분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

Rebecca J. McFarland; Sharlene P. Brown; Eudorah Vital; Jonathan M. Werner; Rachel M. Brewster

doi:10.3791/55792

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방법 논문

분석, 동적, 안정과 초기 Microtubules Zebrafish 태아에 있는 Immunolabeling의 사용

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DOI:

10.3791/55792

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2017년 9월 20일

Rebecca J. McFarland^*¹ , Sharlene P. Brown^*¹ , Eudorah Vital¹ , Jonathan M. Werner¹ , Rachel M. Brewster¹

¹Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Immunolabeling 방법 개발 zebrafish 두뇌에 microtubules의 명료한 인구를 분석 하는 다른 조직에 광범위 하 게 적용 되는 여기에, 설명 됩니다. 첫 번째 프로토콜 immunolabeling 안정적이 고 동적 microtubules에 대 한 최적화 된 방법을 설명합니다. 두 번째 프로토콜 이미지와 초기 microtubules 구체적으로 정량화 하는 방법을 제공 합니다.

초록

Microtubules (MTs)는 역동적이 고 연약한 구조는 이미지에 vivo에서, 특히 척 추가 있는 태아에에서 게 도전 하는. Immunolabeling 메서드는 zebrafish 태아의 개발 신경 관에서 MTs의 명백한 인구 분석 여기 설명 되어 있습니다. 신경 조직에 포커스를 실행 하는 동안이 방법론은 다른 조직에 광범위 하 게 적용 됩니다. 그러나 절차는 일찍 중반 somitogenesis 단계 배아 (1 somite 12 somites에), 그들은 수 다른 단계 비교적 사소한 조정의 범위에 적응을 위해 최적화 됩니다. 첫 번째 프로토콜에는 안정적이 고 동적 MTs의 공간적 분포를 평가 하 고 이미지 처리 소프트웨어와 함께 이러한 인구의 정량 분석을 수행 하는 방법을 제공 합니다. 이 방법은 기존 도구 이미지 microtubule 역학 및 실시간, 사용 유전자 변형 라인 또는 태그 구문 과도 식에서 배포를 보완합니다. 그러나 사실, 이러한 도구는 매우 유용 합니다, 쉽게 역동적이 고 안정적인 MTs 사이 구분 하지 않습니다. 이미지 분석이 고유한 microtubule 인구를 셀 분극 및 morphogenesis 기본 이해 메커니즘에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 두 번째 프로토콜 초기 MTs를 구체적으로 분석 하는 기법을 설명 합니다. 이것은 약 nocodazole와 마약 유실 후 복구 기간 microtubule depolymerization 다음 시간이 지남에, MTs의 드 노 보 성장 특성을 포착 하 여 수행 됩니다. 이 기술은 zebrafish 태아에 있는 MTs의 연구에 적용 하지 않은 하지만 microtubule 어셈블리에 연루는 단백질의 기능 vivo에서 조사에 대 한 가치 있는 분석 결과 이다.

서론

Microtubules (MTs)는 중합체의 α-및 β-tubulin 선형 protofilaments, 몇 가지는 속이 빈 튜브¹^,²형태로 결합으로 조립 이다. MTs는 끝 플러스 빠른 성장 하 고 느린-성장 하 고 끝은 centrosome 또는 다른 microtubule 조직 센터 (MTOC)³에서 앵커는 마이너스와 대립 된 구조. 드 노 보 MT 형성 nucleation 복잡 한 γ-tubulin 반지에서 (γ-TURC), 마운트 어셈블리⁴에 대 한 서식 파일을 제공 하 여 시작 됩니다. 어떤 주어진된 셀에 MTs의 두 인구 구분할 수 그 차례 이상의 서로 다른 속도로. 동적 MTs 성장의 단계 동적 불안정⁵라고 하는 과정에서 수축으로 전환 하 여 그들의 세포질 환경 탐구. 동적 MTs와 달리 안정적인 MTs 비 성장 고 동적 MTs⁶보다는 더 긴 반감기.

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