우리는 광 반응성 블록 공중 합체를 사용하는 새로운 방법을 제시한다.이 방법은 검출 불가능한 오프 - 타겟 효과없이 유전자 침묵을보다 효율적으로 공간적으로 제어 할 수있다. 또한 유전자 발현의 변화는 간단한 siRNA 방출 분석 및 간단한 운동 모델링을 사용하여 예측할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
새로운 물질 및 방법은 유전자 활동의 정확한 조절을 필요로하는 광범위한 적용을위한 핵산의 결합 대 방출을보다 잘 제어하기 위해 필요합니다. 특히, 유전자 발현에 대한 시공간적 제어가 개선 된 새로운 자극 - 반응 물질은 약물 발견 및 재생 의학 기술에서 번역 가능한 플랫폼의 잠금을 해제합니다. 또한, 물질로부터의 핵산 방출을 제어하는 능력이 향상되면 나노 캐리어 효능 을 선험적 으로 예측할 수있는 능률적 인 방법의 개발이 가능 해져 배달 차량의 신속한 스크리닝이 가능해진다. 여기, 우리는 유전자 침묵 효율을 예측하고 모듈 식 광 반응성 나노 캐리어 시스템을 통해 유전자 발현에 대한 시공간 제어를 달성하기위한 프로토콜을 제시한다. 작은 간섭 RNA (siRNA)는 mPEG- b -poly (5- (3- (아미노) 프로 폭시) -2- 니트로 벤질 메타 크릴 레이트) (mPEG- β -P (APNBMA)빛으로 조절되어 조정 가능한 ON / OFF siRNA 방출을 촉진 할 수있는 안정한 나노 캐리어입니다. 우리는 세포 내 환경을 모방 솔루션에서 siRNA 릴리스의 정확한 부량을위한 형광 상관 분광법과 겔 전기 영동을 사용하는 두 보완 assays을 설명합니다. 이 분석에서 얻은 정보는 다양한 광 자극 조건에 대한 동적 침묵 반응을 예측하기위한 간단한 RNA 간섭 (RNAi) 동역학 모델에 통합되었습니다. 이어서, 이러한 최적화 된 조사 조건은 시공간적으로 유전자 침묵을 제어하기위한 새로운 프로토콜의 개선을 가능하게했다. 이 방법은 cell-to-cell 분해능과 off-target 효과가없는 유전자 발현의 세포 패턴을 생성 할 수 있습니다. 종합하면, 우리의 접근 방식은 유전자 발현의 역동적 인 변화를 예측하고 시공간적으로 siRNA 활동을 정밀하게 제어 할 수있는 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다. 이 assays 세트는 다양한 ot를 테스트하기 위해 쉽게 적용 할 수 있습니다그녀의 자극 반응 시스템은 생물 의학 연구 및 의학 분야의 수많은 어플리케이션과 관련된 핵심 과제를 해결합니다.
서론
small interfering RNAs (siRNAs)는 사실상 모든 표적 유전자 1에 대해 매우 특이적이고 강력하며 맞춤형 인 촉매 RNAi 경로를 통해 전사 후 유전자 사일런 싱을 매개한다. 이러한 유망한 특성으로 인해 전이성 흑색 종 및 혈우병을 비롯한 수많은 질병의 치료를위한 인간 임상 시험에서 siRNA 치료제가 발전 할 수있었습니다 2 , 3 . 그러나 번역을 방해하는 중요한 배달 문제가 계속 발생합니다 4 . 특히, 운반체는 안정을 유지해야하며 세포 외 분해로부터 siRNA를 보호해야하며, 또한 세포질에 유핵 적재 물을 방출해야합니다 5 . 또한, 많은 RNAi 응용 프로그램은 siRNA 치료법 7 에서 부작용을 줄이고 변형 가능하게하는 공간 및 시간 6 에서 유전자 침묵을 조절하는 향상된 방법을 필요로합니다.약 발견 8 을위한 세포 microarrays에서 재생성 비계 9 에....
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프로토콜
1. siRNA 나노 캐리어의 제형
- pH 6.0에서 20mM 4- (2- 하이드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 설 폰산 (HEPES) 버퍼로 희석 된 동일한 부피의 siRNA 및 mPEG- b -P (APNBMA)의 개별 용액을 준비한다.
- 20 MM HEPES 솔루션에 32 μg / ML의 농도 siRNA를 추가합니다.
참고 : siRNA는 비 표적화 된 보편적 음성 대조군 시퀀스였다. 그러나, siRNA는 관심있는 모든 유전자를 표적으로하도록 설계 될 수 있습니다. - 20 mM HEPES 용액에 mPEG- b -P (APNBMA) 중합체를 용해시킨다. N / P 비 (N, mPEG- b -P (APNBMA)의 아민 기, P, siRNA상의 인산기)가되도록 220 μg / mL 용액을 만들기 위해 적절한 양의 mPEG- b -P (APNBMA) 4입니다.
참고 : mPEG- b -P (APNBMA) 고분자의 합성 프로토콜은 다른 곳에서보고됩니다 30 .
- 20 MM HEPES 솔루션에 32 μg / ML의 농도 siRNA를 추가합니다.
- mPEG- b -P (APNBMA) 용액을 같은 부피e....
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결과
나노 캐리어의 제제화 후 siRNA 방출 분석을 수행하여 시험 관내 형질 감염 에 사용되는 조사 조건을 알려 주었다. 방출 된 siRNA의 백분율을 결정하기 위해 다양한 양의 빛을 가했다. 첫 번째 분석은 여전히 폴리머와 복합체 / 결합 된 siRNA 분자에서 유리 siRNA 분자를 분리하기 위해 겔 전기 영동을 사용했습니다. 빛으로 치료되지 않은 나노 캐리어는 안정한 상태를 유지하고 siRNA를 방출하지 않았습니다. 조사 시간이 길어짐에 따라 free siRNA band의 형광 강도가 증가 하였다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 밴드 강도를 정량화 한 결과 20 분간의 노출 후에 siRNA의 15 %가 유리 되었음이 입증되었습니다.
두 번째 siRNA 방출 분석은 sol에서 자유롭게 확산되는 siRNA 분자의 퍼센트를 .......
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토론
이 방법에는 몇 가지 단계가 특히 중요합니다. nanocarriers을 수립 할 때, 구성 요소 추가 및 혼합 속도의 순서는 효능 (39)에 영향을 미치는 두 가지 중요한 매개 변수입니다. 이 프로토콜은 vortexing하는 동안 음이온 성 구성 요소 인 siRNA에 양이온 성 구성 요소 인 mPEG- b -P (APNBMA)가 첨가되도록 요구합니다. 총 배합량에 따라이 혼합 공정은 3-6 초가 소요됩니다. 나노 캐리어가 제대로 형성되었는지 테스트하려면 동적 광산란과 같은 기술을 사용하여 크기 분포를 측정합니다. N / P 비가 4 인 mPEG- b -P (APNBMA) / siRNA 나노 캐리어는 ~ 140 nm의 평균 직경과 ~ 0.2 28의 다분 산성을가집니다. 또한, N / P 비는 다양한 크기 / 안정성을 갖는 폴리 플렉스를 얻기 위해 변화 될 수있다. 이 연구에서 N / P 비는 4로 선택되었는데, .......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자들은 보조금 번호 P20GM103541 및 부여 번호 P20GM10344615로 기관 개발 상 (IDeA)을 통한 재정 지원을 위해 국립 보건원 (NIH)의 국립 종합 의학 연구소에 감사를드립니다. 여기에있는 진술은 NIH의 견해를 반영하지 않습니다. 우리는 또한 첨단 기술 생명 과학 센터 (Bioscience CAT) 상 (12A00448)을 통해 재정 지원을 위해 델라웨어 생명 공학 연구소 (DBI)와 델라웨어 경제 개발 사무소 (DEDO)를 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | 비표적, 보편적인 음성 대조군 |
| mPEG-b-P(APNBMA) | N/A | 광반응성 폴리머 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| 소듐 도데실 설페이트 | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| 고무 가스켓 | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL 두께 |
| UV 레이저 | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | 시준 렌즈 및 365nm 필터는 |
| 아가로스 | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| 에티듐 브로마이드 | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA를 | . | 맞춤형 주문 | 형광체는 5' 감지 끝 스트랜드 |
| 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 12-550-A3 | 사전 청소된 유리 |
| Secure-Seal 스페이서 | Life Technologies | S24735 | 양면 접착제 |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | 컨포칼 현미경 |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS 분석 소프트웨어 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | 프로그래밍 언어 |
| NIH/3T3 셀 | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | 성장 매체 |
| 태아 소 혈청 | Mediatech | 35-011-CV | 열 비활성화 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6웰 플레이트 | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | 트랜스펙션 배지 |
참고문헌
- Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (20....
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재인쇄 및 허가
