Cpf1을 이용한 C-Brick DNA 표준 어셈블리 프로토콜

요약

CRISPR 관련 단백질 Cpf1은 원하는 위치에서 이중 가닥 DNA를 절단하여 끈적 거리는 말단을 생성하도록 특별히 고안된 CRISPR RNA (crRNA)에 의해 유도 될 수 있습니다. 이 특성을 바탕으로 DNA 어셈블리 표준 (C-Brick)이 수립되었으며 여기에 그 사용법을 자세히 설명하는 프로토콜이 설명되어 있습니다.

초록

CRISPR 관련 단백질 Cpf1은 CRISPR RNA (crRNA)의지도하에 이중 가닥 DNA를 절단하여 끈적 거리는 말단을 생성합니다. 이러한 특성 때문에 Cpf1은 C- 브릭 (C-Brick)이라는 DNA 어셈블리 표준의 확립에 사용되어 오랜 인식 사이트와 짧은 흉터의 장점을 가지고 있습니다. 표준 C-Brick 벡터에는 접두어 (T1 및 T2 사이트)와 접미어 (T3 및 T4 사이트) - 생물학적 DNA 부분이 인접한 4 개의 Cpf1 인식 사이트가 있습니다. T2 및 T3 부위의 절단은 상보적인 끈적한 말단을 생성하여 T2 및 T3 부위를 갖는 DNA 부분의 조립을 허용한다. 한편 조립 후 부품 사이에는 짧은 "GGATCC"흉터가 생깁니다. 새로 형성된 플라스미드가 다시 4 개의 Cpf1 절단 부위를 포함하기 때문에이 방법은 BioBrick 및 BglBrick 표준과 유사한 DNA 부분의 반복적 조립을 가능하게합니다. C-Brick 표준을 사용하여 DNA 부품을 조립하는 절차여기에 설명되어 있습니다. C-Brick 표준은 과학자, 대학원생, 학부생, 심지어 아마추어들까지 광범위하게 사용할 수 있습니다.

서론

DNA 생물학적 부분의 표준화는 합성 생물학 ¹ 의 개발에 중요합니다. DNA 조립 절차의 개발은 임시 실험 설계를 대체 할 수 있고 유전체 구성 요소를 대형 시스템으로 조립하는 동안 발생하는 예기치 않은 결과를 제거 할 수 있습니다. BioBrick 표준 (BBF RFC 10)은 가장 초기에 제안 된 DNA 어셈블리 표준 중 하나였습니다. 접두어 시퀀스 (EcoRI 및 XbaI 절단 사이트 포함)와 접미사 시퀀스 (SpeI 및 PstI 절단 사이트 포함) ^{2 , 3을 사용} 합니다. XbaI와 SpeI는 상호 보완적인 응집력을 지니고 있기 때문에 XbaI와 SpeI로 절단 된 BioBrick DNA 부품을 결합하여 추가 반복 조립을위한 새로운 BioBrick을 생성 할 수 있습니다.

일부 결함은 BioBrick 표준을 사용하여 확인되었습니다. 예를 들어, 8-bp 흉터를 생성합니다.융합 단백질을 만들 수없는 DNA 부분들 사이. 게다가 위에서 언급 한 네 종류의 6-bp 제한 효소 부위는 DNA 부분에서 제거해야하므로 매우 불편합니다. BglBrick 표준은 첫 번째 문제를 해....

프로토콜

1. crRNA의 제조

1. crRNA 주형의 제조
   1. RNase가없는 물에서 10 μM의 농도로 개별 올리고 뉴클레오티드 ( 표 1 )를 재현 탁하십시오.
   2. 상단 스트랜드 올리고 뉴클레오티드 ( 표 1의 T7-F) 22.5 μL, 하단 스트랜드 올리고 뉴클레오티드 22.5 μL ( 표 1 ) 및 10 mL 어닐링 완충액 5 μL를 0.2 mL PCR 튜브에 첨가한다. 총 부피가 50 μL인지 확인하십시오.
      참고 : 6 개의 서로 다른 하단 가닥 올리고 뉴클레오타이드가 표 1 에 나와 있으며, 각각은 상단 가닥 T7-F와 개별적으로 쌍을 이루어야합니다. 표 1의 소문자는 crRNA의 가이드 시퀀스로 전사 될 서열을 나타낸다. 10x Taq PCR 버퍼는 10x 어닐링 버퍼 대신 사용될 수 있습니다.
   3. Thermocycler에 PCR 튜브를 놓습니다.
   4. 어닐링 프로그램을 실행하십시오 : 95 ° C에서의 초기 변성5 분 후 95 ~ 20 ° C의 재사용 대기 시간, 온도 조절기에서 1 분당 1 ° C 감소.
      참고 ....

결과

이 프로토콜은 세 가지 색소 카세트 (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) 및 amilGFP (BBa_K592010))의 조립을 시연했습니다. 먼저, 상기 3 가지 유전자 및 터미네이터의 코딩 서열을 개별적으로 C- 브릭 표준 벡터에 클로닝 하였다. 5 '말단에 짧은 DNA 부분을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 통해 짧은 DNA 부분, 프로모터 및 터미네이터를 C-Brick 벡터에 도입 하였다. 이것은 self-ligation 방법이 뒤 따른다. 3 개의 chromoprotein-encoding 서열을 먼저 de novo synthesis 한 후 C-Brick 표준 vector에 seamless assembly를 통해 복제 하였다. 프라이머는 이전의 연구 ^{4에서 기술} 되었다.

토론

이 프로토콜은 DNA 어셈블리 표준 C-Brick을위한 절차를 설명합니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 C-Brick 표준 벡터의 선형화입니다. 벡터가 불완전하게 절단되면 성공률에 심각한 영향을 줄 수 있습니다. 또한, Cpf1은 주로 "18-23"분열 패턴의 표적 DNA 서열을 절단하지만, 두 개의 염기 근처에서 부정확 한 절단이 또한 검출되었는데, 이는 DNA 조립 후 작은 수의 돌연변이를 일으킬 수있다. 따라서 Sanger 시퀀싱은 조립 된 구조물을 검증하는 데 필요합니다.

C-Brick 어셈블리의 효율은 이전의 연구 ⁴ 에서 기술 된 전통적인 제한 효소 및 결합 방법보다 낮습니다. 조립 효율에 영향을 미치는 주된 이유는 Cpf1의 부정확 한 분열 특성 일 수 있습니다. 장래에, 분열 정확도의 향상은 표준현재 탐색 중입니다.

C-Brick은 또한 Bgl.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Comercial 올리고뉴클레오티드	Sangon Biotech
10x Taq PCR 버퍼	형질전환	#J40928
초순수 증류수	Invitrogen	10977-015
5x RNA 전사 버퍼	Thermo Scientific	K0441
T7 RNA 중합효소	Thermo Scientific	#EP0111
NTP 혼합물	산곤	#ND0056
RRI (재조합 RNase 저해제)	Takara	2313A
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015
UV-Vis 분광계	Thermo Scientific	Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Buffer	Vazyme	PB505	PCR buffer
dNTP	Transgen	AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme	P505-d1
Ezmax for one-step cloning	Tolobio	24303-1	이음새 없는 조립 키트
Ezmax 원스텝 클로닝	Tolobio	32006
BamHI	NEB	#R0136L
BamHI-HF	NEB	#R3136L
BglII	NEB	#R0144L
XbaI	NEB	#R0145L
SpeI	NEB	#R3133L
10x 버퍼 3	NEB	#B7003S
10x CutSmart 버퍼	NEB	B7204S
10x T4 DNA 리가제 버퍼	Tolobio	32002
T4 PNK	Tolobio	32206
T4 DNA ligase	Tolobio	32210
DpnI	NEB	#R01762
SV Gel 및 PCR clean-up system	Promega	A9282
Plasmid Mini Kit I	Omega	D6943-02	플라스미드 준비 키트
열에 민감한 알칼리 인산가수분해효소	Thermo Scientific	#EF0651	FastAP
10x Cpf1 buffer	Tolobio	32008
Cpf1	Tolobio	32105	FnCpf1
thermocycler	Applied Biosystems	veriti 96 well
C-Brick standard vector	Tolobio	98101
E. coli [DH10B]	Invitrogen	18297010
Luria-Bertani 배지 (트립톤)	Oxoid	LP0042
Luria-Bertani 배지 (효모 추출물)	Oxoid	LP0021
Luria-Bertani 배지 (NaCl)	Sangon Biotech	B126BA0007

용 5x 버퍼;