방법 논문

Cpf1을 이용한 C-Brick DNA 표준 어셈블리 프로토콜

DOI:

10.3791/55775

⸱

2017년 6월 15일

 ,  , 
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR 관련 단백질 Cpf1은 원하는 위치에서 이중 가닥 DNA를 절단하여 끈적 거리는 말단을 생성하도록 특별히 고안된 CRISPR RNA (crRNA)에 의해 유도 될 수 있습니다. 이 특성을 바탕으로 DNA 어셈블리 표준 (C-Brick)이 수립되었으며 여기에 그 사용법을 자세히 설명하는 프로토콜이 설명되어 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR 관련 단백질 Cpf1은 CRISPR RNA (crRNA)의지도하에 이중 가닥 DNA를 절단하여 끈적 거리는 말단을 생성합니다. 이러한 특성 때문에 Cpf1은 C- 브릭 (C-Brick)이라는 DNA 어셈블리 표준의 확립에 사용되어 오랜 인식 사이트와 짧은 흉터의 장점을 가지고 있습니다. 표준 C-Brick 벡터에는 접두어 (T1 및 T2 사이트)와 접미어 (T3 및 T4 사이트) - 생물학적 DNA 부분이 인접한 4 개의 Cpf1 인식 사이트가 있습니다. T2 및 T3 부위의 절단은 상보적인 끈적한 말단을 생성하여 T2 및 T3 부위를 갖는 DNA 부분의 조립을 허용한다. 한편 조립 후 부품 사이에는 짧은 "GGATCC"흉터가 생깁니다. 새로 형성된 플라스미드가 다시 4 개의 Cpf1 절단 부위를 포함하기 때문에이 방법은 BioBrick 및 BglBrick 표준과 유사한 DNA 부분의 반복적 조립을 가능하게합니다. C-Brick 표준을 사용하여 DNA 부품을 조립하는 절차여기에 설명되어 있습니다. C-Brick 표준은 과학자, 대학원생, 학부생, 심지어 아마추어들까지 광범위하게 사용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA 생물학적 부분의 표준화는 합성 생물학 1 의 개발에 중요합니다. DNA 조립 절차의 개발은 임시 실험 설계를 대체 할 수 있고 유전체 구성 요소를 대형 시스템으로 조립하는 동안 발생하는 예기치 않은 결과를 제거 할 수 있습니다. BioBrick 표준 (BBF RFC 10)은 가장 초기에 제안 된 DNA 어셈블리 표준 중 하나였습니다. 접두어 시퀀스 (EcoRI 및 XbaI 절단 사이트 포함)와 접미사 시퀀스 (SpeI 및 PstI 절단 사이트 포함) 2 , 3을 사용 합니다. XbaI와 SpeI는 상호 보완적인 응집력을 지니고 있기 때문에 XbaI와 SpeI로 절단 된 BioBrick DNA 부품을 결합하여 추가 반복 조립을위한 새로운 BioBrick을 생성 할 수 있습니다.

일부 결함은 BioBrick 표준을 사용하여 확인되었습니다. 예를 들어, 8-bp 흉터를 생성합니다.융합 단백질을 만들 수없는 DNA 부분들 사이. 게다가 위에서 언급 한 네 종류의 6-bp 제한 효소 부위는 DNA 부분에서 제거해야하므로 매우 불편합니다. BglBrick 표준은 첫 번째 문제를 해결하기 위해 수립되었습니다. 5 . 이것은 6-bp의 "GGATCT"흉터를 만들어 Gly-Ser를 만들고 여러 단백질 또는 단백질 도메인의 융합을 허용합니다. iBrick은 두 번째 문제점 6 을 처리하기 위해 개발되었습니다. 그것은 긴 DNA 염기 서열을 인식하는 homing endonucleases (HE)를 사용합니다. HE 인식 사이트가 천연 DNA 서열에는 거의 존재하지 않기 때문에, iBrick 표준은 DNA 서열을 수정하지 않고 iBrick 부품의 직접 건설에 사용될 수 있습니다. 그러나 iBrick 표준은 DNA 부분 사이에 21bp의 흉터를 남겨 둡니다. 이는 인기가없는 이유 일 수 있습니다.

최근 몇 년 동안, 클러스터 된 정기적으로 interresaced 짧은 palindromic 반복 (CRISPR) 시스템이 급속히 발전했다. CRISPR- 관련 (Cas) 단백질 중에서, Streptococcus pyogenes 로부터의 Cas9 엔도 뉴 클레아 제가 현재 널리 사용되고있다. 주로 둔기가있는 이중 가닥 DNA 브레이크 (DSB)를 도입합니다.

2015 년 Zhang과 동료들은 처음으로 Cpf1 ( Prevotella 와 Francisella의 CRISPR)을 특징으로했습니다. 그것은 클래스 2 유형 V CRISPR-Cas 시스템에 속하며 CRISRP RNA (crRNA) 유도 된 endonuclease 10 입니다. Cas9와는 달리, Cpf1은 4 또는 5 nt의 5 '오버행을 갖는 DSB를 도입한다. 이 특성을 바탕으로 Cpf1은 DNA 어셈블리 표준 인 C-Brick 4 를 개발하는 데 사용되었습니다. C-Brick 표준 벡터에서, 접두어가 붙은 T1 / T2와 접미사가 붙은 T3 / T4의 4 개의 Cpf1 표적 부위는 생물학적 부분에 인접 해 있습니다. 이는 BioBrick 표준과 유사합니다. T2 및 T3 부위의 절단으로서상보적인 끈적 끈적한 말단이 생기면 DNA 부분의 반복적 인 조립을 수행하는 동시에 부품들 사이에 "GGATCC"흉터를 생성 할 수 있습니다. 특히, C-Brick 표준에는 긴 대상 시퀀스 인식과 짧은 흉터 남기기라는 두 가지 주요 이점이 있습니다. C-Brick이 만든 6 bp "GGATCC"흉터는 Gly-Ser를 암호화하며 융합 단백질을 만들 수 있습니다. 또한 C-Brick 표준은 BglBrick 및 BioBrick 표준과 부분적으로 호환됩니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. crRNA의 제조

  1. crRNA 주형의 제조
    1. RNase가없는 물에서 10 μM의 농도로 개별 올리고 뉴클레오티드 ( 표 1 )를 재현 탁하십시오.
    2. 상단 스트랜드 올리고 뉴클레오티드 ( 표 1의 T7-F) 22.5 μL, 하단 스트랜드 올리고 뉴클레오티드 22.5 μL ( 표 1 ) 및 10 mL 어닐링 완충액 5 μL를 0.2 mL PCR 튜브에 첨가한다. 총 부피가 50 μL인지 확인하십시오.
      참고 : 6 개의 서로 다른 하단 가닥 올리고 뉴클레오타이드가 표 1 에 나와 있으며, 각각은 상단 가닥 T7-F와 개별적으로 쌍을 이루어야합니다. 표 1의 소문자는 crRNA의 가이드 시퀀스로 전사 될 서열을 나타낸다. 10x Taq PCR 버퍼는 10x 어닐링 버퍼 대신 사용될 수 있습니다.
    3. Thermocycler에 PCR 튜브를 놓습니다.
    4. 어닐링 프로그램을 실행하십시오 : 95 ° C에서의 초기 변성5 분 후 95 ~ 20 ° C의 재사용 대기 시간, 온도 조절기에서 1 분당 1 ° C 감소.
      참고 : 1.2.1 단계의 샘플을 즉시 사용하십시오.
  2. crRNA의 전사 및 정제
    1. RNase가없는 물 38 μL, 단계 1.1.4의 템플리트 8 μL, 5x T7 전사 버퍼 20 μL, NTP 혼합물 (10 μM) 20 μL, 재조합 RNase 억제제 (RRI) 4 μL 및 10 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 T7 RNA 중합 효소 μL. 총 부피가 100 μL인지 확인하십시오.
    2. 미세 원심 분리 튜브를 밤새 37 ° C의 수 욕조에 두십시오 (약 16 시간 동안).
    3. 전사 된 RNA를 정화하기 위해 RNA 정화 및 농축 키트를 사용하십시오. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
    4. UV-Vis 분광 광도계로 RNA를 정량하고 RNA를 10 μM의 농도로 희석하십시오. 즉시 샘플을 사용하거나 -80 ° C에 보관하십시오.
      참고 : crRNA 시퀀스표 2 에 열거되어있다.

2. C-Brick 부품의 제작 (C-Brick 표준 벡터에 생물학적 부품 삽입)

참고 :이 단계에는 세 가지 하위 단계가 있습니다. 짧은 생물학적 부분 ( 예 : 프로모터 및 터미네이터)의 경우 C-Brick 표준 벡터에 생물학적 부분을 삽입하기 위해 직접 PCR 방법을 사용하는 것이 가장 좋습니다 4 . 전체 벡터 시퀀스는 보충 데이터에 표시되며 접두사 및 접미사 시퀀스는 그림 1 (아래 2.1 단계)에 나와 있습니다. PCR을 통해 쉽게 얻을 수있는 생물학적 부분 ( 예 : 게놈 DNA, 플라스미드 또는 새롭게 합성 된 DNA 서열 템플릿)을 사용하면 C-Brick 표준 벡터에 생물학적 부분을 삽입하기 위해 끊김없는 조립 방법을 사용하는 것이 가장 좋습니다 (아래의 2.2 단계). BioBrick 및 BglBrick 표준에서 얻은 부품의 경우 제한효소 매개 소화 및 T4 DNA 리가 아제 매개 연결을 사용하여 생물학적 부분을 C- 브릭 표준 벡터 (아래의 단계 2.3)에 삽입 할 수 있습니다.

  1. 직접 PCR 증폭을 통한 구축
    1. PCR 증폭을위한 올리고 뉴클레오타이드를 설계하고 주문하십시오.
      참고 : 올리고 뉴클레오타이드의 5 '말단은 DNA 부분의 서열을 포함하고, 올리고 뉴클레오타이드의 3'말단은 벡터 서열 ( 즉, 정방향 가닥의 3 '말단에 "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG"및 "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" 역 가닥에서). 올리고 뉴클레오타이드의 5'- 말단에 오버행이 없거나 ~ 20-bp 오버행을 설계 할 수 있습니다. 구체적인 예는 이전의 연구 4 에서 찾을 수 있습니다.
    2. 초순수에서 개별 올리고 뉴클레오타이드를 10 μM의 농도로 재현 탁하십시오.
    3. 0.2 ML PCR 튜브 얼음에 PCR 반응을 설정합니다 : 초 순수한 물 18 μL, 2x P의 25 μL를 추가CR 완충액, dNTPs (10 μM) 1 μL, 단계 2.1.2에서 정방향 및 역방향 프라이머 (10 μM) 각각 2.5 μL, 주형으로 C- 브릭 표준 벡터 (50 ng) 0.5 μL, 고 충실도 DNA 중합 효소 총 부피가 50 μL인지 확인하십시오.
    4. 튜브를 thermocycler에 직접 놓고 thermocycler 프로그램을 시작하십시오. 즉시 샘플을 사용하거나 동결하고 -20 ° C에서 보관하십시오.
    5. Thermocycler 프로그램 : 98 ° C에서 3 분 동안 1 사이클; 98 ℃에서 10 초, 55 ℃에서 20 초, 72 ℃에서 2 분; 72 ℃에서 10 분 동안 1 사이클. 샘플을 16 ° C에 유지하십시오.
    6. 단계 2.1.4에서 얻은 혼합물 9 μL를 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오.
    7. 1 μL의 DpnI를 첨가하고 37 ° C 수 욕조에서 1 시간 동안 배양하십시오.
      참고 : 프라이머에 중첩 시퀀스가없는 경우 0.5 μL의 T4 폴리 뉴클레오타이드 키나아제 (PNK)와 0.5 μL의 T4 DNA 리가 제를 첨가하고1 시간 동안 22 ° C 수 욕조. 그렇지 않은 경우, 프라이머가 ~ 20nt 중첩 서열을 포함하고 있다면, DpnI 처리 제품을 대장균 (DH10B)에 적합한 세포로 직접 형질 전환 시킨다 (단계 2.4). 선형화 된 PCR 산물은 숙주 내에서 재조합 시스템에 의해 고리 화 될 것이다.
    8. 즉시 샘플을 사용하거나 -20 ° C에 보관하십시오.
  2. 원활한 조립을 통한 시공
    1. PCR 증폭을위한 올리고 뉴클레오타이드를 설계하고 주문하십시오.
      참고 : 올리고 뉴클레오티드의 3 '말단은 DNA 부분의 말단 서열을 포함하고, 올리고 뉴클레오타이드의 5'- 말단은 선형화 된 C- 브릭 표준 벡터 서열의 말단을 함유한다 ( 즉, 5'말단에 대해 "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" 역전 사슬의 5'- 말단에 대한 "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC"). 구체적인 예는 이전의 연구 4 에서 찾을 수 있습니다.
    2. 개인을 다시 일시 중지하십시오.10 μM의 농도로 초순수 중의 올리고 뉴클레오타이드를 제거합니다.
    3. 0.2 ML PCR 튜브에서 얼음에 PCR 반응을 설정합니다 : 순전히 물 18 μL, 2 배 PCR 버퍼 25 μL, dNTPs (10 μM) 1 μL, 순방향 및 역방향 프라이머 각각 10 μM ), 0.5 μL의 template (20-500 ng) 및 0.5 μL의 high-fidelity DNA 중합 효소를 넣었다. 총 부피가 50 μL인지 확인하십시오.
    4. 튜브를 thermocycler에 직접 놓고 thermocycler 프로그램을 실행하십시오. 즉시 샘플을 사용하거나 동결하고 -20 ° C에서 보관하십시오.
      참고 : thermocycler 프로그램을 다음과 같이 설정하십시오 : 98 ° C에서 3 분 동안 한 번; 98 ℃에서 10 초, 55 ℃에서 20 초 (프라이머의 어닐링 온도에 따라), 1 분 (생물학적 부분의 길이에 따라) 72 ℃에서 30 사이클; 72 ℃에서 10 분 동안 1 사이클. 샘플을 16 ° C에 유지하십시오.
    5. PCR 클린업 시스템을 사용하여 PCR 생성물을 정제하십시오.시험 키트; 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
    6. BamHI로 C-Brick 표준 벡터를 분해하십시오 : 초순수 34 μL, 플라스미드 (1 μg) 10 μL, 10x 버퍼 5 μL 및 BamHI 1 μL를 미세 원심 분리 튜브에 첨가하십시오. 수 욕조에서 37 ° C에서 2 시간 동안 품어 낸다.
    7. 위의 제품을 젤 클린업 시스템 키트를 사용하여 정제하십시오. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
    8. 2.2.7 단계의 선형화 된 벡터 (50 ng), 2.2.4 단계의 단편 (200 ng) 5 μL, 5 x 이음새없는 조립 버퍼 2 μL 및 이음새없는 조립 키트의 이음새없는 조립 효소 1 μL를 첨가하십시오 1.5 mL의 마이크로 원심 분리 관으로 옮깁니다. 총 부피는 10 μL입니다.
    9. 30 분 동안 37 ° C 수조에 넣으십시오. 즉시 샘플을 사용하거나 동결하고 -20 ° C에서 보관하십시오.
  3. 제한 효소 - 매개 소화 및 T4 DNA 리가 제제 - 중재 결합을 통한 구축.
    노트: BioBrick (단계 2.3.4-2.3.7) 및 BglBrick (단계 2.3.1-2.3.3) 표준에서 얻은 부품의 경우 제한 효소 매개 소화 및 T4 DNA 리가 아제 매개 연결을 사용하여 생물학적 인 부분을 C-Brick 표준 벡터로 변환합니다.
    1. BglHI과 BglII로 BglBrick 표준 부품을 소화합니다 : 초순수 34 μL, 플라스미드 (2 μg) 10 μL, 10x 버퍼 3 5 μL, BamHI 0.5 μL 및 BglII 0.5 μL를 미세 원심 분리 튜브에 첨가하십시오. 37 ° C 수 욕조에서 2 시간 동안 품어 낸다.
    2. 1 % 아가로 오스 겔 전기 영동을 실행하고 겔 클린업 ​​시스템 키트를 사용하여 단편을 정제하십시오.
    3. 단편과 C-Brick 표준 벡터를 합치십시오 : 단계 2.1.12의 선형화 된 벡터 (50 ng) 2 개와 단계 2.3.3의 단편 (200 ng) 6 μL를 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 첨가하십시오. 10 X T4 DNA ligase 버퍼 1 μL와 T4 DNA ligase 1 μL를 첨가한다. 22 ° C에서 2 시간 동안 품어 낸다. 샘플을 즉시 사용하거나 정지하십시오.-20 ° C에서 보관하십시오.
    4. XbaI 및 SpeI로 BioBrick 표준 부품을 소화합니다 : 34μL의 초순수, 10 μL의 플라스미드 (2 μg), 5 μL의 10 배 완충액, 0.5 μL의 XbaI 및 0.5 μL의 SpeI를 미세 원심 분리 튜브에 첨가하십시오. 37 ° C 수 욕조에서 2 시간 동안 품어 낸다.
    5. XbaI 및 SpeI로 C-Brick 표준 벡터를 분해하십시오 : 초순수 34 μL, 플라스미드 (1 μg) 10 μL, 10 배 완충액 5 μL, XbaI 0.5 μL 및 SpeI 0.5 μL를 마이크로 원심 분리 관에 첨가하십시오 . 37 ° C 수 욕조에서 2 시간 동안 품어 낸다.
    6. 1 % 아가 로즈 겔 전기 영동을 실행하고 겔 클린업 ​​시스템 키트로 2.3.4 단계의 단편과 2.3.5 단계의 선형화 된 벡터를 정제하십시오. 제조자의 프로토콜에 따라.
    7. 단편과 C-Brick 벡터를 준비하십시오 : 단계 2.3.5의 선형화 된 벡터 (50 ng) 2 개와 단계 2.3.4의 단편 (200 ng) 6 μL를 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 광고d 10 μL T4 DNA 리가 제 완충액 1 μL와 T4 DNA 리가 제 1 μL. 22 ° C에서 2 시간 동안 품어 낸다. 즉시 샘플을 사용하거나 동결하고 -20 ° C에서 보관하십시오.
  4. 단계 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 또는 2.3.7의 생성물 10 μL를 대장균 (DH10B)의 적격 세포로 화학적으로 변형시키기 위해 첨가한다.
  5. 여러 클론을 5mL 액체 Luria-Bertani (LB) 튜브에 넣고 37 ℃에서 밤새 쉐이커 (220rpm)로 밤새 인큐베이터합니다.
  6. 플라스미드 준비 키트를 사용하여 플라스미드를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
  7. Sanger sequencing 11 에 의해 정확한 클론을 확인하십시오.

3. C- 브릭 어셈블리 ( 그림 2 )

  1. C- 벽돌 벡터의 Cpf1 분해
    1. RNase가없는 물 22.5 μL, 10x Cpf1 완충액 4 μL, 단계 2.6 (1 μg)의 플라스미드 10 μL, RRI 0.5 μL 및 1 &# 181; Cpf1 (5 μM)을 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오.
      참고 : Cpf1은 상업적으로 구입하거나 이전 연구 4 의 프로토콜에 따라 정제 할 수 있습니다.
    2. T1 및 T2 사이트에 외래 DNA 단편을 삽입하려면 1 μL의 crRNA-T2 (10 μM)를 첨가하고 37 ° C의 수조에서 30 분 동안 품을 때까지 기다리십시오. 추가 30 분 동안 1 μL의 crRNA-T1 (10 μM) 및 Cpf1 (5 μM)을 첨가 하였다.
      참고 : 또는 T3 및 T4 부위에 외래 DNA 단편을 삽입하려면 1 μL의 crRNA-T3 (10 μM)를 첨가하고 37 ° C의 수조에서 30 분 동안 배양하십시오. 추가 30 분 동안 1 μL의 crRNA-T4 (10 μM)를 첨가한다.
    3. 감수성 알칼리성 인산 가수 분해 효소 1 μL를 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
    4. 아가 로스 겔 전기 영동을 실행하고 젤 클린업 시스템 키트를 사용하여 벡터를 정제하십시오. 즉시 샘플을 사용하거나 동결하고 -20 ° C에서 보관하십시오.
  2. Cpf1을 이용한 DNA 단편의 절단
    1. RNase가없는 물 21.5 μL, 10x Cpf1 버퍼 4 μL, 단계 2.6 (2 μg), RRI 0.5 μL 및 Cpf1 (5 μM) 2 μL의 플라스미드 10 μL를 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오.
    2. T1 및 T2 사이트에 외인성 DNA 단편을 삽입하려면 crRNA-T1 (10 μM) 1 μL와 crRNA-T3 (10 μM) 1 μL를 넣고 37 ° C의 수조에서 2 시간 동안 품어줍니다.
      참고 : 또는, crRNA-T2 (10 μM) 1 μL와 crRNA-T4 (10 μM) 1 μL를 넣고 37 ° C에서 2 시간 동안 수 욕조에서 품을 수 있습니다.
    3. 아가 로스 겔 전기 영동을 실행하고 젤 클린업 시스템 키트를 사용하여 조각을 정화하십시오. 즉시 샘플을 사용하거나 동결하고 -20 ° C에서 보관하십시오.
  3. C-Brick 조립 및 추가 검증
    1. 외래 DNA 단편과 C-Brick 벡터를 라이 게이션하십시오 : 2 μL의 선형화 된 벡터를 첨가하십시오50ng) 및 단계 3.2.3의 DNA 단편 (200ng) 6μL를 1.5mL 미세 원심 분리 튜브에 첨가 하였다. 10x T4 DNA ligase 버퍼 1 μL와 T4 DNA ligase 1 μL를 첨가한다. 22 ° C에서 2 시간 동안 품어 낸다. 즉시 샘플을 사용하거나 동결하고 -20 ° C에서 보관하십시오.
    2. 대장균 (DH10B) - 유능한 세포로 화학 변형을위한 연결 제품 (단계 3.3.1) 10 μL를 추가합니다.
    3. 5 ML 액체 LB 튜브에 여러 클론을 추가하고 220 RPM 및 37 ° C에서 쉐이커에서 밤새 품어.
    4. 플라스미드 준비 키트를 사용하여 플라스미드를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
    5. Sanger sequencing으로 정확한 클론을 확인하십시오. 11 .
  4. 새로운 C-Brick 어셈블리 라운드를 수행하십시오. 3.3.4 단계의 올바른 클론은 3.1-3.3 단계와 동일한 프로토콜에 따라 반복 C-Brick 어셈블리를위한 새로운 C-Brick 벡터 또는 DNA 파트로 사용할 수 있습니다.
    참고 : T2 '및 T3'ites는 T2 및 T3 사이트 ( 그림 1a )의 백업으로 설계되었습니다. 2.3.7 단계에서 얻은 플라스미드의 경우, C-Brick 표준 어셈블리에는 T2 '및 T3'만 사용할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 세 가지 색소 카세트 (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) 및 amilGFP (BBa_K592010))의 조립을 시연했습니다. 먼저, 상기 3 가지 유전자 및 터미네이터의 코딩 서열을 개별적으로 C- 브릭 표준 벡터에 클로닝 하였다. 5 '말단에 짧은 DNA 부분을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 통해 짧은 DNA 부분, 프로모터 및 터미네이터를 C-Brick 벡터에 도입 하였다. 이것은 self-ligation 방법이 뒤 따른다. 3 개의 chromoprotein-encoding 서열을 먼저 de novo synthesis 한 후 C-Brick 표준 vector에 seamless assembly를 통해 복제 하였다. 프라이머는 이전의 연구 4에서 기술 되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 DNA 어셈블리 표준 C-Brick을위한 절차를 설명합니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 C-Brick 표준 벡터의 선형화입니다. 벡터가 불완전하게 절단되면 성공률에 심각한 영향을 줄 수 있습니다. 또한, Cpf1은 주로 "18-23"분열 패턴의 표적 DNA 서열을 절단하지만, 두 개의 염기 근처에서 부정확 한 절단이 또한 검출되었는데, 이는 DNA 조립 후 작은 수의 돌연변이를 일으킬 수있다. 따라서 Sanger 시퀀싱은 조립 된 구조물을 검증하는 데 필요합니다.

C-Brick 어셈블리의 효율은 이전의 연구 4 에서 기술 된 전통적인 제한 효소 및 결합 방법보다 낮습니다. 조립 효율에 영향을 미치는 주된 이유는 Cpf1의 부정확 한 분열 특성 일 수 있습니다. 장래에, 분열 정확도의 향상은 표준현재 탐색 중입니다.

C-Brick은 또한 Bgl...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 C-Brick 표준 개발 과정에서 기술 지원을 해주신 Shanghai Tolo Biotech에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 과학 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램 (Grant No. XDB19040200)의 교부금으로 지원되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Comercial 올리고뉴클레오티드Sangon Biotech
10x Taq PCR 버퍼형질전환#J40928
초순수 증류수Invitrogen10977-015
5x RNA 전사 버퍼Thermo ScientificK0441
T7 RNA 중합효소Thermo Scientific#EP0111
NTP 혼합물산곤#ND0056
RRI (재조합 RNase 저해제)Takara2313A
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1015
UV-Vis 분광계Thermo ScientificNano-Drop 2000c
2x Phanta Max BufferVazymePB505PCR buffer
dNTPTransgenAD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA PolymeraseVazymeP505-d1
Ezmax for one-step cloningTolobio24303-1이음새 없는 조립 키트
Ezmax 원스텝 클로닝Tolobio32006
BamHINEB#R0136L
BamHI-HFNEB#R3136L
BglIINEB#R0144L
XbaINEB#R0145L
SpeINEB#R3133L
10x 버퍼 3NEB#B7003S
10x CutSmart 버퍼NEBB7204S
10x T4 DNA 리가제 버퍼Tolobio32002
T4 PNKTolobio32206
T4 DNA ligaseTolobio32210
DpnINEB#R01762
SV Gel 및 PCR clean-up systemPromegaA9282
Plasmid Mini Kit IOmegaD6943-02플라스미드 준비 키트
열에 민감한 알칼리 인산가수분해효소 Thermo Scientific#EF0651FastAP
10x Cpf1 bufferTolobio32008
Cpf1Tolobio32105FnCpf1
thermocyclerApplied Biosystemsveriti 96 well
C-Brick standard vectorTolobio98101
E. coli [DH10B]Invitrogen18297010
Luria-Bertani 배지 (트립톤)OxoidLP0042
Luria-Bertani 배지 (효모 추출물)OxoidLP0021
Luria-Bertani 배지 (NaCl)Sangon BiotechB126BA0007
용 5x 버퍼;

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
  4. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  5. Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852(2014).
  7. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  8. Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
  9. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  10. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
  13. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  14. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  15. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  16. Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

C Brick StandardCpf1 AssemblyDNA Part AssemblyCRISPR RNASeamless AssemblyVector DigestionChromoprotein CassettesPlasmid PreparationSanger SequencingChemical Transformation

관련 논문