상부 기도 면역 중재자 수준 Vivo에서 의 정량화에 대 한 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링

요약

이 프로토콜에서는 위 항공에서 그대로 점 막 안 대기의 샘플링에 대 한 비 침 투 적인 기법을 설명합니다. 그것은 모든 연령대의 주제에 vivo에서 단백질 중재자, cytokines, 발산, 등의 레벨의 정량화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.

초록

이 프로토콜 설명 그대로 상부 기도 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링을 합니다. 그것은 또한 기도 국 소 면역 서명, 자극 절차 (종종 다른 기술에서 사용)에 대 한 필요 없이 연구에 대 한 유체 있다 면역 중재자의 분석 전에 사용 추출 절차를 자세히 설명 합니다. 점 막 내벽 액체 필터 종이의 스트립에 샘플링 비와 흡수의 2 분 왼쪽 열 등의 앞쪽 부분에 배치. Analytes는 eluted 필터 논문에서 그리고 추출 된 단백질 기반 있다 동일한 샘플에 낮은 및 높은 레벨 analytes의 높은 감도 정량화에 대 한 수는 electrochemiluminescence 기반 immunoassay에 의해 분석 된다. 상부 기도 점 막에 통로 신호 하는 특정 면역에 관련 된 20 미리 면역 중재자의 비보에 레벨 측정 하지만 기술은 그 특정 패널 또는 샘플링 사이트에 국한 되지 않습니다. 기술은 처음 알레르기 비 염으로 어린 시절₂₀₀₀ (COPSAC₂₀₀₀) 일대에 7 세 어린이 천식에 코펜하겐 예비 연구에서 구현 되었습니다. 그것은 그 후 경도 COPSAC₂₀₁₀ 출생 코 호트, 1 달, 2 년, 그리고 나이의 6 년에와에서 급성 호흡기 증상의 경우에에서 사용 되었다. 우리는 성공적으로 얻은 및 700 1 개월 어린이의 620 (89%)에서 샘플을 분석; (중간값 (간 사분 위 수 범위 (IQR))로 보고 분석 결과 검출 한계 아래 몇 가지 샘플 했다 합니다. 각 중재자에 대 한 검출 한계 (즉, 0에서 탐지의 낮은 제한 세트 포인트를) 아래에 샘플의 번호 29 (7.25-119.5) 이었다. 이 기술은 수 에 비보 기도 점 막 면역 프로 파일의 출생에서 정량화, 경도, 적용 될 수 있다 그리고 유전학 및 초기 생활 환경 노출, 이상, endotyping, 및 호흡기 질환, 그리고 개발 및 새로운 치료제의 평가의 효과 대 한 연구에 적용할 수 있습니다.

서론

코의 점 막 내벽 액체 위 기도 시스템의 액체 부분을 게. 복잡 한 매트릭스 상피와 미생물 침입에 대 한 방어의 첫 번째 라인을 구성 하는 면역 세포 사이 상호 작용에서 파생 하는 중재자의 그것에 의하여 이루어져 있다. 비 강 점 막이 쉽게 접근할 수 있는, 그리고 코와 기관지¹사이의 강력한 기능과 면역 관계 있다. 이 구획은 어린 시절에, 인생에서 나중에 더 널리 다른 호흡기 질환의 범위 뿐만 아니라 천식과 알레르기 비 염 등 일반적인 기도 질병에 관하여 특별 한 관심의 이다.

여기, 우리는 샘플 그대로 점 막 비 강에서 액체를 안 감 후속 추출 절차 뿐 아니라 필터 종이, 비 침 투 적인 기법을 사용 하 여, 하는 데 사용 그들의 정량화 하기 전에 필터 논문에서 단백질 기반 analytes elute 메서드의 구현을 설명 합니다. 이 기술은 예를 들어 vivo에서 모두 건강 한 개인과 다양 한 호흡기 질환과 개인의 면역 시그니처를 사용할 수 있습니다. 또한, 특정 면역 서명에 대 한 중요성의 노출을 확인 하 고 예측 또는 중재자 나중 질병 개발의 경우 평가를 가능 하다.

점 막 내벽 액체 이전 코 게^....

프로토콜

헬싱키의 선언의 원칙에 따라 연구 했다. 코펜하겐 (KF 01-289/96 COPSAC₂₀₀₀ )와 H B-2008-093 COPSAC₂₀₁₀및 덴마크어 데이터 보호 기관에 대 한 윤리 위원회에서 승인, 확인 하 고 등록 하기 전에 각 과목의 두 부모 로부터 서 면된 동의 얻어.

1. 실험 설치

1. 필터 종이 시트를 사용 하 여 (섬유 hydroxylated 폴리에스터 시트 참조 테이블의 재료)^6,7.
   1. 나이가 어린이 성인 (5 x 20 x 10 m m (L의 짧은 팔))에 대 한 스트립 3 x 15 m m 1 개월 된 아이 대 한 크기와 L-모양에 잘라.
2. 집게를 사용 하 여 유아의 각 콧구멍에 필터 종이의 한 조각을 삽입 합니다. 열 등 한 비 (신생아에 대 한 콧구멍 및 다른 모든 연령대에 1.5 cm 대략 1 cm)의 앞쪽 부분에 필터 종이 놓습니다.
   1. 신생아를 침대에 놓고 그들에 게 편안 함을 위해 설탕 물.
      참고: 다른 모든 연령대의 어린이 위한 샘플링 수행 됩니다 가장 쉽게의 자에 앉아 주제.

결과

기도 면역 프로필의 기준선 특성:
COPSAC₂₀₁₀ 코호트에 등록된 700명의 소아 중 620명(89%)에서 생후 1개월의 상기도 점막 면역 매개체 수준에 대한 완전한 데이터를 얻었다. 이 기법이 확립되기 전에 10명의 신생아가 등록했고, 19명은 1개월간의 방문에 참석하지 않았다. 또한 파일럿 연구에 사용된 다른 실험실에서 추출 및 측정되었기 때문에 47개의 샘플이 제외되었으며 4개의 샘플은 운송 중에 손실되었습니다(연구 흐름도 그림 1 참조). 코호트의 기준선 특성은 표 1에 나와 있습니다.

대부분의 매개체는 검출 수준이 낮았으며<10pg/mL(IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12p7.......

토론

여기에 제시 된 기술로, vivo에서 위 기도 점 막 면역 프로필 1 개월 이전 완료 하지 않은 나이 일찍부터 어린이 확인할 수 있었습니다. 우리는 신생아의 기도 면역 프로필에 특정 기도 박테리아의 그 존재와 感^7,11, 뿐 아니라 다른 전과 perinatal 노출, 미러 했다 관찰 했다. 또한, 우리는 높은 복용량 비타민 d의 무작위 미 량 재판의 행동의 메커니즘을 연구를 이러한 기도 면역 프로필 데이터 사용 이러한 결과 유효성과 기도 면역 중재자의 후속 vivo에서 정량화에 대 한 비 침 투 적인 샘플링 기법으로 점 막 내벽 유체 기술의 유틸리티를 밑줄.

다음 방법 구현 하기 전에 고려 가치가 있다: 점 막 내벽 액체 매트릭스에서 cytokines를 측정 하기 위해 electrochemiluminescence 프로토콜에 의해 제공 하는 등 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
섬유질 하이드록실화 폴리에스터 시트	Accuwik Ultra	SPR0730	여과지
Milliplex 분석 버퍼	Millipore	L-AB	버퍼
저단백질 결합 보관 플레이트	Thermo Scientific	CLS8161	플레이트
프로테아제 억제제	Roche	11873580001	완전한 EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일
리더 멀티-스폿 플레이트	Mesoscale	NA	섹터 이미저 6000
어세이	중규모		인간 10-plex TH1/TH2 사이토카인 분석 및 9-플렉스 케모카인 분석 및 싱글플렉스 IL-17A, TGF-&베타; 1및 TSLP. 설명은 www.mesoscale.com 에서 온라인으로 찾을 수 있습니다.