Method Article

임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 LC-MS / MS 검출의 통합

DOI:

10.3791/55778

⸱

July 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Pharmasan Labs, Inc., 2NeuroScience, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

혼합 모드 양이온 교환 (MCX) 96- 웰 마이크로 플레이트상에서 효율적인 고체상 추출과 결합 된 선택적이고 민감한 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)이 유리 3- 니트로 티로신의 측정을 위해 개발되었다 3-NT)을 임상 적으로 사용하기에 적합합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Free 3- nitrotyrosine (3-NT)은 산화 스트레스에 대한 가능한 바이오 마커로 광범위하게 사용되어 왔습니다. 3-NT의 증가 된 수준은 다양한 병리학 적 조건에서보고되었다. 그러나 기존의 방법은 3-NT의 낮은 내인성 수준을 안정적으로 측정하는 데 필요한 충분한 감도 및 / 또는 특이성이 결여되어 있으며 임상 적용에 너무 복잡합니다. 따라서, 3-NT의 수준을 정확히 정량화하고 병리학 적 조건에서 3-NT의 역할을 검증하기 위해서는 분석적 개선이 시급히 필요하다. 이 프로토콜은 비 침습성 바이오 마커로서 인간의 소변에서 3-NT의 신속하고 정확한 측정을위한 소형 고체상 추출 (SPE)과 결합 된 새로운 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS / MS) 검출의 개발을 제시합니다 산화 스트레스. SPE는 96- 웰 플레이트를 사용하여 지루한 유도체 화 및 증발 단계없이 샘플 클린업 및 분석 물 농축을 결합함으로써 공정을 현저히 단순화시켰다, 용매 소비, 폐기물 처리, 오염 위험 및 전반적인 처리 시간 감소. SPE 용출 용액으로서 pH 9에서 25 mM 암모늄 아세테이트 (NH 4 OAc)를 사용함으로써 선택성이 실질적으로 향상되었다. 질량 분석법 신호 응답은 다중 반응 모니터링 (MRM) 전환의 조정을 통해 향상되었습니다. 펜타 플루오로 페닐 (PFP) 컬럼 (150 mm x 2.1 mm, 3 μm)에서 첨가제로 0.01 % HCOOH를 사용하면 신호 응답이 2.5 배 향상되었고 전체 실행 시간이 7 분으로 단축되었습니다. 10 pg / mL (0.044 nM)의 정량 하한 (LLOQ)이 달성되어보고 된 분석법에 비해 현저한 민감도 향상을 나타냅니다. 이 간단하고 신속한 선택적이고 민감한 방법으로 24 시간 동안 2 장의 소변 샘플 (n = 192)을 처리 할 수 ​​있습니다. 현저하게 개선 된 분석 성능과 비 침습성 및 저렴한 소변 샘플링을 고려하면, 제안 된 분석법은 전임상 및 임상연구.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

최근 임상 연구에서 산화 스트레스의 영향이 최전방으로 치닫고 있습니다 1 . 연구되는 바이오 마커 중 하나는 반응성 질소 종 (RNS)이 티로신 (catecholamine neurotransmitter precursor)과 상호 작용할 때 형성된 안정한 제품인 3- 니트로 티로신 (3-NT)입니다. 3-NT는 생체 내 RNS의 바이오 마커로서 임상 적 가치를 가질 수 있지만 , 티로신의 성질과 기능의 실질적인 변화는 해당 단백질과 세포 기능에 악영향을 미칠 수 있습니다 1 , 2 . 신생 연구는 3-NT가 염증성 질환 3 , 신경 퇴행성 질환 4 , 5 , 심혈관 질환 6 및 당뇨병 7 뿐만 아니라 산화 스트레스와 관련된 상태에서 중요한 역할을 할 수 있다고 제안했다. 그러나, 이러한 obse민감도 및 / 또는 선택성이 결여 된 방법론 8 , 9 , 10 , 11의 결과에 근거합니다. 이전에 문헌에보고 된 생물학적 시료에 대한 거대한 3-NT 농도 범위는 심각한 분석 문제가 이러한 분석법과 관련되어 있으며 3-NT 수준을 정확하게 계량화하고 이러한 병리 현상에서의 역할을 확인하기위한 기술적 개선이 필요함을 보여줍니다 .

생물학적 기질에서 유리 3-NT의 정량은 사람과 도구 8 , 9 , 10 , 11에 특별한 도전이됩니다. 첫째, 내인성 3-NT의 추적 수준은 매우 민감한 탐지를 요구합니다. 둘째로 구조적으로 유사한 많은 유사체, 특히 티로신이 존재한다.광대 한 과잉은, 높은 선택성을 요구한다; 셋째, 유비쿼터스 질산염과 아질산염으로 티로신 니트로 화에 의한 3-NT의 인공 생성물은 3-NT의 잘못된 과대 평가를 피하기 위해 시료 준비 중에 특별한 고려가 필요하다.

3-NT를 측정하기 위해 사용 된 다양한 방법론 중에서 MS / MS는 탁월한 감도 및 선택성 11 , 12 , 13 , 14 로 인해 금 표준 방법으로 간주되었습니다. 가스 크로마토 그래피 (GC) 결합 MS / MS가 가장 우수한 감도를 제공하지만 필수적인 유도체 화 단계는 임상 유틸리티 15 , 16에 비해 너무 지루하고 시간 소모적입니다. LC-MS / MS는 복잡한 표본 유도체 화를 필요로하지 않으므로 더 유망한 옵션입니다. 그럼에도 불구하고 se와 같은 극복해야 할 몇 가지 장애물이 있습니다.낮은 농도의 3-NT 7 , 17 , 18 의 측정을 위해서는 문헌에보고 된 LC-MS / MS 방법의 사용성이 향상되어야하고 고 처리량 응용 12 , 13 , 17 , 19에 대해서는 상대적으로 긴 처리 시간을 단축해야합니다 .

또한, 임상 적용을 고려할 때, 사용 된 생물학적 기질이 중요한 역할을한다. 가능한 경우 쉽고 저렴해야하며 가능한 경우 비 침습적이어야합니다 20 , 21 , 22 . 문헌에서 전통적으로 사용 된 혈장은 임상 적으로 바람직한 매트릭스가 아니므로, 비 침습적이고 비용 효과가있는 소변을 이용하는 방법론이 필요하다.

rel 개발을위한 몇 가지 시도iable 및 특정 LC-MS / MS 방법은 소변 9 , 10 , 11을 사용하여 이루어졌습니다. 그러나, 그들은 모두 임상 적 사용을 위해 선택적이고, 신뢰할 만하 며, 효율적이지 못하다. 3 NT 분석을위한 샘플 정리 등과 같은 전통적인 역상 카트리지 (C18 타입)를 사용하여 지배적 인 SPE의 효과는 의문을 제기하고 강력한 양이온 교환의 순차적 인 SPE (SCX)와 역상 C18-OH 6 제안되었다되었습니다 7 , 19 . 한 최근 개발 된 LC-MS / MS 방법 3- NT (23)의 분석을위한 설명서 C18 SPE, 예비 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC), 온라인 SPE의 다단계 정제 공정을 이용했다. 이 방법은 0.041 nM의 LLOQ로 임상 목적에 충분히 민감했지만, 정화 과정은 집중적이고 지루하고 requi적색 3 mL의 소변. 높은 처리량에 대한 가능성을 제한합니다. 분자 임프린트 폴리머 정리 프로세스 (14)의 효율을 개선하기 위해 SPE 흡착제로서 사용되었지만, 생성 된 LLOQ (0.7 ㎍ / mL)의 임상 검체 충분히 낮은 아니었다. 또 다른 방법은 0.022 nM 24 의 검출 한계 (LOD)를 달성하기 위해 샘플 정화를 위해 2 차원 (2D) LC-MS / MS 및 면역 친화 크로마토 그래피가 필요했습니다. 이러한 모든 방법들이 3-NT의 평가에서 진전을 보였지만 임상 적용에 필요한 민감성, 신뢰성 및 효율성을 달성 한 것은 없습니다.

무료 3-NT의 병리 및 임상 설정에서 산화 스트레스의 바이오 마커의 역할을 조사하기 위해, 우리는 높은 처리량 임상 적용 25 수 있도록, 간단하고 효율적 정확하고 정밀한하는 방법을 개발했다. 소형화 된 혼합 모드 양이온 엑시드유도체 화, 증발 및 2D-LC를 필요로하는 기존 방법에서 나타나는 단점을 우회하여 단일 추출에서 3-NT의 간단하고 효과적인 시료 정화 및 농축을 달성하기 위해 hange (MCX) 96-well 추출 마이크로 플레이트가 구현되었습니다. 0.01 % HCOOH가 첨가 된 액체 크로마토 그래피는 신속한 사이클 시간으로 향상된 신호 응답을 제공합니다. 선택성은 3-NT의 선택적 용리 및 3-NT 및 내부 표준 (IS) 모두에 대한 MRM 전이의 사용을위한 약한 NH 4 OAc 용출 용액의 적용을 통해 더욱 향상되었다. 기질 효과는 정량화를 위해 선호되는 13 C- 동위 원소 IS의 감소 된 양을 사용함으로써 보상되었다. 이 방법론의 출현과 함께 연구원 및 임상의는 임상 적 상태에서 3-NT의 역할을 검증하고 산화 스트레스의 영향을 더 탐구 할 수있을 것이다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간의 소변 샘플을 포함한 모든 연구는 Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB)의 승인 절차를 거쳤습니다.

1. 소변 채취 및 크레아티닌 (Cr) 측정

  1. 다음 아침 소변 샘플 5 mL를 ca. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 방부제 및 저장액으로 3 N HCl 250 μL를 함유하는 5 mL 수송 튜브 A에서 10 시간 하룻밤 동안 단식.
  2. 해동과 소용돌이 5 mL 수송 뇨 튜브와 원심 분리기 ( 예 : Sorvall) (2297 xg, 10 분)에서 원심 분리하십시오.
  3. 소변 1 mL를 5 mL 수송 튜브 A에서 두 번 두 번.
  4. 비뇨기 creatinine 방법으로 크롬을 결정하십시오 26 .

2. 표준, IS 및 품질 관리 (QC) 샘플 준비

  1. 0.01 % HCOOH 이동상 A (MA)가 함유 된 물에서 100 μg / mL의 3-NT의 스톡 용액을 준비하고 -20 ° C에서 보관하십시오.
  2. 하다MA로 100 μg / mL 3-NT 저장 용액을 희석하여 100 ng / mL의 농도로 3-NT 작업 표준 용액을 만듭니다.
  3. 100 ng / mL 작업 표준의 희석으로 5에서 2500 pg / mL 범위의 표준을 생성하고 0.15 M HCl 산성화 된 3-NT 공시 뇨와 공시험 시료 및 이중 여백 시료를 사용하십시오.
  4. -20 ℃에서 13 C IS MA 물에 100 ㎍ / ㎖의에 9 -3- NT 및 저장소의 스톡 용액을 제조 하였다.
  5. 100 ㎍ / ㎖의 13 C 9 -3- NT 희석하여 500 pg / ml이다에서 작동 용액을 제조는 MA와 원액이다.
  6. 산성화 된 공백 소변에서 3-NT 작업 표준을 희석하여 LLOQ, 저, 중 및 고 수준 ( 즉 , 10, 25, 100, 500 및 1,250 pg / mL)을 포함하는 5 가지 수준의 QC 시료를 만듭니다.

3. 고체상 추출 과정

  1. 해동 및 소용돌이 샘플, 표준 및 QC 샘플.
  2. 소변 샘플, 표준 및 QC samp 추가les (각각 250 μL)을 깨끗한 2 mL 96- 웰 수집 플레이트 32 웰로 옮겼습니다.
  3. 이중 빈 샘플 웰을 제외한 각 웰에 500 pg / mL IS 작동 용액 (50 μL)을 주입하십시오. 이중 빈 샘플 우물에 0.01 % HCOOH (50 μL)를 첨가한다.
  4. 0.1 % HCOOH (250 μL)가 첨가 된 LC-MS / MS 물을 넣는다.
  5. 위의 혼합물을 8 채널 피펫으로 3 번 섞는다.
  6. SPE 로딩 될 때까지 플레이트를 덮으십시오.
  7. MCX 96-well 추출 플레이트와 수집 저장소를 양압 프로세서에 놓습니다.
  8. 흡착제를 통해 MeOH (200 μL)를 흐르게하여 추출 플레이트를 컨디셔닝한다.
  9. 흡착제를 통해 2 % HCOOH (200 μL)로 물을 흐르게하여 평형을 이룬다.
  10. 8 채널 피펫을 사용하여 미리 혼합 된 각 샘플의 전체 부피를 신중하게 사전 조건화 된 추출 플레이트에로드하십시오.
  11. 혼합물이 흐를 수 있도록 양압 프로세서에서 낮은 양의 압력 ( 예 : 3 psi)을 설정하십시오흡착제를 천천히 가볍게 두드려서 필요하면 압력을 조절하십시오.
  12. 흡착제를 통해 2 % HCOOH (200 μL)로 물을 흘려 우물을 씻으십시오.
  13. 흡착제에 메탄올 (200 μL)을 흘려 우물을 씻으십시오.
  14. 흡착제에 물 (200 μL)을 흘려 우물을 씻으십시오.
  15. 양압 프로세서에서 높은 양압 설정 ( 예 : 40 psi)으로 웰을 완전히 말립니다.
  16. Reservoir를 깨끗한 2 mL 96-well collection plate로 교체하십시오.
  17. 추출 플레이트에서 보존 된 분석 물 및 IS를 용리시키기 위해 pH 9 (50 μL)에서 25 mM NH 4 OAc를 적용한다.
  18. 용리액을 중화하기 위해 5 % HCOOH (50 μL)가 함유 된 LC-MS 물을 피펫에 넣습니다.
  19. 8 채널 피펫으로 3 번 혼합하고 분석을 위해 LC-MS / MS 스테이션에 제출하십시오.

4. LC-MS / MS 분석

  1. 눈금이 매겨진 실린더로 2,000 mL의 LC-MS 물을 정확하게 측정하고 2 L 병으로 옮깁니다.
  2. 피LC - MS 물이 담긴 위의 병에 200 μL 순수 HCOOH를 넣으십시오.
  3. 철저하게 혼합하고 이동상 A (MA)로 표시하십시오. 이니셜, 준비 날짜 및 만료 날짜를 포함하십시오.
  4. LC-MS 메탄올 2 L 병을 가져 와서 시작 날짜와 만기 날짜가있는 이동상 B (MB)로 표시하십시오.
  5. 자동 샘플러의 온도를 4 ° C로 설정하십시오.
  6. 준비 샘플과 함께 수집 판을 오토 샘플러에 놓습니다.
  7. 오븐에 PFP 컬럼 (150 mm x 2.1 mm id, 3 μm)과 보호 컬럼을 놓습니다.
  8. 오븐 온도를 30 ° C로 설정하십시오.
  9. 표 1에 표시된대로 LC 그라디언트 용리로 획득 방법을 사용하여 10 분간 평형을 이룬다.
시간 (분) 기준 치수 이벤트 매개 변수
0 슬리퍼 펌프 B Conc. 5
0.5 슬리퍼 펌프 B Conc. 20
1 슬리퍼 펌프 B Conc. 50
삼 슬리퍼 펌프 B Conc. 80
4 슬리퍼 펌프 B Conc. 90
4.01 슬리퍼 펌프 B Conc. 95
5.5 슬리퍼 펌프 B Conc. 95
5.6 슬리퍼 펌프 B Conc. 5
7 제어 장치 중지

표 1 : 액체 크로마토 그라데이션 용출 조건

  1. 다음을 포함하는 일괄 처리 목록 만들기표준, 품질 관리 및 소변 샘플.
  2. 준비 샘플 (12 μL)의 주사에 의해 배치를 시작합니다.

5. 피크 식별, 통합 및 데이터 프로세스

  1. 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집 및 처리를 제어합니다.
  2. 모든 샘플에 대해 3-NT 및 IS 피크를 확인하고 통합하십시오.
  3. 1-x의 가중치 인자로 3-NT와 IS의 피크 면적비와 명목상 3-NT 농도의 선형 회귀에 의한 3-NT 정량을위한 10-2,500 pg / mL 범위의 표준 곡선을 확립하십시오.
  4. 표준 곡선을 사용하여 모든 샘플을 정량화하십시오.
  5. QC 샘플이 설정된 범위에 속하는지 확인하십시오.
  6. 검출 된 소변 샘플의 농도를 nM 또는 nmol / mmol Cr 단위로 최종 결과로 변환하십시오.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 1 은 3-NT가 최적화 된 LC 조건 하에서 구조적으로 유사한 다른 티로신 유사체로부터 완전히 크로마토 그래피 적으로 분리되어있어 이러한 과도한 화합물로 인한 용출 간섭을 제거하여 결과적으로 분석 선택도를 향상 시킨다는 것을 보여줍니다. 또한 MA 및 메탄올의 첨가제 인 0.01 % HCOOH를 유속 0.45 mL / min로 사용하는 구배 용출은 3-NT ( 즉 , 7 분의 처리 시간으로 3 분)의 신속한 용출을 가능하게합니다.

figure-results-1
그림 1 : 표준 용액에서 다른 티로신 유사체로부터의 3-NT의 기준 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인간 소변 샘플의 내인성 자유 3-NT에 대한 문헌에서 이전에보고 된 농도의 상당한 변화는 이용 가능한 분석 8 , 9 , 10 , 11 과 관련된 방법 론적 문제점을 나타낸다. 인간 소변에서 3-NT의 낮은 기본 수준을 정확하게 결정하는 것은 시료 준비 및 LC-MS / MS 분석을위한 특별한 예방 조치가 필요한 까다로운 과제로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 높은 처리량으로 요중 3-NT의 특정하고 민감한 결정을 허용 선택적 LC-MS / MS 감지와 결합 된 새로운 SPE 절차를 설명합니다.

MRM 매개 변수를 신중하게 선택하면 3-NT 검출에 대한 선택성이 향상되었습니다. NT-3에 대한 IS의 236.0> 96.0 MRM 전이 m / z...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 Scott Haard와 Abigail Marinack에게이 작업에 대한 일반적인 지원과 조정에 대해 인정할 것입니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-니트로-L-티로신시그마N7389-5g
3-니트로-L-티로신-13C9Sigma652296-5.0mg
질량 분석기 금 소변골든 웨스트 생물학적MSG 5000-1L
오아시스 MCX 96-웰 &마이크로; 용출 플레이트Waters186001830BA
2 mL 96 웰 수집 플레이트Phenomenex   AH0-7194
96 양극 프로세서Waters 
LC-MS 울트라 CHROMASOLV 메탄올   Sigma14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV 물Sigma14263-2L
질량 분석용 포름산Sigma94318-50ML-F
수산화 암모늄 용액Sigma338818-1L
Ultra PFP 프로필 컬럼Restek9179362
5500 Triple QuadAB Sciex /자세한 내용은 제조업체에 문의하십시오
UFLC-XRShimadzu /자세한 내용은 제조업체에 문의하십시오
Integra 400 Plus Roche/비뇨기 크레아티닌 Jaffé Gen 2 method
LCMS 인증 12 x 32 mm 스크류 넥 바이알Waters600000751CV
LCGC 인증 12 x 32 mm 스크류 넥 총 회수 바이알Waters186000384C
5 mL 수송관PhoenixTT-3205
50 mL 원심분리기 튜브Crystalgen 23-2263
15 mL 원심분리기 튜브Crystalgen 23-2266
eLine 전자 피펫Sartorius730391
Microfuge 원심분리기 Beckman CoulterA46474
OHAUS 밸런스   케네디 스케일스, Inc.735
볼텍스 믹서 번스테드 써몰린M16715
186005521.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  3. Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).
  4. Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).
  5. Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
  6. Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).
  7. Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).
  8. Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).
  9. Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).
  10. Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).
  11. Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).
  12. Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).
  13. Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).
  14. Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).
  15. Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).
  16. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).
  17. Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).
  18. Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).
  19. Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).
  20. Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).
  21. Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).
  22. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
  23. Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).
  24. Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).
  25. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).
  26. Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
  27. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
  28. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3 Nitrotyrosine DetectionSolid Phase ExtractionLC MS MS AnalysisHuman Urine SamplesOxidative Stress BiomarkerMiniaturized SPE MethodAmmonium Acetate ElutionPFP Column ChromatographyMultiple Reaction MonitoringLower Limit Quantitation

Related Articles