co-IF 분석이 먼저 수행되었습니다. GJ 단백질 인 Cx26과 AJ 단백질 인 β-Catenin을 각각 특정 항체로 탐침하고 fluorophore-conjugated 마우스 -647 (녹색, pseudocolor) 및 염소 -568 (적색) 항체를 사용하여 나타냈다 ( 그림 1B 및 C ) . 데이터는 노란 색 ( 그림 1D )에 의해 반영된 바와 같이, 수유 일 7 일 (L7)에 생쥐 유선에서 상피 세포의 세포막에 공동 위치하는 것으로 나타났다. 둘째, TJ 단백질 인 Claudin-7; E-cadherin, AJ 단백질; 및 GJ 단백질 인 Connexin26 (Cx26)을 각각 특이 적 항체로 탐침하고 형광 발색 된 토끼 -488 (녹색), 마우스 -555 (적색) 및 마우스 -647 (산호.......

Discussion

접합부를 통한 세포 - 세포 상호 작용은 유방샘과 같은 많은 기관의 적절한 기능과 발달에 필요합니다. 연구 결과 junctional 단백질은 서로의 기능과 안정성을 조절할 수 있고 세포막에서 서로 연결되어 신호 전달을 활성화 할 수 있습니다. 현재의 원고에 제시된 프로토콜은 접합 단백질의 차별화 된 발현, 위치 및 정상적인 쥐의 혈관 발달 중 상호 작용에 대한 흥미있는 발견을 제공했다. junctional 단백질의 위치가 단백질의 기능에 중요하며, scaffolding 단백질 및 수많은 kinase와 상호 작용하는 것으로 알려져 있기 때문에, co-IF 및 co-IP는 세포 - 세포 상호 작용 분야에서 효과적인 기술이다. 이러한 방법은 유선 개발과 관절 연접에서 연결 관절의 필요성을 계몽하는 데 필수적 일뿐만 아니라유방암의 조절에도 도움이되지만 다른 조직이나 세포주를 이용한 실험에서도 사용할 수 있습니다.

유선은 2 개의 주요 구획으로 이루어져 있습니다 : 간질과 상피

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
생쥐 균주 및 단계	St. Constant, Quebec, Canada		C57BL/6 Femals; 임신 18일(P18) 및 수유일 14일(L14), 캐나다 찰스 리버
PBS 10x (재고)			1) 80g NaCl (FW : 58.44), 2g KCl (FW 74.55), 26.8g Na2< / sub>HPO4< / sub> &# 183을 용해시킵니다. 800 mL 증류수 중 7H2O (FW 268.07) 및 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09); 2) PH를 7.4로 조정합니다. 3) 1L의 최종 부피에 도달하도록 물을 추가합니다.
TBS 10x (stock)			1) 800 mL 증류수에 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl을 용해시킨다. 2) pH를 7.5로 조정합니다. 3) 1L의 최종 부피에 도달하도록 물을 추가합니다.
Part 1: Immunofluorescence
freezing media	VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada	95067-840	VMR 동결 절편 화합물
Microtome	Mississauga, ON, Canada	956640	Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades	C.L. Sturkey, Inc. Les Produits  사이언티피크  에스베  St-Laurent, QC, 캐나다	BLM1001C	고급 금도금 블레이드
Pap pen	Cedarlane, Burlington, ON, Canada	8899	Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	12-550-15	Fisherbrand  Superfrost Plus 현미경 슬라이드
포름알데히드	BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada	FOR201.1	Forlmadehyde
소 혈청 알부민(BSA)	Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
용액			TBS 세척 용액
			BSA TBS-Tween 20 0.1%
폴리소르베이트 20	Oakville, ON, Canada	P 9416	Tween 20, Sigma-Aldrich
마운팅 미디어	Cedarlane, Burlington, ON	17984-25(EM)	Fluoromount-G
First & secondary antibodies	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	코멘트 보기	E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling
1차 및 2차 항체	생명 기술, 월섬, 매사추세츠, 미국 & Cell Signaling, Beverly, MA, USA	코멘트 보기	Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)
1차 및 2차 항체	Santa Cruz Biotechnology, Inc, 캘리포니아, 미국; Fischer Scientific, 캐나다 온타리오주 벌링턴	코멘트 보기	β-Catenin 항체 (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular probe (Fisher Scientific)
1차 & 2차 항체	생명 기술, 월섬, 매사추세츠, 미국 & Cell Signaling, Beverly, MA, USA	코멘트 보기	Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) 안티-마우스 IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)
핵 염색	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	D1306	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
형광 현미경	Nikon Canada, Mississauga, On, Canada		Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector
IF 이미지 분석 소프트웨어	Nikon Canada, Mississauga, On, Canada		NIS-elements 소프트웨어 (버전 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100  mL) pH=8.0			1) 50mM TRIS (FW: 121.14), 150  mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% 아지드화나트륨, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트 80 mL 증류 H2O. 2) HCl 6 로 pH를 8.0으로 조정; N (~0.5  mL). 3) 부피를 100 로 조정합니다. mL. 냉장고에 보관하십시오. 단백질 추출 당일에는 1/100 NaVo3, 1/100 프로테아제/인산가수분해효소 억제제 및 1/25 NAF를 계산된 양으로 사용하십시오. 트리플 세제 용해 완충액: Sodium Fluoride (stock) 용액 1.25  M (FW : 41.98), Sodium Orthovanadate (재고) 용액 1  M (F.W.: 183.9)
프로테아제/인산가수분해효소 억제제	Fisher Scientific, Burlington, ON	78441	Halt 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일, EDTA-free (100x)
단백질 투여량	Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA	23225	Pierce BCA 단백질 분석 키트
조직 분쇄	Fisher Scientific, Burlington, ON	FTH-115	Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand	Millipore, Etobicoke, ON, Canada		PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP			PBS or PBS-Tween20 단계에 따라 0.1%
차 면역침전	세포 신호전달, Beverly, MA, USA	의견보기	: IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb, IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µ L/200 &마이크로; L
면역침전 세포 신호전달을 위한 1차 항체	, Beverly, MA, USA	코멘트 참조	IgG 마우스 마우스(G3A1) mAb IgG 동형 제어(#5415s) (세포 신호) 0.5 &마이크로; L/200 &마이크로; L
면역침전에 대한 1차 항체	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada	의견 참조	Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4  &마이크로; L/200  &마이크로; L
Primary antibodies for immunoprecipitation	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	코멘트 참조	E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µ L/200 &마이크로; L
Laemmli 버퍼	BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada	1610747	4x Laemmli 샘플 버퍼 (제조업체 권장 사항에 따라 β-mercaptoethanol 추가)
산성 글리신	Fisher Scientific, Burlington, ON	PB381-5	0.2 M 글리신; HCl 로 pH=2.5 조정;
트리스	피셔 사이언티픽, 벌링턴, ON	BP152-1	1 M (pH=8)
SDS-PAGE 아크릴아미드 젤	BIO-RAD, 미시소거, 온타리오, 캐나다	1610180 -5	TGX 얼룩 없는 FastCast 아크릴아미드 용액 (7.8%, 10%, 12%)
러닝 버퍼 10x	BIO-RAD, 캐나다 온타리오주 미시소거	1704272	Tris 30.3  g/글리신 144.1  g /SDS 10  g in 1 L 증류수
멤브레인	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1704272	PVDF 멤브레인, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
전송 방법	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1704155	Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk	Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada		Fat Free Instant Skim Powder, Carnation
Blocking solution 블롯			TBS-Tween 20의 5% 분유 0.1%
블롯			TBS-Tween 20 0.1%
블롯에 대한 1차 및 2차 항체(10  mL)	Sigma-Aldrich, 오크빌, 온타리오 & Abcam, Toronto, ON, Canada	의견 보기	Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
블롯에 대한 1차 및 2차 항체 (10  mL)	Cell Signaling, 미국 매사추세츠주 베벌리 & Abcam, Toronto, ON, Canada	코멘트 보기	E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
롯에 대한 1차 및 2차 항체 (10  mL)	Life technologies, 미국 매사추세츠주 월섬 & Abcam, Toronto, ON, Canada	코멘트 보기	Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
블롯에 대한 1차 및 2차 항체 (10  mL)	Life technologies, 미국 매사추세츠주 월섬 & Abcam, Toronto, ON, Canada	코멘트 보기	Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1705061	Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blots	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1708280	ChemiDoc MP imaging 시스템
애널레이징 블롯	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada		ImageLab 5.2 소프트웨어