우리는 성공적으로 슬라이드를 전체 마운트로 고정시킨 유방 조직을 조직 병리학 적 평가를 위해 성공적으로 제거, 가공, 절단 및 착색하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 생식 및 발달 테스트 지침 연구에서 유선 전체 마운트의 수집 및 평가를 촉진 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
정상적인 유선 분비는 환경 독성 물질 및 의약품에 노출되거나 호르몬에 과도하게 노출되거나 유전 적 변형이 일어날 수 있습니다. 유선 전체 마운트는 노출 후에 발생할 수있는 형태 학적 변화의 진행을 포착하기위한 저렴한 방법입니다. 그러나 비정상 성이 더 많이 발생하기 시작하는 나중의 삶에서,이 한 가지 방법에 대한 단독 신뢰가 항상 이상의 적절한 진단을 내리기에 충분한 정보를 제공하지 못할 수도 있습니다. 역사적으로, 화학 테스트 가이드 라인 연구에서 단일 유선이 부검시 제거되고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)으로 염색 된 섹션으로 준비됩니다. 반대쪽 유방 전체 수집 및 분석의 통합은 위음성 평가의 가능성을 줄입니다. 전체 마운트의 평가는 슬라이드에 하나 또는 두 개의 전체 유선이 존재하는 경우에 제한적이며 경우에 따라 전체 마운트에서 관찰 된 이상은 없습니다.t는 H & E 섹션에서 균일하게 표현됩니다. 이 연구의 목표는 달리 덮어 버렸거나 진단하기 어려운 병변을 식별 할 수 있도록 coverslpped mammary 전체 마운트를 H & E로 염색 된 절편으로 변환하기위한 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다. 여기서는 처음에 전체 마운트로 준비된 유선으로부터 고품질의 파라핀이 포함 된 H & E 섹션을 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. H & E 절단을 위해 의도적으로 준비된 조직과 비교하여, 전체 마운트는 조직 제거 및 처리를위한 추가 준비를 필요로합니다. 그러나이 방법은 일반적인 실험용 시약과 약간의 추가 시간이 필요하기 때문에 값이 싸다. 결과적으로,이 방법은 화학적 및 환경 적 노출로 인해 정상적인 유방 발달을 어떻게 변화시키고 유전 적 변형으로 인해 발생하는 변화를 디스플레이하는지에 대한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다.
서론
mammary whole mountis는 정상적이고 화학적으로 유도 된 비정상적인 발달을 이해하기 위해 많은 쥐와 마우스 연구에서 구현 된 유용하고 저렴한 방법입니다. 일반적으로 설치류 개발 단계 ( 예 : 사춘기, 사춘기, 중기 - 후기 및 출생기)에 여러 단계로 수집 된 유선은 우상, 내분비 및자가 분비 인자에 의해 영향을받는 조직 및 세포 구조의 형태 학적 변화를 보여줍니다 1 . 노화 된 쥐에서, 선의 상피 및 간질 부분이 점차적으로 밀도가 높아져서 전체적인 형태로 형태 학적 매개 변수를 측정하는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 미시적 수준의 변화를 확인하기 위해 조직 학적 평가를 위해 림프를 수집하는 것이 일반적입니다. 두 공정 모두 화학적 노출 ( 즉, 환경 적 또는 약학 적)과 관련된 연구 또는 유전 적 변화에 따른 형태 학적 변화를 조사하는 데 특히 유용합니다ations.
위험 평가에서 유선을 사용하기위한 기술과 기능은 계속 진화하고 있습니다. 전체 장착 준비가 일상적이고 표준화되어있는 반면, 절편 수정은 2 , 3 단계로 이어 집니다. 일부 실험실은 아직 피부 사를 통해 크로스 컷 섹션을 사용하는 동안 다양한 배경 (즉, 학계, 정부 및 업계)에서 많은 연구 그룹은, 바람직한 방법으로 유방 조직의 종 방향 / 코로나 섹션을 채택했다. 후자의 방법은 관심있는 조직 (유선 상피 2 )보다는 표피 (피부)를 과도하게 표현합니다. 코로나 또는 종단면 인해 증가 된 표면적 및 본 구조물의 개수 이상 병변의 검출을 향상 크게 정상 조직 5 특징과 더 유용하다. 전반적으로 이것은 전체 mo를 만듭니다.유선의 비교 조직 병리학 적 평가를위한 적절한 방법 1 , 2 . 사타구니 동맥 번째 마우스 또는 래트, 검색하고, 4 번째 및 5의 보존을 사용하는 것은 매우 전체 비교 추천 여부 반대측 H & E 부분에 장착.
H & E 섹션과 전체 마운트는 환경 노출로 인한 세포 및 형태 학적 변화에 대한 정확한 설명을 제공합니다. 이는 모델이 종양 형성에 대한 감수성이 낮거나 종양이 현저하게 보이지 않는 특정 설치류 계통에서 특히 그러하다. 경우에 따라 두 가지 기술 ( 즉, 부족한 조직의 양, 자원 또는 예기치 않은 실험 결과)을 사용하여 필요한 조직을 얻는 것이 항상 가능하지 않을 수도 있습니다. 우리의 경우, 유방 전체에서 이상이 관찰되었지만, 조직 병증대 측성 H & E 글 랜드의 논리적 발견은 대체로 정상적이었다. 반대쪽 샘 사이의 압도적 인 불일치로 인해 우리는 전체 산에서 이상을 확인하는 경제적이며 효율적인 절차를 개발하게되었습니다. 변형 된 가공 및 삽입 절차를 사용하여 고품질의 H & E로 염색 된 섹션을 파라핀 내장형 마운트에서 준비했습니다. 우리는이 프로토콜이 화학 물질 노출 효과를위한 강력한 탐지 도구가되어 실험실 간 비교를 향상시킬 수 있다고 생각합니다.
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프로토콜
이 연구를위한 모든 동물의 사용과 절차는 NIEHS 실험 동물
보살핌 및 사용위원회와 협회의 평가 및 인정 협회에서
실험 동물 관리 인증 시설.
1. 유방 전체 마운트 준비 2 , 3 , 6 , 7
- 참조 3에 설명 된대로 임신하지 않은 CD - 1 암컷 마우스의 한쪽에서 사타구니의 유선을 제거하고 정전기가있는 슬라이드에 올려 놓습니다.
- 글 랜드를 붙지 않는 종이 또는 필름으로 덮고 다른 슬라이드를 맨 위에 놓습니다. 글 랜드가 슬라이드에 고정되어 고정되도록 글 랜드를 평평하게 펼치기 위해 슬라이드에 압력 ( 예 : 물 무게)을가하십시오.
- 슬라이드를 고정액 ( 예 : 100 % 에탄올, 클로로포름, 빙초산 6 : 3 : 1 비율)에 담근다.실온에서 하룻밤.
- 정착액에서 땀샘을 제거하고 에탄올에서 15-30 분 동안 씻으십시오. 30 분 세척 후에 에탄올 1/3을 붓고 물을 가하여 서서히 물로 변합니다. 매번 약 5 분 동안 씻으십시오. 그리고 물을 3 번 더 가하여 반복하십시오.
- 12-24 시간 동안 얼룩 ( 예 : 카민 연금 용액).
참고 : 두꺼운 조직은 더 긴 염색 시간을 필요로합니다. 자세한 염색 방법은 참고 문헌 3 을 참조하십시오. - 할당 된 시간 후에 얼룩을 털어 내고 슬라이드를 30 초 동안 물에 헹구십시오. 95 % 에탄올에서 15 분 씻고 20 분 동안 100 % 에탄올에서 최종 씻음을 수행하여 15 분 동안 70 % 에탄올에서 슬라이드를 세척하여 조직을 탈수.
- 조직을 두껍게하면 최소 24 시간 이상 자일 렌에 넣고 조직에서 지방을 제거하여 불투명 한 부분이나 흰색 부분을 제거합니다.
- 자일 렌에서 티슈를 제거하고 신속하게 m조직 탈수증을 피하기 위해 슬라이드에 매체를 ounting; 상단에 coverslip을 놓으십시오. 적어도 48 시간 동안 슬라이드를 건조시킵니다.
- 2 에서 설명한대로 전체 장착 된 조직을 비정상 상태로 평가하십시오.
참고 : 병변이 전체 마운트에서 감지되고 신원 확인을 위해 절편이 필요한 경우 다음 단계를 따라야합니다.
2. 유리 슬라이드에서 유방 전체 마운트 제거
- 유성 전체 마운트 슬라이드를 자일 렌으로 가득 찬 유리 얼룩 항아리에 담그고 coverslip 및 장착 매체를 제거하십시오.
참고 : 과도한 장착 솔루션으로 두꺼운 조직과 슬라이드는 커버 슬립 제거에 추가 시간이 필요할 수 있습니다. - 초기 밤새 담가 준 다음, 슬라이드를 신선한 크실렌에 넣고 6 시간 동안 담그십시오. 신선한 크실렌에 마지막으로 한 번 담근다.
참고 : 커버 슬립은 마지막 담금 후 슬라이드에서 쉽게 떨어집니다. - ag손을 사랑, 슬라이드를 잡고 조심스럽게 한 조각에 제거되도록 포셉 한 쌍의 coverslip을 제거하십시오.
참고 : coverslip 여전히 유리 슬라이드에 첨부 된 경우, 약간의 노력으로 제거 할 수있을 때까지 몸을 담그기를 계속하십시오. - coverslip가 제거되면, 자일 렌을 포함 유리 페트리 접시에 수직으로 슬라이드를 잡고 신중하게 날카로운, 일회용 면도날을 가지고 슬라이드 아래로 단일 운동에 블레이드를 슬라이드.
- 일단 조직이 제거되면, 유분 패드를 크실렌이 채워진 유리 페트리 접시에 신속히 잠기 게하여 조직이 공기 건조하지 않도록하십시오.
참고 :이 단계에주의하십시오. 전체 마운트는 얇고 (≤ 1 mm) 크실렌 가공으로 인해 깨지기 쉽습니다. 모든 인상이나 눈물이 조직의 형태를 변화시키고 나중의 평가를 복잡하게 만들 수 있습니다.
3. 조직 처리
- 일단 조직이 페트리 접시에 있으면 신중하게 그것을 전송표지 된 조직 학 카세트에. 뭉툭한 코 모양의 톱니 모양의 집게로 지방 패드의 가장자리를 잡고 조직 손상을 최소화하십시오.
- 면도칼을 사용하여 더 큰 조직 (특히 쥐의 경우)을 반으로 잘라내어 조직 크기를 수용 할 수있는 두 개의 별개의 분류 된 카세트에 두십시오. 조직을 오른쪽면을 위로 향하게합니다 (참조로 림프절을 사용하십시오). 림프절이없는 조직을 카세트로 옮길 때 똑바로 세우십시오.
- 카세인을 키 실렌 용기에 넣고 최대 2 시간 동안 티슈 프로세서에 넣습니다.
참고 : 샘플을 카세트에 넣은 당일에 샘플을 처리하는 것이 좋습니다. 크실렌에 장시간 담그는 것은 테스트되지 않았습니다. - 최대 수의 카세트를 손으로 티슈 프로세서에 넣으십시오.
- 시작하기 전에이 프로세스에 사용될 모든 시약을 프로세서의 시약 목록에 프로그래밍하십시오. 이동을 자동화하려면한 스테이션에서 다른 스테이션으로 이동하려면 메뉴 옵션을 사용하여 새 프로그램을 작성하십시오. 모든 단계가 완료되면 '확인'을 선택하여 계속 진행하십시오.
참고 : 프로세서는 시작하기 전에 모든 스테이션 세부 정보를 검토 할 수 있습니다.- 37 ℃에서 30 분 동안 크실렌에 카세트를 담그도록 프로세서를 자동화 한 다음 동일한 조건에서 새 크실렌에 두 번째 담그십시오. 프로세서를 자동화하여 자일 렌 용액에서 카세트를 제거하고 조직을 60 ° C에서 30 분 동안 1 : 1 크실렌 : 용융 파라핀 혼합물이 들어있는 다음 스테이션으로 옮깁니다.
참고 : 프로세서는 용융 된 파라핀이 들어있는 새 챔버에 카세트를 1 시간 동안 옮깁니다. 1 시간 후 시료는 새로운 용융 파라핀의 새로운 챔버로 자동 이송되어 2 시간 더 처리됩니다. 두 단계 모두 60 ° C에서 수행됩니다. - 프로세서는 용융 된 파라를 포함하는 스테이션으로 카세트를 이송합니다1 시간 동안 ffin. 그런 다음 샘플을 자동으로 새로운 용융 파라핀 최종 스테이션으로 옮기고 추가 2 시간 동안 가공합니다. 두 단계 모두 60 ° C에서 수행됩니다.
- 37 ℃에서 30 분 동안 크실렌에 카세트를 담그도록 프로세서를 자동화 한 다음 동일한 조건에서 새 크실렌에 두 번째 담그십시오. 프로세서를 자동화하여 자일 렌 용액에서 카세트를 제거하고 조직을 60 ° C에서 30 분 동안 1 : 1 크실렌 : 용융 파라핀 혼합물이 들어있는 다음 스테이션으로 옮깁니다.
4. 가공 유방 조직 삽입
- 몰드에 조직을 삽입 할 준비가 될 때까지 삽입 스테이션의 58 ° C 파라핀 고정 탱크에 카세트를 놓습니다.
- 카세트 커버를 제거하여 조직의 최적 금형 크기를 결정하십시오. 곰팡이가 조직을 수용하기에 충분히 큰 지 확인하고 조직이없는 경계선 주위에 파라핀이없는 충분한 공간을 남겨 둡니다.
- 용융 된 파라핀 3 ~ 4mm를 금형에 넣고 유리 슬라이드의 하단과 카세트의 바닥에 인접한 유성체 전체 표면을 금형에서 위로 향하게합니다.
- 금형을 냉각 판에 옮기고 필요에 따라 금형과 평행이되도록 조직을 신속하게 조정하십시오. b오트밀.
참고 : 파라핀이 경화되면 조직이 제자리에 고정됩니다. - 따뜻한 포셉을 사용하여 카세트의 아래쪽 절반을 금형 위에 놓습니다. 포셉을 사용하여 단단히 누르십시오.
- 연속 카세트 전체를 덮기 위해 추가로 용융 파라핀을 몰드에 추가하십시오. 몰드를 따뜻한 판에서 차가운 판으로 이동시켜 블록의 경화를 완료하십시오.
- 파라핀이 완전히 응고되어 균열이나 공기 방울이 생기지 않는 경우 금형에서 블록을 제거합니다.
참고 : 파라핀 묻힌 조직을 준비가 될 때까지 실내 온도에 보관하십시오.
5. Microtome에 파라핀 묻힌 유방 조직 단면도
- sectioning하기 전에 -20 ° C에서 1 시간 파라핀 블록을 품어.
참고 : 원래 덮개가 달린 전체 장착 티슈에서 블록에 잔여 장착 매체가 있습니다. 블록을 차게하면 블록 세분화 및 리핑이 향상됩니다. - 마이크 준비하기신선한 증류수가 들어있는 수조를 켜고 42-45 ° C로 온도를 조절하여 로토메를 얻는다. 신선하고 얇은 날을 마이크로톰 위에 놓고 4 μm로 설정하십시오.
참고 : 조직에 잔여 장착 매체가 있기 때문에 단면 품질이 4 μm보다 두꺼운 부분은 줄어 듭니다. - 왁스가 블레이드를 마주하고 수직면과 정렬되도록 블록을 마이크로톰에 삽입하십시오. 그런 다음 차가운 물에 거즈 패드 부분을 적신 다음 몇 분 동안 블록 위에 놓습니다.
- 거친 고급 휠과 함께 시계 방향으로 커다란 바퀴를 돌리면서 블록의 전체면이나 대표 부분을 얻을 때까지 블록을 분할하십시오.
참고 : 조직은 전체 장착 과정에서 크실렌 제거 때문에 얇습니다. 블록을 블레이드와 올바르게 정렬하여 대표 섹션을 얻는 데 필요한 절단 수를 최소화합니다. - 리본을 선택하십시오.섹션을 손으로 조심스럽게 뜨고 (45 ° C) 따뜻한 물통 (사전 준비)에 리본을 조심스럽게 올려 놓고 조직 주름이 흩어 지도록 조심스럽게 섹션을 깨끗한 유리 슬라이드 위에 띄웁니다.
- 과도한 물을 제거하기 위해 슬라이드를 건조 랙에 똑바로 세웁니다. 37 ° C에서 약간 열린 슬라이드 상자에 슬라이드를 품어주십시오.
6. 단면 유방 조직의 자동 및 수동 H & E 염색
- 얼룩이지기 전에 슬라이드는 실온에서 보관됩니다.
- 자동 염색의 경우 기본 메뉴의 얼룩 옵션에서 H & E를 선택하십시오. 탈 파라핀 화, 염색 및 탈수는 모두 자동화 된 염색기에서 완료됩니다. 장착 매체와 coverslip을 사용하여 섹션을 마운트하십시오.
- 수동으로 슬라이드를 염색 경우, 5 분 동안 자일 렌에 슬라이드를 immersing하여 섹션을 deparaffinize. 신선한 크실렌으로 옮기고 5 분 동안 반복하십시오.
- thers immersing하여 슬라이드 rehydrateem 100 % 에탄올에서 2 분씩 3 분간 처리 한 후 95 % 에탄올에서 2 회 반복하고 5 분마다 1X 세척 완충액에서 2 회 세척한다.
- 슬라이드를 증류수로 헹구십시오.
- 1-2 분 동안 hematoxylin에 슬라이드를 추가합니다. 슬라이드를 꺼내 5 분 동안 흐르는 수돗물로 헹굽니다.
참고 : 사용 전 헤 마톡 실린을 걸러냅니다. - 슬라이드를 1 % 빙초산에 넣고 30 초간 분화를 촉진시킨 다음 1 분 동안 수돗물로 헹구십시오.
- 30 분 ~ 1 분 동안 1X PBS에 슬라이드를 추가하여 조직 절편을 파란색으로 한 다음 수돗물로 5 분간 헹구고 15 ~ 20 초 동안 95 % 알코올로 헹군다.
- 30 초에서 1 분간 에오신 용액으로 대조 염색하십시오. 다음에, 신선한 95 % 에탄올에서 두 번 탈수 해 100 % 에탄올에서 2 번 반복합니다. 각 세척을 5 분 동안 수행하십시오.
- xylene에있는 슬라이드를 각각 5 분 동안 두 번 변경하십시오.
- Coverslip장착 매체와 조직 섹션과 상온에서 하룻밤 건조 플랫.
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결과
이 방법은 유방 패드의 원래 대 측성 H & E 섹션에 조직 학적 변화가 나타나지 않으면 놓치기 쉬운 진단을 돕는 데 효과적입니다. 그러나 결과는 조직 학적 평가를위한 조직 준비 과정뿐만 아니라 초기 전체 마운트 준비 과정에서주의를 기울이는 경우에만 유용합니다. 파라핀 삽입은 보호를 제공하고 장래의 절개를 위해 조직을 보존하는 데 도움이됩니다.
유방 조직의 이상적인 두께를 결정하기 위해 4 μm 및 6 μm 단면을 준비했습니다. 우리는 마이크로톰에서 ± 1μm의 오차 범위보다 큰 깊이를 시험했다. 6 μm 두께의 섹션 ( 그림 1A )은 컴팩트 한 셀로 매우 밀집되어있었습니다. 전반적으로, 슬라이드에는 적절한 식별 정보를 작성하는 데 필요한 개별적인 세포 세부 정보가 부족했습니다.ication. 최적의 두께는 4 μm ( ...
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토론
유선의 전체 마운트는 내분비 교란 물질을 포함한 화학 물질에 노출 된 후에도 발생할 수있는 정상적인 유방 발달 및 형태 학적 변화를 설명하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 동일한 동물의 전체 산과 H & E 섹션을 함께 평가하면 조기 변경에 대한 정확한 시각적 스냅 샷을 제공 할 수 있으며, 이는 더 병이있는 상태로 진행될 수 있습니다.
이 유용한 정보를 얻을 수있는 능력은 조직을 제거 할 때 선 형태를 보존하고 손상시키지 않도록주의를 기울이는 데 있습니다. 설치류가 등쪽 벽을 따라 양측에 위치하는 여러 유선 위치를 가지고 있지만 근육 조직 회복을 최소화하기 위해 4 th 및 5 th 땀샘을 수집하는 것이 좋습니다. 젖꼭지 부착 영역과 림프절도 유용한 형태 학적 지표로 사용되어야합니다. 글 랜드도 펼쳐져 있고 스트레칭되어야합니다.평평한 표면 ( 예 : 유리 슬라이드, 카드지 또는 천)을 가로 질러 붙어서 조...
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공개 사항
저자는이 기사의 연구, 저자 및 / 또는 출판과 관련하여 선언 할 수있는 이해 관계가 없습니다.
감사의 글
저자는이 프로젝트에 대한 기술적 전문성과 지원으로 Pam Ovwigho, Tenette Jones 및 NIEHS의 Natasha Clayton을 인정하고자합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | 마운팅 미디어는 전체 마운트 및 H&를 커버슬립합니다. E 섹션 |
| Leica 자동화 프로세서 | Leica Biosystems | 모델 # ST5020 | |
| HM 355S 자동 마이크로톰 | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| 파라핀 | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus 현미경 슬라이드 | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | 정전기 충전 |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | 커버슬립 |
| Varistain Gemini ES 자동 슬라이드 염색기 | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | 액체 접착제; 수조에서 사용됨 |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Thermo Scientific의 일부) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| 리튬 카보네이트 | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| 빙하 아세트산 | 열 Fisher Scientific | A38-500 | Carnoy의 고정액 |
| 클로로포름 | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | 필요함 Carnoy의 고정액 |
| 100% 에탄올 | Warner Graham Company | 6505001050000 | Carnoy의 고정액 및 세척 슬라이드에 필요 |
| 95% 에탄올 | Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| 알루미늄 황산칼륨 수화물, 시그마 울트라 | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| 자동화 세척 버퍼, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
참고문헌
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- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , In press (2017).
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