만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

Summary

이 연구는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자에서 차별적으로 메틸화 된 CpG가 풍부한 부위를 확인하기 위해 최적화 된 메틸 -CpG 결합 도메인 (MBD) 시퀀싱 프로토콜과 계산 파이프 라인을 설명합니다.

Abstract

암에서의 긴 비 암호화 RNAs (lncRNAs)의 역할은 암 발달 및 진행 동안 그들의 기계적 기능을 이해하는데 점점 더 많은 관심을 가지고 있기 때문에 최전선에 서있다. 그럼에도 불구하고, lncRNA 및 암에서의 반복 서열에 대한 전 세계적 후성 조절은 특히 만성 림프 구성 백혈병 (CLL)에서 잘 조사되지 않았다. 이 연구는 독특한 접근 방식에 초점을 맞추고 있습니다 : 메틸 결합 도메인 (MBD) 단백질을 사용한 이중 가닥 메틸화 DNA 단편의 면역 침전 기반 포획, 차세대 시퀀싱 (MBD-seq). 2 개의 예후 소그룹에 속하는 CLL 환자 샘플 (5 개의 IGVH 돌연변이 샘플 + 5 개의 IGVH 돌연변이 샘플)이이 연구에 사용되었다. 분석 결과 정상 건강한 대조군에 비해 5,800 개의과 메틸화 및 12,570 개의 저 메틸화 CLL 특이 적 차별화 메틸화 유전자 (cllDMGs)가 밝혀졌습니다. 중요하게,이 결과는 몇몇 CLL 특이적이고 차별적으로 메틸화 된 lncRNA를 확인했다.소수성 요소 및 잠재적 인 예후 가치를 지닌 단백질 코딩 유전자를 포함한다. 이 연구는 CLL 환자 샘플을 사용하여 고도의 CpG가 풍부한 지역에서 전 세계적으로 메틸화 프로필을 포괄적으로 분석하기 위해 개발 된 MBD-seq 및 생물 정보학 파이프 라인에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 코딩 코딩 유전자와 lncRNA는 파이로 시퀀싱 (pyrosequencing)을 사용하여 검증되었으며, 이는 MBD-seq 프로토콜의 결과를 뒷받침하기 위해 CpG 메틸화 수준을 분석하는 고도의 정량 방법이다.

Introduction

최근 전 세계적 DNA 메틸화 프로파일을 분석하기위한 차세대 시퀀싱 기술의 사용이 증가하고 있습니다. 게놈 DNA의 bisulfite 변환, 메틸화 민감성 제한 효소 소화 및 메틸 CpG 특이 적 항체를 이용한 메틸화 DNA의 면역 침전 (immunoprecipitation)을 바탕으로 마이크로 어레이 및 비 마이크로 어레이 기반의 방법을 포함한 게놈 차원의 메틸화 분석법을 개발했다. .

불규칙한 DNA 메틸화는 만성 림프 성 백혈병 (CLL)을 비롯한 백혈병 및 림프종의 특징 중 하나입니다. 이전에, 우리를 포함한 여러 그룹은 게놈 DNA의 bisulfite 전환을 사용하여 다른 CLL 예후 소그룹과 정상, 건강한 B 세포 컨트롤의 DNA 메틸화 프로파일을 특징으로했으며, 마이크로 어레이 기반 방법 또는 전체 게놈 시퀀싱 ^{1 , 2 , 3 , 4. 게놈 DNA의 바이 설 파이트 전환은 변형되지 않은 시토신의 우라실로의 탈아 민화를 가져오고 변형 된 메틸화 시토신을 게놈에 남긴다. 일단 변환되면, DNA의 메틸화 상태....}

Protocol

CLL 샘플 수집에 대한 윤리적 승인은 2007-05-21에서 다음 등록 번호와 함께 제공됩니다 : EPN Gbg dnr 239/07. 최근 개정 기준 ⁸ 에 따라 모든 CLL 환자를 진단하고 진단 당시 샘플을 수집했습니다. 연구에 참여한 환자들은 서면 동의를 얻은 후에 스웨덴 서부 지역의 여러 혈액학 부서에 포함되었습니다. 이 연구에서 백혈병 세포의 종양 백분율이 70 % 이상인 CLL 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플 만이 연구에서 선택되었다.

1. 준비 사항

1. 제조 업체의 지침에 따라 상용 격리 키트 ( 재료 표 참조)를 사용하여 CLL 및 정상, 건강한 말초 혈액 샘플에서 DNA 추출을위한 PBMC를 분리합니다.
2. 오토 클레이브 1.5 mL 튜브. 메틸화 DNA 결합 키트의 모든 시약을 해동하십시오 ( 재료 표 참조).
3. DNase가없는 물을 사용하여 키트가 제공하는 5x 스톡 세척 완충액에서 1x 비드 세척 완충액을 준비하고 키트에서 제공하는 MBD 단백질을 희석하고 묽게하십시오.
4. 다음 물품을 사전에 준비하거나 준비하십시오 : 3M 초산 나트륨, 절대 ....

Results

MBD-seq는 최근 CLL 환자와 일치하고 정상적인 건강한 대조군에서 CLL 특이 적으로 차별화 된 과민성 및 저 메틸화 유전자를 확인하기 위해 수행되었다. CLL과 정상 건강한 샘플에서 생성 된 데이터를 분석하는 데 사용되는 실험 및 생물 정보 파이프 라인은 그림 1A 및 1B 에 나와 있습니다. 이 분석은 IGHV- 돌연변이 및 IGHV- 돌연변이 된 샘플로부터 유의 적으로과 / 저 메틸화 된 몇몇 CLL 특이 적 차별 메틸화 부위 (cllDMRs)를 대조 샘플과 비교하여 p 값 <0.00001로 확인 하였다. 그림 2A 는 정상 B 세포와 정상 PMBC 비교에서 얻은 모든 cllDMRs를 보여줍니다. 모든 cllDMR은 그림 2B<.......

Discussion

MBD-seq는 비용 효율적이고 면역 침전에 기초한 기술로 완전한 게놈 범위로 메틸화 패턴을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. MeDIP seq (methylated DNA immunoprecipitation과 sequencing)와 MBD-seq는 모두 CpG가 풍부한 methylated DNA를 풍부하게 만든다. 그러나, MBD-seq는 MeDIP seq ¹⁹ 와 비교할 때 높은 CpG가 풍부한 영역에 대한 결합에 대해 더 많은 친화도를 나타낸다. 메틸 결합 농축 키트를 사용하여 DNA를 고염소 및 저염 완충액으로 각각 용리하여 높은 CpG 및 낮은 CpG가 풍부한 영역으로 DNA를 분별 할 수 있습니다. 이 조사에서 CpG 섬의 대부분을 차지하는 고농축 CpG가 풍부한 지역을 포획하기 위해 단 하나의 분획물의 용출 만 수행되었습니다.

MBD-seq는 CLL 및 기타 백혈병 조사에서 일반적으로 사용되는 WGBS의 강력한 대안이 될.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dneasy 혈액 및 조직 키트	Qaigen	69504
림프렙 용액	A X I S-S H I E L D
Nano drop 2000	Thermo Fischersceintific
TE buffer pH 8	Sigma aldrich	93283
Bioruptor 표준 초음파 처리 장치	Diagenode	UCD-200
TPX bioruptor 튜브 1.5 mL	Diagenode	C30010010-300
3 M 나트륨 아세테이트	Diagenode	C03030002
E-gel iBase 안전 이미저 콤보 키트	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-gel 2% 아가로스 겔	Thermo Fischersceintific	G441002
메틸미너 메틸화 DNA 농축 키트	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
Vortex mixer	VWR	12620-848
Absolute Ethanol	Any company
70% Ethanool	Any company
DNAse free	water Milli Q
DNA 침전제(3M 아세트산나트륨)	Diagenode	C03030002
Safe seal 1.5 mL eppendorf tubes	Eppendorf	4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0.5 mL tubes	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	thermo Fischersceintific	Q32866
Illumina Hiseq2000 플랫폼	Illumina
Water  Bath	Grant Heat
블록	그랜트
튜브 회전기	Labquake