상부 기도 면역 중재자 수준 Vivo에서 의 정량화에 대 한 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링

요약

이 프로토콜에서는 위 항공에서 그대로 점 막 안 대기의 샘플링에 대 한 비 침 투 적인 기법을 설명합니다. 그것은 모든 연령대의 주제에 vivo에서 단백질 중재자, cytokines, 발산, 등의 레벨의 정량화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.

초록

이 프로토콜 설명 그대로 상부 기도 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링을 합니다. 그것은 또한 기도 국 소 면역 서명, 자극 절차 (종종 다른 기술에서 사용)에 대 한 필요 없이 연구에 대 한 유체 있다 면역 중재자의 분석 전에 사용 추출 절차를 자세히 설명 합니다. 점 막 내벽 액체 필터 종이의 스트립에 샘플링 비와 흡수의 2 분 왼쪽 열 등의 앞쪽 부분에 배치. Analytes는 eluted 필터 논문에서 그리고 추출 된 단백질 기반 있다 동일한 샘플에 낮은 및 높은 레벨 analytes의 높은 감도 정량화에 대 한 수는 electrochemiluminescence 기반 immunoassay에 의해 분석 된다. 상부 기도 점 막에 통로 신호 하는 특정 면역에 관련 된 20 미리 면역 중재자의 비보에 레벨 측정 하지만 기술은 그 특정 패널 또는 샘플링 사이트에 국한 되지 않습니다. 기술은 처음 알레르기 비 염으로 어린 시절₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) 일대에 7 세 어린이 천식에 코펜하겐 예비 연구에서 구현 되었습니다. 그것은 그 후 경도 COPSAC₂₀₁₀ 출생 코 호트, 1 달, 2 년, 그리고 나이의 6 년에와에서 급성 호흡기 증상의 경우에에서 사용 되었다. 우리는 성공적으로 얻은 및 700 1 개월 어린이의 620 (89%)에서 샘플을 분석; (중간값 (간 사분 위 수 범위 (IQR))로 보고 분석 결과 검출 한계 아래 몇 가지 샘플 했다 합니다. 각 중재자에 대 한 검출 한계 (즉, 0에서 탐지의 낮은 제한 세트 포인트를) 아래에 샘플의 번호 29 (7.25-119.5) 이었다. 이 기술은 수 에 비보 기도 점 막 면역 프로 파일의 출생에서 정량화, 경도, 적용 될 수 있다 그리고 유전학 및 초기 생활 환경 노출, 이상, endotyping, 및 호흡기 질환, 그리고 개발 및 새로운 치료제의 평가의 효과 대 한 연구에 적용할 수 있습니다.

서론

코의 점 막 내벽 액체 위 기도 시스템의 액체 부분을 게. 복잡 한 매트릭스 상피와 미생물 침입에 대 한 방어의 첫 번째 라인을 구성 하는 면역 세포 사이 상호 작용에서 파생 하는 중재자의 그것에 의하여 이루어져 있다. 비 강 점 막이 쉽게 접근할 수 있는, 그리고 코와 기관지¹사이의 강력한 기능과 면역 관계 있다. 이 구획은 어린 시절에, 인생에서 나중에 더 널리 다른 호흡기 질환의 범위 뿐만 아니라 천식과 알레르기 비 염 등 일반적인 기도 질병에 관하여 특별 한 관심의 이다.

여기, 우리는 샘플 그대로 점 막 비 강에서 액체를 안 감 후속 추출 절차 뿐 아니라 필터 종이, 비 침 투 적인 기법을 사용 하 여, 하는 데 사용 그들의 정량화 하기 전에 필터 논문에서 단백질 기반 analytes elute 메서드의 구현을 설명 합니다. 이 기술은 예를 들어 vivo에서 모두 건강 한 개인과 다양 한 호흡기 질환과 개인의 면역 시그니처를 사용할 수 있습니다. 또한, 특정 면역 서명에 대 한 중요성의 노출을 확인 하 고 예측 또는 중재자 나중 질병 개발의 경우 평가를 가능 하다.

점 막 내벽 액체 이전 코 게²는 종종 앞 코 도전 테스트는 알레르기 염증 반응을^3,4자극을 높은 수준에서 소개 된다에 의해 획득 되었습니다 했다. 그러나, 코 게 기술은 어린 아이에서 가능 하지 않습니다 하 고 수준 분석 결과⁵의 검출 한계 보다 낮을 수 있습니다 희석된 중재자로 서, 결과 혼동 한다 한 알 수 없는 희석 요소를 소개 합니다. 또한,이 알 수 없는 희석 요인 때문 코 도전 테스트에서 측정 된 실정이 응답 설정 일대에 코 게 기술의 유용성을 제한 함으로써 개인 간의 비교 되지 않습니다. 마지막으로, 알레르기 도전만 민감하게 과목에 적용 이며 히 스타 민 도전 등 기타 문제는 순수, 잠재적으로 중재자 릴리스에 천장 효과 일으키는. 이러한 문제는 어디 체액과 분석 수준을 개별 분 비 간 개별 분산에 영향을 주는 유일한 요소는 점 막 내벽 유체 컬렉션에 대 한 표시 필터 종이 기반 기술에서 피할.

추출 프로시저 동안 analytes는 eluted 필터 논문에서 버퍼의 동일한 볼륨의 추가 후 모든 샘플. 이 모든 샘플의 비슷한 비보 전 희석 하시 더군요. 알 부 민-기반 isotonic 소금 솔루션의 추출 버퍼 추출 단계;에 사용 그것은 단백질 기반 중재자의 추출 가능 하 게 하 고 단백질 제한 이후 동결 중 정량화 이전 eluted 단백질의 변성을 안정 시킨다. 추출 단계 단백질 저하를 방지 하려면 protease 억제제의 칵테일 추출 버퍼에 추가 됩니다.

그대로, vivo에서정량화를 허용 하는 기술의 구현-점 막 사이트에서 생성 된 면역 중재자는 최대 중요성 이다. 첫째, 점 막 사이트는 신체에서 가장 큰 면역 기관 최대 수 있습니다. 둘째, 코 위치 공중 노출의 주 사이트 이며¹폐 호흡기 면역 구획에 밀접 하 게 연결 된. 셋째, 비 침 투 적인 기법으로이 중요 한 장기를 측량의 가능성 건강과 질병 기도에 관하여 중요 한 미생물 면역 상호 작용 축에 과다 한 정보를 제공 하는 가능성을 엽니다. 넷째, 약물과 미 량 영양소의 무작위로 고르 곤, 통제 된 실험에서 로컬 면역학 변경 공부 등이 기술의 다른 많은 가능한 응용 프로그램 있다.

우리 처음 우리 7 세 어린이 건강 한 컨트롤¹³대 알레르기 비 염으로 점 막 내벽 액체의 면역 프로필을 결정 하는 어린 시절₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) 일대에에 코펜하겐 예비 연구에의 기술 구현. 그 후, 우리가 성공적으로 적용이 기술을 경도 COPSAC₂₀₁₀ 코 호트 및 평가 기도 면역 프로필에 1 달, 2 년, 그리고 나이의 6 년 및 급성 호흡기 증상의 인스턴스. 1 개월 된 신생아 결과 면역 서명 및 초기 생활 환경 노출^{7,8,9,10,,1112}사이 중요 한 연결을 설명 했다.

프로토콜

헬싱키의 선언의 원칙에 따라 연구 했다. 코펜하겐 (KF 01-289/96 COPSAC₂₀₀₀ )와 H B-2008-093 COPSAC₂₀₁₀및 덴마크어 데이터 보호 기관에 대 한 윤리 위원회에서 승인, 확인 하 고 등록 하기 전에 각 과목의 두 부모 로부터 서 면된 동의 얻어.

1. 실험 설치

1. 필터 종이 시트를 사용 하 여 (섬유 hydroxylated 폴리에스터 시트 참조 테이블의 재료)^6,7.
   1. 나이가 어린이 성인 (5 x 20 x 10 m m (L의 짧은 팔))에 대 한 스트립 3 x 15 m m 1 개월 된 아이 대 한 크기와 L-모양에 잘라.
2. 집게를 사용 하 여 유아의 각 콧구멍에 필터 종이의 한 조각을 삽입 합니다. 열 등 한 비 (신생아에 대 한 콧구멍 및 다른 모든 연령대에 1.5 cm 대략 1 cm)의 앞쪽 부분에 필터 종이 놓습니다.
   1. 신생아를 침대에 놓고 그들에 게 편안 함을 위해 설탕 물.
      참고: 다른 모든 연령대의 어린이 위한 샘플링 수행 됩니다 가장 쉽게의 자에 앉아 주제.
   2. 더 오래 된 아이 들에 대 한 각 콧구멍에 L 모양 필터 종이의 긴 팔을 삽입 합니다.
3. 불편을 최소화 하 고 필터 종이의 실수로 손실을 방지 하기 위해 콧구멍 주위 코 클립을 적용 합니다.
4. 흡수의 2 분 후 필터 종이 제거 합니다.
5. 레이블이 지정 된 튜브에 필터 종이 놓고-80 ° c.에 즉시 그들을 멈추게합니다
6. 샘플링의 날에는 아이 의해 표시 된 기도 감염의 증상의 기록을 합니다.
7. 어떤, 재채기, 지속적인 울고, 또는 샘플링의 2 분 동안 발생 하는 비 출혈을 기록 합니다.

2입니다. 기도 면역-중재자의 정량화

1. 냉동 실에서 10 무작위로 샘플을 가져가 라. Id 번호를 기록 합니다. 전체 작업 과정에서 얼음에 샘플을 유지.
2. 얼음에 녹고 후 담가 (주제) 당 필터 종이 양쪽 콧구멍에서 300 µ L 갓의 버퍼 ( 재료의 표참조) 포함 한 완전 한 protease 억제제 태블릿 ( 재료의 표참조) 버퍼의 25 mL 당.
   1. 필터 종이의 크기에 따라 버퍼의 볼륨을 조정 합니다.
      1. 버퍼의 300 µ L를 사용 하 여 필터 용지 크기에서 3 x 15 m m에 대 한.
      2. 하나의 필터 종이 사용할 수 있는 경우에 절반 버퍼 볼륨 (150 µ L)을 사용 합니다.
3. 타이머를 5 분 사용에 대 한 접시 통 (400 rpm)에 샘플을 전송.
4. 전송 촉촉한 필터 서류 및 분석 결과 버퍼는 microcentrifuge 배치는 셀 루 로스 아세테이트 튜브 필터 (0.22 μ m 기 공 크기)의 컵으로 튜브 ( 재료의 표참조).
5. 필터링 된 코 추출 튜브를 5 분 (4 ° C)에서 냉각된 원심 분리기에서 16000 x g에서 원심.
6. 컵을 제거 하 고 낮은 단백질 바인딩 스토리지 접시 ( 테이블의 자료를 참조)의 우물에 비 추출 물 aliquoting 동안 얼음에 튜브를 유지.
7. 분석까지-80 ° C에 저장 합니다.
8. Cytokines와 높은 감도, electrochemiluminesce 기반 다중화 어레이 시스템을 사용 하 여 비 강 추출 물에 발산의 농도 결정 ( 재료의 표참조).
   참고: 인간의 10-플렉스 T_H1/T_H2 cytokine 분석 결과, 9-플렉스 chemokine 분석 결과, 및 단일-플렉스 IL-17A, TGF-β1, 및 TSLP 수행 했다 여기.
   1. 분석, 대 한 코 추출 물 4 ° c.에 하룻밤을 품 어 ( 재료의 표참조) 프로토콜 표준 제조 업체 당으로 측정을 수행 합니다.
      참고:는 immunoassays 1 사이 배열 하는 측정에 대 한 높은 동적 범위는 일반적으로 ( 테이블의 자료를 참조) & 10000 pg/mL, 일부 분석에 대 한 100000 pg/mL 될 수 있습니다. 즉, 같은 희석, 따라서 건강 하 고 병에 걸린 주제에 서로 다른 희석의 영향을 제한 하는 다른 유사한 immunoassays에서 경우에서 모든 샘플을 실행할 수 있습니다. 모든 cytokines에 대 한 검색의 하한값 1 pg/mL 또는 1 사이 배열, 그리고 발산, & 50 pg/mL. TSLP 나이의 1 달에서 샘플의 98%에서 감지 되지 않았습니다.

3입니다. 통계

1. 로그 변환 cytokine 및 chemokine 레벨의 일반적으로 분산된 오차를 분석 하기 전에 데이터입니다.
2. 샘플 하나 이상의 일괄 처리에서 분석 되는 경우 batch-wise 로그 변환 데이터 중심으로 대 한 cytokine 및 chemokine 데이터를 수정 합니다.
   1. 전체 평균 및 안티 로그 변환 원래 측정 단위로 데이터를 통합 합니다.
      참고: 분석 완료의 모든 집합에 대 한 cytokines 및 발산의 수준에 영향을 주는 변수를 조절 보십시오. 이 샘플링, 형제, 가정, 등등 있는 애완 동물 중 모성 영향 (예를 들어, 알코올 소비와 흡연 임신 중), 모유 수 유, 불리 한 이벤트 수 있습니다.

결과

기도 면역 프로필의 기준선 특성:
COPSAC₂₀₁₀ 코호트에 등록된 700명의 소아 중 620명(89%)에서 생후 1개월의 상기도 점막 면역 매개체 수준에 대한 완전한 데이터를 얻었다. 이 기법이 확립되기 전에 10명의 신생아가 등록했고, 19명은 1개월간의 방문에 참석하지 않았다. 또한 파일럿 연구에 사용된 다른 실험실에서 추출 및 측정되었기 때문에 47개의 샘플이 제외되었으며 4개의 샘플은 운송 중에 손실되었습니다(연구 흐름도 그림 1 참조). 코호트의 기준선 특성은 표 1에 나와 있습니다.

대부분의 매개체는 검출 수준이 낮았으며<10pg/mL(IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p7...

토론

여기에 제시 된 기술로, vivo에서 위 기도 점 막 면역 프로필 1 개월 이전 완료 하지 않은 나이 일찍부터 어린이 확인할 수 있었습니다. 우리는 신생아의 기도 면역 프로필에 특정 기도 박테리아의 그 존재와 感^7,11, 뿐 아니라 다른 전과 perinatal 노출, 미러 했다 관찰 했다. 또한, 우리는 높은 복용량 비타민 d의 무작위 미 량 재판의 행동의 메커니즘을 연구를 이러한 기도 면역 프로필 데이터 사용 이러한 결과 유효성과 기도 면역 중재자의 후속 vivo에서 정량화에 대 한 비 침 투 적인 샘플링 기법으로 점 막 내벽 유체 기술의 유틸리티를 밑줄.

다음 방법 구현 하기 전에 고려 가치가 있다: 점 막 내벽 액체 매트릭스에서 cytokines를 측정 하기 위해 electrochemiluminescence 프로토콜에 의해 제공 하는 등 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
섬유질 하이드록실화 폴리에스터 시트	Accuwik Ultra	SPR0730	여과지
Milliplex 분석 버퍼	Millipore	L-AB	버퍼
저단백질 결합 보관 플레이트	Thermo Scientific	CLS8161	플레이트
프로테아제 억제제	Roche	11873580001	완전한 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일
리더 멀티-스폿 플레이트	Mesoscale	NA	섹터 이미저 6000
어세이	중규모		인간 10-plex TH1/TH2 사이토카인 분석 및 9-플렉스 케모카인 분석 및 싱글플렉스 IL-17A, TGF-&베타; 1및 TSLP. 설명은 www.mesoscale.com 에서 온라인으로 찾을 수 있습니다.