방법 논문

단백질 결정의 미세 결정학 및

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⸱

DOI:

10.3791/55793

⸱

2017년 7월 21일

 ,  , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

단백질 미세 결정을 사용하는 X 선 결정학을위한 프로토콜이 제시됩니다. 정제 후 또는 cellulo에서 미세 -grown 생체 분석 두 예가 비교된다.

초록

많은 싱크로트론 설비에서 고품질의 미세 초점 빔라인이 출현함에 따라 도전을 대표하는 가장 큰 차원에서 10μm보다 작은 결정의 일상적인 분석이 가능 해졌다. 우리 는 생체 내에서 성장한 결정에 특별한 초점을 맞춘 X 선 결정학에 의한 단백질 미결정의 구조 결정을위한 두 가지 대안 적 작업 흐름을 제시합니다. 미세 결정은 초음파 처리에 의해 세포로부터 추출되고 차등 원심 분리에 의해 정제되거나 결정 함유 세포의 유동 세포 계측법에 의한 세포 분류 후에 셀룰로오스로 분석된다. 선택적으로, 정제 된 결정 또는 결정 - 함유 세포를 실험적 단계적 조정을 위해 중질 원자 용액에 침지시킨다. 이 샘플들은 액체 질소에서의 마이크로 메쉬지지 및 플래시 냉각에 대한 적용에 의해 유사한 방식으로 회절 실험을 위해 준비됩니다. 격리 된 미세 결정과 수정 결정의 연속 회절 실험을 간략하게 기술하고 비교한다.microfocus 싱크로트론 빔라인을 사용하여 셀을 포함하는 셀을 조정하여 위상 조정, 모델 구축 및 미세 조정에 적합한 데이터 세트를 생성합니다.

이러한 워크 플로우는 곤충 세포에 재조합 배큘로 바이러스 (baculovirus)가 감염되어 생성 된 Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) 폴리 헤드린의 결정체를 예로들 수 있습니다. 이 사례 연구 에서 셀룰로오스 분석은 정제 된 결정의 분석보다 효율적이며 표현에서부터 정제까지 ~ 8 일 내에 구조를 산출합니다.

서론

생물 고분자의 고해상도 구조 결정을위한 X 선 결정학의 사용은 지난 20 년간 꾸준히 발전해 왔습니다. 전문가가 아닌 연구자에 의한 X 선 결정학 (X-ray crystallography)의 증가 추세는 생명 과학 분야의 많은 분야에서이 접근법의 민주화를 보여줍니다 1 .

역사적으로 ~ 10 μm 이하의 크기를 가진 결정은 구조 결정을 위해 사용하기에 어렵지 않은 경우 도전적인 것으로 간주되었습니다. 싱크로트론 방사선 소스의 전용 미세 초점 빔라인의 가용성 증가와 미세 결정 조작 도구 개발과 같은 기술적 진보로 인해 X 선 미세 결정의 폭 넓은 사용을 방해하는 이러한 장벽이 제거되었습니다. 직렬 X 선 마이크로 결정학 2 , 3 및 마이크로 전자 회절 4 ha의 발전구조 결정을위한 마이크로 및 나노 결정의 사용이 가능할뿐만 아니라 때로는 큰 결정 5 , 6 , 7 의 사용보다 바람직하다는 것을 보여 주었다.

이러한 발전은 제 8 펩티드 곤충 바이러스 9, 10에 의해 생성 된 천연 결정의 연구에 적용 하였다. 이들은 이제 막 단백질 복합체 크고 11 가장 어려운 시스템을 포함하는 생물학적 고분자의 다양한 사용된다. 이 미세 결정의 분석을 용이하게하기 위해 meso , 특히 멤브레인 단백질 12 와 마이크로 유체 칩 13 에서 분석되었습니다.

이러한 신규 microcrystallography 방법론의 가용성에 사용할 수있는 가능성을 제기in vivo 결정학에 대한 대안을 제공하는 구조 생물학 14 , 15 , 16 의 새로운 경로로서의 생체 내 결정화. 불행하게도, 생체 내 결정체가 생성 될 수있을지라도, 세포로부터의 정제 동안 리간드의 분해 또는 손실, 싱크로트론 빔라인에서의 수정 및 시각화의 어려움 및 지루한 X- 선 회절 실험과 같은 몇 가지 장애물이 남아있다. 대안으로 결정은 정제 단계 17 , 18 , 19 없이 셀 내에서 직접 분석되었습니다. 비교 분석은 cellulo 접근 그러한 정제 된 결정과 높은 해상도 (20)의 수율 데이터의 분석을보다 더 효율적이 될 수 있음을 시사한다.

이 프로토콜은단백질 미세 결정학에 새로운 연구원을 돕는 경향이 있었다. 싱크로트론 빔라인에서 X 선 회절 실험을위한 시료 준비 및 조작에 초점을 맞춘 방법론을 제공합니다. 두 가지 옵션이 고전 microcrystallography 또는 cellulo 분석 ( 그림 1 )에 대한 유동 세포 계측법에 의해 정렬 크리스탈 포함 세포에 대한 격리 된 결정을 사용하여 제안하고 있습니다.

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프로토콜

참고 : 생체 내 결정화는 박테리아, 효모, 식물, 곤충 및 포유 동물 (참고 문헌 21 에서 검토 됨)을 비롯한 많은 유기체에서보고되었습니다. 포유류 세포의 일시적인 형질 감염 및 곤충 세포의 바큘로 바이러스 감염을 사용하여 재조합 단백질의 결정화가 실험실에서도 달성되었다. 다음 프로토콜은 참조 22의 지침에 따라 생성 된 baculovirus polyhedrin promoter하에 재조합 baculovirus에 클로닝 된 Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) 폴리 헤드린 유전자를 사용하여 개발되었습니다. 따라서,이 프로토콜은 다른 세포 유형 ( 예 : 포유류 세포)에 적용될 수 있지만 여기에서는 곤충 세포에 대한 절차를 설명합니다. 프로토콜은 관심의 단백질의 과다 발현이 이미 달성되었다고 가정합니다. 재조합 배큘로 바이러스의 생산 방법 및 목적 단백질 발현을위한 방법은참조 번호 23 , 24 , 25 , 26 , 27에 적합하다 .

1. 결정 함유 세포의 동정

  1. 세포가 단일 층에서 성장하면 플라스크에서 직접 세포를 검사하십시오. 세포가 액체 배양에서 성장하면 다음 프로토콜을 사용하십시오.
    1. 멸균 serological 피펫을 사용하여 microcentrifuge 튜브에 세포의 500 μL를 전송합니다. 주 문화의 무균 상태가 유지되도록주의하십시오. Class II biosafety cabinet의 세포를 다루고 표준 무균 기술을 따른다.
    2. 유리 슬라이드에 microcentrifuge 튜브에서 세포의 5 μL 피펫.
    3. 조심스럽게 공기 방울의 형성을 피하면서 액체에 유리 coverslip을 놓으십시오. 슬라이드가 15 분 안에 시각화 수없는 경우 증발을 피하기 위해 진공 그리스로 coverslip을 봉인ation.
  2. 이미지 플라스크 또는 거꾸로 현미경 슬라이드. 가능한 경우 위상 대비 및 / 또는 미분 간섭 현미경 (DIC)을 사용하십시오. 두 기술 모두 투명 샘플의 명암을 향상시키고 선과 가장자리를 강조함으로써 생체 내 결정의 식별을 용이하게합니다.
  3. 조심스럽게 세포를 검사하십시오. 잠재적 인 결정을 감지 할 때 최대 배율로 200 배 확대부터 확대합니다. 결정의 존재는 세포 형태의 변화에 ​​의해 간접적으로 제시 될 수있다 ( 그림 2 ). 날카로운 모서리와 굴절률 변화 (위상차 또는 DIC를 사용하는 경우)를 찾습니다. 알려진 생체 내 결정은로드, 바늘의 스택, 큐브, 피라미드 및 다면체를 포함한 다양한 모양을 채택합니다 ( 그림 2 및 표 1 참조).
    참고 : 크리스탈을 포함하는 세포의 비율은 각 경우마다 다를 수 있으며 전날 수 있습니다n은 준비 사이에서 다양하지만 일반적으로 모든 세포에서 결정을 찾을 것으로 기대해서는 안됩니다. 유사하게, 세포 당 결정의 수 또한 가변적이며 ( 표 1 참조), 하나 이상의 결정이 하나의 세포에서 발견 될 수있다. 이 요인들은 감염의 다양성을 조절하고, 발현 길이를 변경하고, 단백질 구성을 변화시킴으로써 가능한 한 최적화 될 필요가있다. 한편으로는 결정을 포함하는 세포의 수를 최대화하는 단백질 발현 및 세포 성장 조건은 생산성을 향상시킬 것이다 ( 예를 들어 , 감염의 다중 다중성 및 세포 배양의 늦은 수확). 반면에, 세포가 단결정을 포함하는 조건은 데이터 수집을 용이하게합니다 ( 예 : 감염의 낮은 다중도). 2.2 단계에서 설명한 흐름 분류에 의한 농축을 감안할 때 결정이 포함 된 셀의 비율이 낮더라도 더 큰 결정 ( 예 : 셀당 단결정)을 목표로하는 것이 좋습니다.
  4. 크리스탈(플라스크에서 단층을 촬영할 때) 위치를 기록하고 결정을 함유하고있는 세포의 비율을 추정합니다. 가능한 경우 단일 셀 수준에서 변경 사항을 추적 할 수있는 카메라가 장착 된 현미경을 사용하십시오.
  5. 현탁액 상태 인 세포의 경우 참조 28에 상세히 설명 된 프로토콜에 따라 세포 생존력의 정도를 결정합니다. 단일 층에서 배양 된 세포의 경우, 육안 검사를 통해 합류 수준과 분리 된 세포의 양을 추정합니다.
  6. 결정 성장, 세포 성장 및 생존력을 하루에 두 번 모니터링하십시오.
  7. 결정 성장이 멈추자 마자 세포를 수확하십시오. 바이러스 polyhedra와 같은 현저하게 견고한 결정체의 경우, 배양 시간이 길어지면 (> 4 일) 큰 크리스탈의 수가 증가합니다. 그러나 전형적인 단백질 결정의 경우 세포 용해로 인한 손상을 방지하기 위해 생존률이 80 % 이하로 떨어지면 세포를 채취 할 것을 권장합니다.
  8. 인큐베이터에서 플라스크를 꺼내고단계 2.2. 별도로 지정하지 않는 한 다음 단계에서 세포를 얼음에 보관하십시오.

2. 시료 정제

주 : 정제 된 결정과 셀룰로오스 로부터 생체 내 결정을 분석하는 2 가지 방법을 각각 기술한다.

  1. 크리스탈의 정제
    주 : 관심있는 결정체가 저온에 민감하다는 증거가없는 한, 얼음에서 작업하고 결정 성 저하를 피하기 위해 얼음처럼 차가운 완충액을 사용하십시오.
    1. 50 ML 원추형 원심 튜브에 감염된 Sf9 세포 50 ML을 피펫. 이것은 전형적인 실험에서 ~ 4 x 10 8 세포를 나타냅니다.
    2. 4 ° C에서 10 분 동안 450 xg에서 펠렛 세포.
    3. 상등액을 버리고 40mL의 냉각 된 인산 완충 식염수 (PBS), pH 7.4로 펠렛을 재현 탁한다.
      참고 : PBS는 표준 목적의 완충액으로 정제를위한 출발점으로 제안되었으며,생체 내 결정이 자라는 세포 환경을 핥아 라. 그것은 현재까지 9 , 14 , 29 세포 배양에서 자란 대부분 의 생체 내 결정에 사용되었습니다. 또한 DMEM 배지는 포유 동물 세포 에서 생체 내 결정을 정제하는 데에도 성공적으로 사용되었습니다 19 . 결정이 눈에 띄지 않게 PBS에서 옮겨 지거나 열악한 회절을 보이는 경우,이 매개 변수는 잠재적 인 분해 원인으로 조사되어야합니다.
    4. 19 - mm 프로브가 장착 된 sonicator를 사용하여 resuspended 펠렛을 10 mA에서 30 초 동안 sonicate하십시오. 시료가 가열되는 것을 피하려면 초음파로 채우는 비커에 넣으십시오. 결정이 단계 2.1.7에서 평가 된 것처럼 초음파 처리에 의해 손상된 것으로 보이면 화학적 또는 기계적 세포 파괴가 대안으로 사용될 수있다.
    5. 4 ° C에서 10 분 동안 450 xg에서 원심 분리하십시오. 원심 분리 후, 2 개의 층이 명백하다 :엷은 갈색 인 세포 찌꺼기의 상부 층과 흰색과 백악질 인 작은 다각형 결정체의 작은 펠렛.
    6. 상등액을 버리고 신중한 pipetting하여 상위 레이어를 제거하십시오. 냉각 된 PBS 40 ML에 낮은 펠렛을 resupend.
    7. 광학 현미경으로 이미징하여 샘플의 품질을 평가합니다.
      1. 슬라이드 슬라이드에 5 μL의 세포 또는 정제 결정을 피펫으로 넣습니다. 이것은 실온에서 할 수 있습니다.
      2. 조심스럽게 공기 방울의 형성을 피하면서 액체에 유리 coverslip을 놓으십시오.
      3. 200X 배율로 거꾸로 된 현미경으로 이미지를 슬라이드합니다. 샘플을 슬라이드에서 준비한 후 15 분 이내에 이미지화하십시오. 슬라이드가 15 분 이내에 시각화 수없는 경우 증발을 피하기 위해 coverslip을 진공 그리스로 밀봉하십시오.
        참고 : 다면체의 경우, 결정은 한 면당 ~ 1 - 10 μm의 리플 렉트 큐브로 나타납니다. 선명도가 떨어지는 흔적을 찾고있는 크리스탈의 무결성을 확인하십시오.( 예 : 둥근 가장자리), 균열 또는 용해. 또한 불규칙한 크기와 모양의 덩어리와 물체로 나타날 세포 파편의 존재를 모니터링하십시오.
    8. 크리스탈이 잔해없이 나타날 때까지 각 사이클에서 펠렛을 다시 일시 중지하는 데 사용되는 PBS의 양을 반으로 줄인 2.1.5 ~ 2.1.7 단계를 반복합니다. 냉각 된 PBS 1 ML에 최종 펠렛을 Resuspend하고 microcentrifuge 튜브에 결정을 전송할 수 있습니다. 4 ° C에서 정제 된 결정을 보관하십시오.
    9. 제조사의 설명에 따라 혈구계를 사용하여 결정의 농도를 예측하십시오. 세포를 세는 것처럼 결정을 계산하십시오.

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그림 3 : 정제 된 Vivo Microcrystals. Sf9 곤충 세포로부터의 BmCPV1 폴리 헤드린 결정의 대표적인 정제는 ( a ) 펠릿 화 된 세포 파편 및 울음( b ) 잔해와 결정 층을 클로즈 업합니다. 파편 층은 조심스럽게 상청액에 재현 탁하고 신속한 결정 정제를 위해 폐기 할 수 있습니다. ( c ) 정제 된 다면체의 광학 현미경 이미지. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 유동 세포 계측법에 의한 결정 함유 세포의 분리
    참고 : 유동 세포 계측법에서 게이트의 정의를 용이하게하려면 관심있는 단백질을 발현하는 것과 동시에 대조군 배양을 성장시키는 것이 좋습니다. 이것은 비 관련 재조합 baculovirus로 Sf9 세포의 플라스크를 감염 시키거나 모의 감염된 세포를 준비함으로써 수행 될 수있다. 샘플의 정렬 및 이미지 처리는 일반적으로 실온에서 수행됩니다.
    주의 : Propidium iodide는 의심되는 발암 물질이므로 취급해야합니다.조심해서.
    1. Flow-cytometry 분석에 적합한 튜브에 ~ 3 x 10 7 세포를 나타내는 감염된 Sf9 세포 4 mL를 피펫으로 채 웁니다. 또한 비 재조합 배큘로 바이러스에 감염된 Sf9 세포와 동일한 수의 두 번째 튜브를 준비하십시오.
    2. 유동 세포 계측법 평가 직전에 1 μg / mL의 최종 농도로 두 샘플 모두에 propidium iodide (PI)를 첨가하십시오. 이 단계는 전방 및 측면 산란 플롯에서 세포 분포를 변경하거나 가릴 수있는 죽은 세포, 세포 덩어리 및 잔해를 확인하는 데 필요합니다. 물에서 1 mg / mL의 PI 스톡을 준비하고 4 ° C에서 보관하십시오.
    3. 순방향 - (FSC) 및 측면 - 산란 (SSC)에 따라 세포 분류가 가능한 표준 유동 세포 계측기에 세포를 적용합니다. 대조군 ( 즉, 비 - 결정 함유) 샘플의 적어도 20,000 개의 사건을 분석한다. 분석에서 죽은 세포, 세포 덩어리 및 파편을 버린 후, SSC 플롯으로 FSC를 생성하십시오.
    4. 적어도 20,000 개의 분석도 가능합니다.ts의 범위 내에있다. FSC와 SSC 플롯을 모의 것과 비교하십시오. 크리스탈 함유 세포에 해당하는 독특한 개체군의 모양을 찾습니다. 전형적으로, 세포 내 결정을 갖는 세포는 형태 학적 복잡성의 증가로 인해 더 높은 SSC를 가질 것이다. 결정 성장이 세포의 부피를 증가 시키면 FSC도 증가 할 수 있습니다. 모의 음모와 다른 산점도 영역에 해당하는 세포 집단을 분리하기 위해 플로우 분류기의 게이트를 정의하십시오. 크리스탈 포함 세포와 관련된 인구를 확인하기 위해 1 단계에서 설명한대로 정렬 된 샘플을 광학 현미경으로 이미지화하십시오.
    5. 단계 2.2.4에서 정의 된 게이트를 사용하여 결정 함유 세포를 PBS 또는 기타 다른 등장 성 완충액으로 분류한다. 정렬 된 결정 - 함유 세포의 수 및 후속 단계를 용이하게하기위한 최종 부피를 기록한다. 정렬 된 세포를 얼음 또는 4 ° C에 보관하십시오.
      참고 : 1 시간 안에,> 300,000 개의 다면체세포를 100mm 노즐 (39kHz의 주파수로 138kPa)로 셀 분류기상에서 분류한다. 이 셀의 양은 1,000 개 이상의 메시를 준비하는 데 충분합니다.
    6. 단계 2.1.7에 설명 된 프로토콜에 따라 광학 현미경으로 세포를 이미지화하여 결정이 함유 된 세포의 농축을 확인합니다. 결정이 세포 용해로 인해 시간이 지남에 따라 저하되거나 방출 될 수 있으므로 세포 분류 후 가능한 한 빨리 데이터 수집을위한 시료 준비를해야합니다.

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그림 4 : 셀 정렬. ( a ) 결정을 포함하지 않은 비 감염 세포 (모의) 및 ( b ) BmCPV1 폴리 헤드린에 대해 과발현 된 재조합 바큘로 바이러스에 감염된 Sf9 세포로부터의 대표적인 유동 세포 계측법 스 캐터 플롯. 두 개체군 사이의 산란 양상의 차이결정 - 함유 세포 집단의 적색 게이팅 (적색 게이트, 높은 SSC 값). 각 플롯은 20,000 개의 정렬 이벤트를 나타냅니다. SSC : 측면 광산란; FSC : 전방 산란. ( c ) 정렬 된 세포의 대표적인 집단의 광학 현미경 이미지. 세포 내 결정의 존재를 나타낸다. 스케일 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 데이터 수집을위한 샘플 준비

주 : 세포 또는 결정체가 실험적 단계별로 유도체 화되어야한다면 3.1 절에 설명 된 프로토콜을 따른다. 그렇지 않은 경우에는 정제 된 결정의 경우 섹션 3.2로 이동하거나 셀룰로오스 분석의 경우 3.3로 이동하십시오.

  1. 정제 또는 셀룰로오스 미세 결정의 유도체 화
    주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오.실험 단계적으로 사용되는 대부분의 화학 물질은 독성이 급합니다. 화학 흄 후드 및 개인 보호 장비의 사용을 포함하여 모든 적절한 안전 관행을 사용하십시오. 귀하의 기관 정책에 따라 폐기물을 폐기하십시오.
    참고 : 무거운 원자의 성질, 농도 및 배양 시간은 BmCPV1 폴리 헤드린의 결정을 나타내는 지표로 주어집니다. 이 매개 변수는 각각의 새 대상에 대해 실험적으로 결정되어야합니다. 세포가 단계적으로 사용되는 화학 물질에 의해 쉽게 착색되는 경우, 단계 3.3.2에서 트리 판 블루로 계속되는 염색을 생략 할 수있다.
    1. 원하는 중금속의 포화 용액 (또는 실험 단계별로 사용되는 다른 화학 물질 용액)을 준비하십시오. 일반적으로 각 중금속에는 100 μL보다 낮은 부피가 필요할 것이다. 실온에서 5 분 동안 미세 원심 분리기에서 최대 속도로 원심 분리하여 용해되지 않은 염과 잔해물을 제거한다.
    2. ~ 50,000 개의 결정의 분취 량 준비또는 중금속 화합물 당 분류 된 세포. PBS가 유도체 화에 사용 된 화학 물질과 호환되지 않는 경우 ( 즉, 침전물 형태가되고 용액이 흐려짐), 마이크로 원심 분리기에서 실온에서 4,000 xg로 3 분 동안 결정을 펠릿 화하거나 150 xg에서 3 분 동안 세포를 제거하고 뜨는 및 부드럽게 적절한 버퍼의 20 μL에 크리스탈이나 세포를 resuspend. PBS의 흔적이 남지 않도록 pelleting과 resuspension을 반복하십시오. 모든 분량에 대해 최종 부피를 20 μL로 조정하십시오.
    3. 중금속 용액 또는 결정 또는 세포에 선택의 다른 화합물 20 μL를 추가하십시오. 중금속의 최적 농도는 세포 매개 변수 (투과성, 목표 외 단백질 ...)와 관심있는 단백질의 결정 성질의 조합에 달려 있습니다. 출발점으로 3 가지 농도를 테스트하십시오 : 완전 채도, 1 / 10e, 1 / 100e.
    4. 최대 3 일 동안 4 ° C에서 샘플을 보관하십시오. polyh의 결정에드린은 내성이 강하고 밀도가 높으며 무거운 원자를 넣기 위해 오래 담가야합니다. 다른 유형의 결정에 대해서는 배양 기간과 중금속의 농도를 실험적으로 결정해야합니다. 배양 시간이 너무 짧으면 중금속의 적정량의 배합이 불가능하며 장시간 배양 시간은 결정의 완전성에 영향을 미쳐 회절 품질을 떨어 뜨리거나 심지어는 용해시킬 수 있습니다. 출발점으로 각 중금속 용액 ( 예 : 1 분, 1 시간 및 하룻밤)에 대해 3 가지 다른 배양 시간을 시도하십시오. 성공적인 유도법은 5 장 및 그 참조 문헌에 간략하게 설명 된대로 회절 데이터를 분석하여 평가합니다.
    5. 미세 원심 분리기에서 실온에서 3 분 동안 4,000 xg에서 결정을 펠렛 화하거나 또는 3 분 동안 150 xg에서 세포를 펠렛 화하여 과잉 원자 용액을 씻어 내고, 상층 액을 제거하고 완충액 10 μL에서 결정 또는 세포를 부드럽게 재현 탁한다. .
  2. 정화 된 미세 결정을 이용한 마이크로 메시지지의 준비
    주의 : 액체 질소를 사용하면 질식, 냉기, 산소가 풍부한 대기의 화재 및 폭발과 같은 위험이 있습니다. 해당 기관의 위험 관리 및 안전한 업무 관행을 참고하십시오.
    1. 단계 2.1.9에서 계산 된 결정 농도를 기준으로 시료를 희석하여 농도를 10 7 결정 / mL로 조정한다. 또는 결정을 미세 원심 분리기에서 실온에서 4,000 xg로 펠렛 화하고, 상등액을 제거하여 최종 부피를 조정하고, 부드럽게 결정을 재현 탁한다.
    2. 샘플을 미리 냉동해야하는 경우 건조한 발송인을 식히거나 액체 질소로 데워받습니다. 적절하게 튜브 또는 퍽을 준비하고 액체 질소로 냉각시킵니다.
    3. 크리스탈 펠렛을 Resuspend하고 pipetting하여 마이크로 메쉬에 결정의 0.5 μL 방울을 적용합니다. 25 μm 정사각형으로 700 μm 메시 사용구멍을 시작점으로 삼습니다. 메쉬의 영역은 중요하지 않지만 더 큰 영역은 메쉬 당 더 많은 결정을 제공하고 준비 중에보다 느린 증발을 유도합니다. 홀의 크기는 25μm보다 큰 결정의 크기에 맞게 최적화해야합니다. 체계적인 연구를 위해 필요한 경우 데이터 수집 중에 체계적인 그리드 스캔을 용이하게하기 위해 인덱싱 된 메시를 사용할 수 있습니다.
    4. 종이 위크로 물을 대서 과잉 액체 대부분을 제거하십시오. 결정은 서로 닿지 않고 메쉬에 균등하게 퍼져 있어야합니다. 단계 3.1.1을 반복하십시오. 시료 농도 최적화를위한 신속히 진행하고 너무 많은 액체를 제거하지 마십시오. 동결 방지제가없는 경우, 액체는 소금 결정 형성 및 / 또는 필름 손실의 위험으로 빠르게 증발합니다.
    5. cryoprotectant를 추가하십시오 : 메쉬에 물 속의 50 % 에틸렌 글리콜 용액 0.5 μL를 피펫에 넣으십시오 (cryobuffer의 조성은 시료에 맞게 조정해야하며, cryoprotectant는 참고 문헌 30 )에서 찾을 수 있습니다. 종이 위크로 닦아서 여분의 액체를 제거하십시오. 이전 단계와는 달리, 잔여 용매 막은 결정, 빔 경로 및 고니 오 미터 사이의 정렬 프로세스를 복잡하게하는 시차 효과를 줄이기 위해 가능한 한 얇아야합니다. 빔 경로 내의 액체에 의한 X- 레이의 산란에 의해 야기되는 배경을 최소화 할 수있다.
    6. 즉시 마이크로 메쉬를 액체 질소로 플래시 - 냉각 한 다음 바이알이나 로봇 퍽으로 옮기고 보관을 위해 건조한 화주 또는 듀어로 옮깁니다.
  3. 결정이 함유 된 세포를 이용한 마이크로 메쉬의 제조
    주의 : 액체 질소를 사용하면 질식, 냉기, 산소가 풍부한 대기의 화재 및 폭발과 같은 위험이 있습니다. 해당 기관의 위험 관리 및 안전한 업무 관행을 참고하십시오.
    1. 정렬 세포를 1.5 ML microcentrifuge 튜브로 옮긴다. 셀 c에 기반세포 분류기에서 기록한 양을 PBS로 희석하여 농도를 10 7 cells / mL로 조정합니다. 또는 microcentrifuge에 실온에서 150 xg에서 세포를 펠렛 팅하여, 상등액을 제거하여 최종 볼륨을 조정하고, 부드럽게 세포를 resuspending.
    2. 0.2 % (w / v)의 최종 농도로 trypan 블루 솔루션 (0.4 % 승 / 브이)의 동등한 볼륨으로 세포를 섞는다.
    3. 샘플을 미리 냉동해야하는 경우 건조한 시너를 식히거나 액체 질소로 분해하십시오. 적절하게 바이알이나 퍽을 준비하고 액체 질소로 냉각시킵니다.
    4. 부드럽게 세포를 재순환하고 정렬 된 세포 0.5 μL을 마이크로 메쉬에 pipette.
    5. 종이 위크로 닦아서 여분의 액체를 제거하십시오. 세포는 서로 닿지 않고 메쉬에 골고루 퍼져 있어야합니다. cryoprotectant (단계 3.3.6)를 사용하지 않는 경우 용매의 남은 필름은 부적합한 시차 효과를 줄이기 위해 가능한 한 얇아야합니다결정, 빔 경로 및 고니 오 미터 사이의 정렬 과정; 빔 경로 내의 액체에 의한 X- 레이의 산란에 의해 야기되는 배경을 최소화 할 수있다.
    6. 선택적으로 세포에 cryoprotectant를 첨가하십시오. 50 % 에틸렌 글리콜 0.5 %, 메쉬에 50 % PBS 용액을 피펫에 넣으십시오. 저온 여과기의 조성은 시료에 적합해야한다. 동결 방지제의 최적화 제안은 참고 문헌 30 에서 찾을 수 있습니다. 용제의 얇은 필름 만 남겨두고 종이 윅으로 닦아서 여분의 액체를 제거합니다.
      주 : 폴리 헤드린의 결정을 분석 하였다 cellulo 때이 단계가 정제 된 결정 (20)에 요구되고있는 동안 cryoprotection 단계의 생략은, X 선 회절의 품질을 변경하지 않았다. 이것은 세포를 동결 방지제 용액으로 항온 처리하는 경우에만 적용됩니다. 결정에 방사선 손상의 영향을 최소화하기 위해 샘플을 100K에서 분석해야합니다.
    7. Immedi마이크로 메쉬를 액체 질소로 가볍게 식힌 다음 약병이나 로봇 퍽으로 옮긴 다음 건식 운송업자 나 보관 용 듀어로 적절하게 옮깁니다.

4. 데이터 수집

참고 : 데이터 수집에 사용되는 매개 변수는 지침으로 제공되며 각 수정 유형 및 싱크로트론 빔라인에 맞게 최적화되어야합니다.

  1. (마이크로 포커스 빔라인 및 그 특성의 목록 참조 문헌 7) 마이크로 포커스 결정학 빔라인에 대한 데이터를 수집한다. 가능한 경우 크리스탈의 크기와 일치하는 평행 광선을 사용하십시오.
  2. Single-wavelength Anomalous Dispersion 방법 (SAD)에 의한 실험적 위상 조절을 위해, 선택되는 중금속의 비정상 신호를 최대화하는 에너지를 수집하십시오. Multiple Isomorphous Replacement method (MIR)를 사용하는 페이징의 경우, 선택하는 중금속에 적합한 흡수 가장자리의 에너지를 모으십시오 (http://skuld.bmsc.washington.edu/sc에서 사용 가능).atter / AS_periodic.html).
  3. Goniometer에 메쉬를로드 한 후, face-on (볼록한면)과 side-on orientation을 사용하여 빔 경로로 마이크로 메시를 센터링함으로써 시작하십시오. 그런 다음, 마이크로 메쉬를 사용하여 마이크로 메쉬의 특정 수평 레인의 중심을 정렬하여 정렬을 미세하게 조정하십시오 (예를 들어 중앙에서 시작). 그런 다음 정렬에 약간의 재조정만으로이 수평선을 따라 데이터를 수집하십시오. 가능한 경우 정렬을 미세 조정하기 위해 저선량 X 선 회절에서 래스터 링을 기준으로 센터링을 사용하십시오 (싱크로트론 빔라인의 로컬 연락처에 문의하십시오).
    참고 : 방사선 피해 (일반적으로 1 ° 진동의 경우 10-30 개의 이미지)로 인해 미세 결정에 제한된 양의 데이터를 수집 할 수 있으므로 이론적으로 크리스탈은 10-30 °의 빔 경로와 정렬해야합니다. 그러나, 결정이 마이크로 빔에 의해 쉽게 놓칠 수 있기 때문에 정렬이 정확해야한다는 것이 중요합니다 (일반적으로 직경에 평행하게 됨)10μm 이하).
  4. 방사선 손상으로 인해 회절이 손실 될 때까지 회절 데이터를 수집합니다. polyhedrin의 결정에 대해, 10 초의 노출 시간은 일반적으로 CCD 검출기 (총 용량 <30 MGy)로 13 keV에서 약 3.6 x 10 11 광자 / s의 플럭스에 대해 1 ° 진동에 사용됩니다. 빔라인과 사용 된 크리스털의 특성에 따라 이러한 설정을 최적화하십시오. 특히 픽셀 X 선 검출기에는 저용량 및 미세 슬라이싱이 권장됩니다.
    참고 : 셀 룰로 전략을 사용하는 경우 트리 판 블루로 염색 된 세포는 지원 배경에 파란색 점으로 나타나므로 빔에 쉽게 정렬 할 수 있습니다. 시준 된 마이크로 빔이 셀 (~ 10 μm)과 거의 동일한 크기이면 셀에 포함 된 모든 결정이 동시에 조명됩니다. 다수의 미세 결정을 포함하고있는 세포의 경우 여러 회절 패턴의 관찰로 이어 지므로 처리가 어려울 수 있습니다. 그러나, 디결정들 중 하나로부터의 파편은 종종 회절 패턴을 지배하는 경향이 있고, 데이터 처리 중에 우선적으로 인덱싱된다. 셀보다 훨씬 작은 X- 선 빔이있는 빔라인의 경우, 데이터 수집 전에 단결정을 중심으로 매우 낮은 X- 선 자속 (95 % 이상 감쇠)에서 래스터 링을 사용해야합니다.
  5. 차선의 다음 결정으로 진행하십시오.
  6. 일단 차선의 모든 결정이 테스트 되었으면 다음 차선으로 진행하고 정렬 절차를 반복하십시오. 충분한 데이터가 수집되거나 모든 결정이 테스트 될 때까지 진행하십시오.
    1. 처리 된 차선이 명확하게 식별되어 결정이 놓치거나 두 번 찍히지 않도록하십시오 (필요한 경우 스케치 그리기). 일반적으로 트리 판 블루는 세포가 조사 된 후에 노란색으로 바뀌며 마커로 사용될 수 있습니다.

figure-protocol-3
그림 5 : 마이크로 메쉬 지원에 대한 샘플의 데이터 수집 전략. ( a ) 차선 당 데이터 수집 전략; 정렬은 각 레인 (도트)의 시작에서 이루어지며 데이터는 레인을 따라 수집됩니다. ( b ) microcrystallography beamline 화면에서 볼 수 있듯이, trypan blue로 염색 된 크리스탈 함유 세포가 메쉬에 클로즈업되어있다. ( c ) 미세 결정학 빔라인 스크린에서 볼 수 있듯이, 메쉬상의 정제 된 다면체의 클로즈업. 메쉬 사각형은 25 μm x 25 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 데이터 처리

참고 : 여기서 우리는 일련의 결정에서 데이터가 병합되는 일련의 미세 결정학에 특정한 데이터 처리 단계만을 간략하게 언급합니다. 많은 우수 기사가 있습니다.31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 깊이의 데이터 처리에 대한 설명이 가능하며 구조 결정은이 프로토콜의 범위를 벗어납니다.

  1. 최고의 회절 해상도와 품질을 가진 결정을 기준으로 선택하십시오.
  2. HKL-2000 31 , Mosflm 32 또는 XDS 33 과 같은 표준 결정학 패키지를 사용하여 각 결정을 개별적으로 처리하십시오. 방사선 손상으로 인해 데이터 세트의 품질이 떨어지지 않도록 허용 가능한 방사선 손상으로 마지막 이미지를 신중하게 선택하십시오. 과도한 방사선 손상을 나타내는 차단 기준은 각 수정 유형, 처리 실습 및 실험 목적에 따라 다릅니다. BmCPV1 폴리 헤드린 결정의 단계적 조정을 위해, 신호 - 대 -HKL-2000 31 에보고 된 바와 같이 이미지 당 2 개의 Oise / <σ (I)>가 떨어지거나 R sym 이 50 %를 초과했습니다.
  3. 각 크리스탈에 대해 해상도 제한과 프레임 수를 정의하고 올바른 매개 변수로 재 처리하여 거의 또는 전혀 신호없이 데이터를 통합하지 않도록하십시오.
  4. HKL-2000 31의 Scalepack , CCP4의 SCALA 34 , 35 또는 XDS 33의 XSCALE과 같은 표준 패키지를 사용하여 최상의 결정에서 기준 결정으로 데이터를 스케일하고 병합하십시오. 이상적으로 데이터 세트가 수용 가능한 완전성 (> 95 %)에 도달 할 때까지 데이터 세트의 전체적인 품질을 모니터링하면서 다른 크리스탈의 데이터를 점진적으로 추가하십시오. 단위 셀 매개 변수의 차이와 이미지 당 R 병합 / 카이 제곱의 불량으로 검출 된 최상의 / 참조 결정으로 불량한 동형 이성을 나타내는 결정을 거부합니다. 너무 많은 양질의 데이터 세트참조 결정 (들)에 비례하지 않는 경우 계층 적 클러스터링을 수행하는 BLEND 36 과 같은 프로그램을 사용하여 병합 할 최상의 데이터 조합을 정의하십시오.
    참고 : 일부 공간 그룹에서는 참조 수정과 일치하도록 대체 색인 옵션을 테스트해야합니다.
  5. 표준 결정학 패키지를 사용하여 실험적 위상 조절, 분자 치환 또는 정제로 진행하십시오.

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결과

생체 내 미세 결정을 이용한 구조 결정을위한 두 가지 대체 방법의 개요가 제시됩니다 ( 그림 1 ). Polyhedra는 초음파 처리 및 원심 분리로 쉽게 정제 할 수 있습니다. 밀도 때문에, 그들은 pipetting ( 그림 3a 와 3b )에 의해 제거 할 수있는 파편 층 밑에 튜브의 바닥에 레이어를 형성합니다. 그런 다음 샘플을 여러 차례의 초음파 처리하고 펠렛의 흰색 및 백악면으로 판단 할 때 충분한 순도에 도달 할 때까지 세척합니다 ( 그림 3c ).

in cellulo approach의 경우, 감염되지 않은 세포의 유동 세포 계측...

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토론

이 프로토콜은 과거에 간과되었을 작은 결정의 분석을 용이하게하기 위해 미정을 분석하는 두 가지 접근법을 제공합니다.

미세 결정 정제를위한 중요한 단계
제시된 프로토콜은 Sf9 세포에서 발현 된 Bombyx mori CPV1 폴리 헤드린을 모델 시스템으로 사용하여 최적화 하였다. 그러나, 생체 내 미결정은 기계적 저항성에 큰 변화를 보인다. 예를 들면, 곤충 세포에서 성장 카 텝신 B의 침상 결정은 강성 및 기계적 스트레스에 매우 내성, 여기 14 설명한 것과 유사한 프로토콜을 사용하여 정제 할 수있다. 한편, 또한 배양 된 곤충 세포에서와 유사한 침상 형태로 성장 반딧불이 루시퍼 결정, 즉시 세포 용해 (38)에 용해. 따라서, 생체 내 추출 및 정제 프로토콜수정은 단계 1.3, 2a.3-4, 2b.4...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

저자들은 오스트레일리아 싱크로트론의 MX2 빔라인에서의 지원을 위해 정화 된 미세 결정, Daniel Eriksson 및 Tom Caradoc-Davies의 사진을 제공 한 Chan-Sien Lay과 Monash University의 FlowCore 시설에서 나온 Kathryn Flanagan 및 Andrew Fryga 귀중한 도움.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Sf9 세포Life Technologies
SF900-SFM, 곤충 배지Life Technologies
, 1 L 세포 배양 플라스크, Thermofisher Scientific
곤충 세포 배양을 위한 쉐이킹 인큐베이터Eppendorf
50 mL 코니컬 튜브, 50
Centrifuge 튜브Eppendorf
Sonicator에는 19 mm 프로브MSE Soniprep 150이
유리 슬라이드Hampton Research
혈구계Sigma-Aldrich
Propidium iodideThermofisher Scientific
BD 유입 세포 분류기 BD Biosciences
Hampton Heavy 원자 스크린Hampton Research
MicrocentrifugeEppendorf
MicromeshMitigen700/25 mesh는 더 넓은 표면을 제공합니다. 체계적인 연구를 위해 인덱싱된 메쉬를 구입할 수 있습니다.
종이 심지Mitigen종이 심지의 크기는 최적의 흐름을 위해 다양할 수 있습니다. 이것은 사용된 결정과 동결 방지제의 특성에 크게 좌우됩니다.
에틸렌 글리콜Sigma-Aldrich
Trypan blueLife Technologies
MX2 미소초점 빔라인호주 싱크로트론사용 가능한 미소초점 빔라인 목록은 Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein
microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793– 1806,
doi:10.1071/CH14455.
, , , mL용 스윙 버킷이 있는 Falcon 장착되어 있습니다.

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