Whitefly에서 Endosymbionts의 추출을위한 방법 베미 시아 타바시

요약

여기, 우리는 해부 및 여과를 통해 흰 반점 Bemisia tabaci 에서 endosymbionts를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 증폭 후, DNA 샘플은 endosymbionts와 whitefly 사이의 mutualism의 후속 시퀀싱 및 연구에 적합합니다.

초록

박테리아 공동체는 그들의 숙주와 친밀한 관계를 형성하고 대부분의 경우 숙주에게 이점을줍니다. 유전체 정보는 숙주에서 세균 공생체의 기능과 진화를 연구하는 데 중요합니다. 대부분의 공생 균 은 시험 관내 에서 배양 될 수 없으므로, 게놈 시퀀싱을위한 박테리아의 적절한 양을 분리하는 방법은 매우 중요합니다. 흰 반점 Bemisia tabaci 에서 여러 가지 내인성이 확인되었고 여러 가지 접근법을 통해 해충의 발생과 번식에 중요 할 것으로 예측됩니다. 그러나 협회를 뒷받침하는 메커니즘은 아직 많이 알려져 있지 않습니다. 장애물은 부분적으로 세균 증식 억제 물질 인 흰가루병에있는 내막 곰팡이가 숙주 세포에서 분리되기 어렵다는 사실에서 기인합니다. 여기에서 우리는 주로 해면체 B. tabaci 에서 endosymbionts의 동정, 추출 및 정제를위한 단계별 프로토콜을보고한다 .켜고 여과하십시오. 다른 endosymbiont 종의 혼합물이긴하지만,이 방법에 의해 준비된 endosymbiont 샘플은 B. tabaci 에서 endosymbionts의 가능한 역할의 후속 게놈 시퀀싱 및 분석에 적합합니다. 이 방법은 다른 곤충에서 내재물을 분리하는 데 사용될 수도 있습니다.

서론

상대적 숙주와 친밀한 공생 관계를 형성하는 박테리아는 절지 동물에서 널리 퍼져있다 ¹ . endosymbionts는 거의 모든 발달 단계 ⁵ 에서 영양 대사, 번식, 환경 스트레스에 대한 반응 ^{2 , 3 , 4} 등과 같은 숙주의 양상에 영향을 미치는 것으로 입증되었습니다. 그러나 협회를 뒷받침하는 메커니즘은 아직 많이 알려져 있지 않습니다. 유전체학은 박테리아의 잠재적 인 기능과 역할을 연구 할 때 우선 순위이며 중요합니다. 분류 학적 상태, 기능 유전자, 대사 경로, 분비 시스템과 같은 몇 가지 기본 정보는 공생에서 공생 공생체의 잠재적 역할에 대한 조명을 밝히는 게놈 서열로부터 추론 할 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱의 개발로 방대한 세균 게놈이 시퀀싱되었습니다여러 가지 기능이 밝혀졌다.

내배체는 진딧물 ⁷ , 벌레 ⁸ , 유문 ⁹ , 갈색 planthoppers ¹⁰ 및 매미 ¹¹ 과 같은 반월에서 매우 중요합니다. 예를 들어, 진딧물의 Buchnera 는 필수적인 공생체 로서 진딧물 유전체 ¹² 의 유전자와 함께 필수 아미노산 생합성에 관여하는 것으로 입증되었습니다. 또한 Buchnera의 전사 조절 또한 밝혀졌다. psyllids에서는 Carsonella 가 서열화되어 가장 작은 박테리아 게놈을 ¹⁴ 번 발견했습니다. endosymbionts의 이러한 모든 특징은 게놈 서열을 기반으로하고 유추됩니다. 이러한 endosymbionts가 시험 관내 에서 배양 될 수 없기 때문에, seq에 적합한 박테리아를 분리하기 위해 여러 가지 접근법이 적용되었습니다어젠 싱. 진딧물에서, endosymbionts는 원심 분리 및 여과를 통해 추출하고 추가 게놈 및 transcriptomic 분석 ^{5에 적용} 됩니다. 갈색 딱정벌레에서는 곤충 게놈 전체와 함께 내분비물이 서열화됩니다 ¹⁰ .

Whitefly B. tabaci 는 35 종 이상의 형태 학적으로 구분할 수없는 종 (비밀 종)을 포함하고있는 종 복합체이며, 그 중 2 종의 침입 종이 전 세계에 침입하여 농산물에 막대한 피해를 입혔습니다 ¹⁵ . 주목할 점은 B. tabaci 종의 내분비는 해충의 발생에 중요성을 보여 주었다. 현재까지, 8 종의 endosymbiont가 흰 반딧불에서 확인되었다. 그 중 하나는 obligent symbiont, Candidatus Portiera aleyrodidarum, 7 명의 보조 공생 자인 Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium ,em> Wolbachia, Fritschea 및 Hemipteriphilus 는 ^{17 , 18을} 정의했다.

이전에 기술 된 반 형제와 달리 흰 반점 B. tabaci 는 길이가 1mm에 불과한 매우 작은 벌레입니다. 대부분의 endosymbionts는 bacteriocytes ¹⁹ ( B. tabaci 에서 세균을 더 형성하는 symbionts를 포함하는 특수 세포)에 국한되어 있습니다. 또한, 이러한 내재화는 시험 관내에서 배양 할 수 없다. B. tabaci 에서 endosymbionts를 얻는 유일한 방법은 박테리아를 해부하는 것입니다. 그러나 해부학에 어려움이 있습니다. 첫째, 깨지기 쉬운 세균은 흰 반점의 다른 조직과 항상 연결되어 분리되기 어렵습니다. 두 번째로, 흰 반점의 작은 크기는 충분한 박테리아의 고립을 제한합니다. 세 번째로, 세균 내에서 내재물 (endosymbion)이 번식하여 한 종의 세균을 얻기가 매우 복잡합니다.

프로토콜

1. Whitefly 양육과 비밀 종 식별

1. 27 ± 1 ° C, 습도 70 ± 10 %, 빛 14 시간 : 어두운 곳에서 10 시간 동안 표준 조건에서 우리 속의 Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973)에 흰 반점 종을 유지한다.
2. 개별 성인 흰 반점을 수집하고 30 μl의 용해 버퍼 (10 MM 트리스, pH 8.4, 50 MM KCl, 0.45 % [wt / vol] Tween - 20, 0.2 % [wt / vol] 젤라틴, 0.45 % [vol / vol] Nonidet P 40, 60 g / mL 프로테이나 제 K).
3. 65 ° C에서 1 시간 동안 그리고 100 ° C에서 10 분 동안 균질 물을 품어 낸다.
   참고 : 필요할 경우 65 ° C에서 배양 시간을 늘릴 수 있습니다. 100 ℃에서의 배양 시간은 Proteinase K를 충분히 비활성화시키고 DNA 손상을 피하기 위해 비판적으로 조절되어야합니다.
4. 미토콘드리아 시토크롬 옥시 다제 I 프라이머를 기반으로 한 whitefly DNA (1.3 절에서 획득)를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하십시오.
   COI-F : 5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 '
   COI-R : 5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 '
   1. 1 U의 Taq DNA 중합 효소, 2.5 μL 10X 버퍼, 0.2 MM dNTP, 각 프라이머의 0.2 MM 및 whitefly DNA의 2 μL를 포함하는 25 μL의 최종 볼륨에서 PCR 반응을 수행하십시오.
   2. 다음의 PCR 절차 조건을 사용하십시오 : 95 ℃에서 3 분간 변성 후 95 ℃에서 45 초 (변성), 50 ℃에서 45 초 (어닐링) 및 72 ℃에서 1 분간 (연장) 35 사이클 추가 확장을 위해 72 ℃에서 10 분.
5. 권장 된 프로토콜로 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 PCR 증폭 제품을 청소하십시오.
6. DNA 샘플 시퀀싱 시스템으로 제조사의 지시에 따라 정제 된 DNA 샘플을 시퀀싱합니다.
7. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 시퀀스를 분석하여 가자미 종의 식별 및 다른 특정 종의 오염 방지es.

2. 내분 해 식별 및 지역화

1. 흰 둥지 내의 각 endosymbiont의 특정 유전자를 증폭하기 위해 whitefly DNA (1.3 단계에서 얻음)에서 PCR을 수행하십시오 (PCR 처방은 1.4 절에 설명되어 있으며 PCR 절차와 프라이머는 표 1 에 나와 있습니다).
2. 이전에 발표 된 프로토콜 ²⁰ (1 % 아가로 오스 겔, 실행 버퍼로 트리스 - 아세테이트 - EDTA, 전압 5V / cm)에 따라 증폭 된 샘플을 아가로 오스 겔 전기 영동으로하여 각 세균의 특정 유전자를 확인하십시오.
3. 흰 반점 내에서 박테리아 종을 결정하기 위해 각 밴드를 복구하고 순서를 정하십시오 (1.5-1.7 절 참조).
4. 이전에 발표 된 프로토콜 ¹⁹ 에 따라 endosymbionts의 위치를 ​​식별하기 위해 whiteflies에 형광 in situ hybridizations (FISH)를 수행하십시오.
   참고 : 필요한 경우 형광 탐침의 농도를 높이십시오.

3. 투과 전자 현미경 (Transmission Electron Microscopy, TEM)

1. 2.5 % [vol / vol] 글루 타르 알데히드를 함유 한 인산염 완충액 (0.1 M, pH 7.0)에서 흰 반점을 4 시간 동안 담그고 고정시킨다.
2. 인산염 완충액 (0.1 M, pH 7.0)에서 시료를 3 회, 매회 15 분 동안 씻으십시오.
3. 1 % [wt / vol] OsO ₄ 를 함유 한 인산염 완충액 (0.1 M, pH 7.0)에 시료를 2 시간 동안 담근다.
4. 매번 15 분씩 일련의 에탄올 (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 및 100 %)로 샘플을 탈수하십시오.
5. 샘플을 100 % 아세톤에 20 분 동안 담그고 담그십시오.
6. 실온에서 1 시간 동안 100 % 아세톤과 100 % Spurr 수지 (1 : 1)의 혼합물에 샘플을 놓습니다.
7. 실온에서 3 시간 동안 100 % 아세톤 및 100 % 스퍼 르 수지 (1 : 3)의 혼합물에 샘플을 옮긴다.
8. 전달하고 샘플을 100 % Spurr 수지 (70 ° C에서 잠복)에 9 시간 이상 담그십시오.
9. 마이크로를 사용하여 흰 반점 샘플 섹션나에게.
10. 5 분에서 10 분 동안 절대 우라 닐 아세테이트에 담금으로써 초박막 (섹션 3.9에서 획득)에 얼룩을지게하고, 5 ~ 10 분 동안 50 % 알칼리성 납 시트 레이트에 담그십시오.
    참고 : 섹션 3.1-3.10에서 사용 된 시약의 부피는 샘플에 따라 다릅니다. 샘플이 시약에 담겨 있는지 확인하십시오.
11. 투과 전자 현미경 (15,000X)에서 샘플을 관찰하여 추가로 사용할 박테리아의 위치, 모양 및 크기를 결정합니다 (4.6 절 참조).

4. 흰 파리 박테리아의 해부 및 정제

1. 현미경 슬라이드에 1x PBS 용액 100 μL를 추가합니다. 면화 잎에서 3, 4 ^th instar nymph를 골라 PBS 용액에 담그십시오.
2. 실체 현미경으로 미세 곤충 바늘을 사용하고 흰 반점 몸체에서 세균들을 꺼내십시오.
   1. 요정의 한쪽에있는 구멍을 부드럽게 자르고, 다른 쪽을 살짝 누릅니다.bacteriomes를 내보내는 쪽.
3. 0.5-10 μL 피펫으로 20 μL 마이크로 로더를 장착하십시오 (박테리아의 크기에 맞게 끝 부분을 자릅니다). PBS 용액에서 개별 세균을 추출하여 마이크로 로더에 넣습니다.
4. bacteriome을 PBS 용액에 pipetting하고 박테리아를 추출하여 다른 흰 반점 조직의 오염을 제거하십시오. 3 번 반복하십시오.
5. 즉시 1x PBS 용액 60 μL가 들어있는 원심 튜브에 세균을 세척합니다.
6. 5 μm 필터 멤브레인을 통해 조립 된 박테리아를 주사기로 걸러냅니다 (박테리아의 크기와 흰 반점이있는 박테리아 세포의 핵으로 결정됨). 혼합 된 액체를 필터 멤브레인으로 완전히 이동 시키려면 여러 번 반복하십시오.
   참고 : 더 나은 증폭 및 시퀀싱 결과를 얻으려면 100 개가 넘는 박테리아를 조립하십시오. 박테리아의 손실을 줄이기 위해 1x PBS 용액을 사용하여 필터 멤브레인을 먼저 적시십시오.막에 결합.

5. Endosymbiont 게놈의 증폭

1. 일부 수정과 함께 권장 프로토콜에 의해 DNA 증폭 키트를 사용하여 여액 (주로 흰 반점의 endosymbionts을 포함)을 증폭.
   1. 혈액 또는 세포에서 게놈 DNA의 증폭 프로토콜을 선택하고 이후 실험을 위해 버퍼 D2를 준비하십시오.
   2. 원심 분리 튜브에 여과 액 1.5 μL (4.6 절 참조)을 직접 넣은 다음 1.5 μL의 Buffer D2를 넣고 잘 섞는다.
   3. 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션하고 1.5 ㎕의 정지 용액을 첨가한다.
   4. 반응 완충액 15 μL와 DNA 중합 효소 1 μL를 첨가하고 부드럽게 섞는다.
   5. 혼합물을 30 ° C에서 16 시간 동안 배양하고, 65 ° C에서 3 분간 교반한다.
2. 박테리아를 위해 고안된 특정 프라이머를 사용하여 증폭 된 여과 액에서 PCR을 직접 수행하십시오 (필요한 경우 증폭 된 시료를 희석하십시오).박테리아 종을 확인하기 위해 테리아 (2.1 절 참조).
3. 이전에 발표 된 방법 ²¹ (PCR 처방은 1.4 절에서 설명 됨)에 따라 whitefly 유전자 베타 - 액틴 및 EF1 프라이머를 사용하여 숙주 게놈의 오염 여부를 확인하기 위해 PCR을 실시하십시오.

6. Endosymbiont Metagenome 시퀀싱

1. 샘플의 품질을 테스트하고 시퀀싱을위한 기준을 충족하는지 여부를 확인하기 위해 시퀀싱 전에 증폭 된 여액을 분광 광도계 및 형광 측정기 (제조사의 지침에 따라)에 부탁하십시오.
2. 제작사의 지시에 따라 게놈 시퀀서에 증폭시킨다.

결과

B. tabaci 단지의 중동 아시아 소아 1 (MEAM1) 종은 여기서 설명을 위해 예로 취했다. 흰가루병을 키우기위한 면화와 흰가루병의 여러 발달 단계가 면화 식물, 성충과 흰빛 반딧불이의 1 ^, 2, 4 ^번 족장 약충을 포함하여 그림 1에 나와 있습니다 (3 ^번 황충은 4 ^번 황후 요정과 유사하게 보입니다. ). 4 ^th instar 님프가 1 ^번째 및 2 ^번째 instar nymphs보다 더 컸음이 분명했습니다 ( 그림 1 ). MEAM1 내의 Portiera 와 Hamiltonella 의 FISH 분석은 그림 2

토론

가루이 내의 내공생체는 시험관 내에서 배양할 수 없기 때문에 세균세포를 해부하고 조립하는 것이 내공생체의 유전 물질을 충분히 얻는 효과적인 방법입니다. 해부하기 전에 관련된 가루이와 내공생체의 종을 명시적으로 확인해야 합니다. 가루이 B. tabaci는 형태학적으로 구별할 수 없는 35종 이상의 종 복합체이며 서로 다른 비밀스러운 종에는 서로 다른 내공생체가 포함될 수 있습니다. Portiera는 절대적 공생체로 균일하게 품고 있으며²², 2차 공생체는 종에 따라 다르며, 심지어 개별 가루이도^{다릅니다 17,21,23}. 또한, 많은 내공생체가 세균세포 내에 억제되는 것으로 입증되었지만, 일부는 가루이의 몸 전체에 분포할 수 있다²⁴....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Taq DNA 중합효소	Takara	R001A	포함 rTaq, 10× 버퍼 및 dNTP
젤 DNA 추출 키트	Qiagen	28704
DNA 샘플 시퀀싱 시스템	ABI	ABI-3730XL
Microtome	Leica	EM UC7
투과 전자 현미경	Hitachi	H-7650 TEM
스테레오 현미경	Zeiss	Stemi 2000-C
20 μ L 마이크로로더	Eppendorf	F2771951
필터 홀더	Millipore	SX0001300
필터 멤브레인 필터	Millipore	SMWP001300	5.0 μ m SMWP
REPLI-g 초고속 미니 키트	Qiagen	150033	DNA amlification kit
NanoDrop	Thermo Scientific	NanoDrop 2000
큐비트 형광측정기	Thermo Fisher Scientific	Q33216
게놈 시퀀서	Illumina	Hiseq 2000