E. 콜라이 O157:H7의 Foodborne 병원 체 검사를 사용 하 여 자기 형광 Nanosensor: 신속한 감지

Summary

이 프로토콜의 전반적인 목표는 비용 효율적인, 노트북에 대 한 기능 nanosensors을 합성 하 고의 급속 한 탐지는 자석 및 형광 방출 modalities의 결합을 통해 병원 성 박테리아에 특히 표적으로.

Abstract

둘 다 waterborne Enterohemorrhagic 대장균 O157:H7 연결 되었습니다 foodborne 병, 및 음식 및 물 심사 방법에도 불구 하 고 위협 사용 현재 남아 있다. 일반 세균 검출 방법, 동안과 같은 연쇄 반응 (PCR) 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA) 특히 병원 성 오염 물질을 감지할 수 있습니다 그들은 필요 광범위 한 샘플 준비 및 긴 대기 기간. 또한, 이러한 관행 정교한 실험실 계기 및 설정, 요구 하 고 훈련 된 전문가 의해 실행 되어야 합니다. 여기에, 프로토콜은 나노 기반 플랫폼에 자석 및 형광 매개 변수의 독특한 조합을 제공 하는 간단 하 게 진단 기술에 대 한 제안. 제안 된 multiparametric 마그네틱 형광 nanosensors (MFnS) 대장균 O157:H7 오염 조금 1 식민지 형성 장치 솔루션 미만 1 시간 내에 검색할 수 있습니다. 또한, MFnS의 능력을 유지와 같은 매우 복잡 한 미디어 기능을 우유와 호수 물 확인 되었습니다. 또한 추가 특이성 분석만 특정 대상 박테리아도 비슷한 세균성 종의 존재를 감지 하는 MFnS의 능력을 보여 주기 위해 사용 되었다. 자석 및 형광 modalities의 페어링 검색 및 병원 체 오염 농도, 모두와 늦은-초기 오염 탐지에 그것의 고성능 전시의 넓은 범위에서의 정량화에 대 한 수 있습니다. 효율성, 경제성, 그리고는 MFnS의 이동성 있도록 세균성 오염 물질에 대 한 포인트의 케어 심사를 위한 이상적인 후보자 설정의 넓은 범위에서 상업적으로 포장된 식품을 수생 저수지에서.

Introduction

세균성 오염 둘 다의 지속적인 발생 상업적 식품 생산과 물 소스 점점 더 신속 하 고 구체적인 진단 플랫폼에 대 한 필요를 창조 했다. ^{1 , 2} 일반적인 세균성 오염 물질 음식 및 물 오염에 대 한 책임의 일부는 살 모 넬 라, 황색, Listeria, 비 브리 오, 이질균, 균, 그리고 대장균 속에서 있습니다. ^{3 , 4} 세균성 오염이 균에 의해 종종 열, 콜레라, 위장염, 설사 등 증상이 발생합니다. ⁴ 오염 물 소스의 자주 충분히 필터링 된 물에 접근 없이 지역 사회에 크게 불리 한 효과 있으며 식품 오염 많은 질병 및 제품 회수 노력을 주도하 고 있다. ^{5 , 6}

세균 오염으로 인 한 질병의 발생을 줄이기 위해 수는 물과 음식을 검색 될 수 있으며 효율적으로 이전 판매 또는 소비 하는 방법을 개발 하는 노력 되었습니다. ^{3 1,7,8,,910} ELISA,^11,12 루프 중재 등온 증폭 (PCR 등 기법 램프),^13,14 ,^{15,,1617,18,19,20,21, 22,,2324} 최근 다양 한 병원 균의 검출에 대 한 사용 되었습니다. 전통적인 세균 배양 방법에 비해, 이러한 기술은 특이성 및 시간에 관하여 훨씬 더 효율적입니다. 그러나, 이러한 기술은 여전히 투쟁 가양성 및 원판, 복잡 한 절차 및 비용. ^{1 , 3 , 25} 그것 세균 검출에 대 한 대체 방법으로 제안 하는 multiparametric 마그네틱 형광 nanosensors (MFnS)이 바로 그 이유입니다.

이러한 nanosensors 고유 쌍을 함께 자석 및 형광 modalities, 신속 하 고 정확한 이중 탐지 플랫폼에 대 한 허용. 샘플 오염으로 대장균 O157:H7를 사용 하 여, 분 이내 작은 1 CFU를 검색 하는 MFnS의 기능 설명 했다. 병원 체 특정 항 체 특이성, 증가 하는 데 사용 되 고 자석 및 형광 modalities의 조합 탐지 및 정량화 모두 낮은 높은 오염 범위에서 세균 오염 물질의 허용 합니다. ¹⁶ 세균 오염에의 경우는 nanosensors 박테리아 병원 체 특정 항 체의 대상 능력 때문에 주위 메뚜기 것 이다. 마그네틱 nanosensors 및 박테리아 사이의 바인딩 자석 철 코어와 주변의 물 양성자 간의 상호 작용을 제한합니다. 그러면 증가 T2 이완 시간에 자석 relaxometer를 기준으로 기록 됩니다. 솔루션에는 박테리아의 농도 상승으로 nanosensors 박테리아, t 2 값의 결과로의 증가 수와 분산. 반대로, 형광 방출 박테리아, 병원 체에 직접 바인딩된 nanosensors의 증가 수의 농도와 비례하여에서 증가 합니다. 샘플, 원심 분리 및 절연 세균 펠 릿의 나노 박테리아, 어떤 부동성 nanosensors를 제거 하 고 직접 상호 연결의 수와 형광 방출에 직접 연결을 절약만 것입니다. 솔루션에 있는 박테리아. 이 메커니즘의 도식 대표는 그림 1에 표시 됩니다.

이 MFnS 플랫폼은 마음, 낮은-비용 및 휴대용 특성에 따른 포인트의 케어 상영과 함께 설계 되었습니다. MFnS, 실내 온도에 안정 하 고 세균 오염 물질의 정확한 탐지에 대 한 매우 낮은 농도에서 필요만. 또한, 합성, 후는 MFnS의 사용은 간단 하 고 분야에서 훈련 된 전문가의 사용을 필요로 하지 않습니다. 마지막으로,이 진단 플랫폼 고도로 사용자 정의 대상으로,이 의해 하나의 플랫폼 사용할 수 있습니다 많은 다른 설정에서 모든 종류의 병원 체를 검출 하는 수단을 제공 가능 합니다.

Protocol

1. 합성 및 다중 파라미터 자기 형광 Nanosensors (MFnS)의 기능화.

1. 합성 superparamagnetic 산화 철 나노 입자 (IONPs)
   IONP 합성에 대 한 준비가
   1. 준비 다음 3 솔루션: 솔루션 1: FeCl ₃ (0.70 g) FeCl ₂에서 H ₂ O (2 mL), 솔루션 2: NH ₄ 오 (2.0 mL, 13.4 M) H ₂ O (15 mL), 및 솔루션 3: polyacrylic 산 (0.855 g) H ₂ O (5 mL).
   2. 는 솔루션 1 2 M 염 산 (HCl)의 90 µ L을 추가 하 고 즉시 875 rpm에서 vortexing 동안 솔루션 2와 혼합. 그런 다음 추가 솔루션 3. 60 분에 대 한 vortexing 계속
   3. 1,620 x g.에서 20 분 동안 원심 분리기 원심 2880 x g.에서 20 분 동안 상쾌한
   4. 정화 투 통해 최종 상쾌한. 투 석의 가방에는 상쾌한 추가 (MWCO 6 − 8 K) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)를 포함 하는 비 커에 (pH = 7.4)와 스핀 바. 모든 2 3 h. 신선한 버퍼 교체 12 h 동안 담가 보자
2. IONPs의 표면에 항 체 특정 대상의 활용
   1. 준비 하는 다음 4 개의 솔루션: 솔루션 a: 5 mg 1-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide 염 산 염 (EDC) 250 µ L MES에에서 [2-(N- morpholino) ethanesulfonic 산] 버퍼 (0.1 m M, pH 6.8 =), MES 버퍼의 250 µ L에서 솔루션 b: 3 mg N Hydroxysuccinimide (NHS)의 (0.1 m M, pH 6.8 =), 솔루션 c: 5 µ g IgG1, 대장균 mAb의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (pH 7.4)의 225 µ L의 그리고 IONP의 솔루션 d: 4 mL (5.0 m m o l) 1 ml의 PBS (pH 7.4).
   2. 추가 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic 산 (MES) 솔루션, 버퍼 즉시 추가할 솔루션 솔루션 D 15에서 작은 단위로 혼합 각 추가 후에 해결책을 반전 하는 s.
   3. 즉시 3 분 동안 조금씩에서 솔루션 d 솔루션 B를 추가 하기 시작 합니다. 각 추가 후에 해결책을 반전 하 여 믹스.
   4. 솔루션 혼합 각 추가 후 반전 5 µ L의 단위로 솔루션 솔루션 C 추가.
   5. 반응 실 온에서 3 h 동안 계속 계속는 외피 4 ° C에서 하룻밤 허용.
   6. 정화 PBS를 사용 하 여 자기 열 통해 결과 Ab 활용 된 IONPs (pH 7.4, 최종 [Fe] = = 3.5 mmol) 어떤 결합형된 항 체를 제거 하.
   7. PBS (1 mL)와 자기 열 세척
      . 자기 접시에 열을 연결 하 고 IONP 해결책을 추가 하십시오.
      1. 다시 PBS (1 mL)와 자기 열 세척. 자석 접시에서 자기 열을 제거 합니다. PBS는 열을 추가 하 고 솔루션을 수집 합니다. 4 ° C에서 저장소
3. 형광등 1, 1의 캡슐 '-Dioctadecyl-3,3,3 ' 3, '-Tetramethylindocarbocyanine 과염소산염 (DiI) 염료를 사용 하 여 항 체 활용 된 IONPs의 polyacrylic 산 (PAA) 코팅에는 용 매 확산 방법입니다.
   1. Dropwise 2.0 추가 IONPs의 4 ml, DiI 염료 (2 mmol) 1100 rpm에서 연속 혼합과 DMSO의 100 µ L의 µ L.
   2. PBS, [철]의 최종 철 농도와 최종 MFnS 솔루션을 만들기에 대 한 결과 솔루션 (MWCO 6-8 KDa, 12 h) dialyze = 2 mmol.
4. 특성의 MFnS
   1. spectrophotometric 분석를 사용 하 여 플레이트 리더 595에서 형광 방출으로 캡슐화 된 DiI 염료 검출 nM.
   2. 동적 빛 산란
      1. 장소 샘플 MFnS 솔루션의 평균 크기는 MFnS의 표면 충전 확인 하 zetasizer.
         참고: 여기, 평균 크기와 기능 MFnS의 표면 충전 했다 발견 77.09 및-22.3 mV, 각각.

2. 세균성 Culturing 및 재고 솔루션 준비

1. 세균 배양
   1. 영양 국물의 1 mL에 동결된 펠 릿 (대장균 O157:H7)를 수 화와 국물의 추가 5 mL를 추가 합니다.
   2. 한 천 배지 및 행진을이 솔루션의 적용 100 µ L 24 h. 위해 37 ° C에 외피 다음 살 균 접종 루프를 사용 하 여
   3. 후 24 h, 한 천 배지에서 고립 된 식민지 선택한 문화 국물의 15 mL를 추가 합니다. 광학 밀도 값을 모니터링 하는 동안 4-6 h 37 ° C에서 품 어 (흡 광도 600 nm).
   4. 0.1의 광학 밀도 값을 얻은 배양, 중지 하 고 수행 하는 직렬 희석.
2. 직렬 희석
   1. 8 살 균 microcentrifuge 튜브 영양 국물의 추가 900 µ L.
   2. 첫 번째 튜브 (희석 10 ^-1)에 세균 현 탁 액의 추가 100 µ L.
   3. 걸릴 100 µ L 처음부터 튜브와 10 ^-2의 희석을 얻기 위해 두 번째 그것을 추가 합니다. 10 ^-8의 마지막 희석 끝나는 나머지 튜브에 대 한이 패턴을 계속.
   4. 전송 100 µ L에서 각 튜브를 분리 한 천 배지, 그리고 37에서 24 h에 대 한 품 어 ° c.
   5. 다음 날, 각 접시에 단위 (CFUs)를 형성 하는 식민지를 계산 합니다. ~ 100 CFUs와 플레이트를 선택 합니다. 해당 희석을 사용 하 여 추가 실험을 위한 (100 µ L = 100 ~ CFUs).
      참고: 여기 그것은 귀착되 었 다 ~ 100 CFUs 10 ^-6 희석.

3. MFnS를 사용 하 여 급속 한 탐지의 E. 대장균 O157:H7

1. 스파이크 1-100에서 CFU 범위 결과 10 ^-6 세균성 주식 양의 증가 함께 다양 한 PBS 솔루션 (1 X, pH 7.4, 300 µ L). MFnS의 일관 된 금액을 추가 (100 µ L) 이러한 솔루션을.
2. PBS (1 X, pH 7.4, 300 µ L)만 포함 한 초기 솔루션 및 MFnS (100 µ L).
3. 37 ° C에서 30 분에 대 한 솔루션을 품 어 하 고 실내 온도에 냉각 하도록 허용 다음.
4. 자석 relaxometer (0.47 테슬라)와 휴식 시간 (T2) 각 솔루션에는 CFUs에 상대적인 레코드 변경 전송 개별 솔루션.
5. T2 값에 변화를 기록, PBS와 MFnS 포함 된 기준 솔루션의 T2 값을 측정 하 여 시작
   .
   1. 장소는 자석에서 솔루션
      relaxometer. 열고 해당 소프트웨어를 선택 합니다 " T2 이완 " 설정 및 프레스 " 측정. "
   2. T2 값 추가 솔루션을 다양 한 아군은의 측정 다음 T2, 기준선의 컬렉션 박테리아의 농도.
      참고: t 2에서 변화는 초기 아군 t2에서 감 t 2.
6. 자석 relaxometer에서 샘플을 제거 하 고 10 분을 위한 2880 x g에서 튜브 원심
7. 는 상쾌한 가만히 따르다와 100 µ L의 PBS (1 X, pH 7.4)에 세균성 펠 릿 resuspend.
8. 추가 80 µ L 96 잘 접시와 595에서 레코드 형광 강도를 각 물의 resuspension의 nM.
   참고: 테스트 반복 될 수 있다 결과 섹션에 설명 된 대로 호수 물, 우유 등을 포함 한 다른 용 매를 사용 하 여

Results

MFnS 행동의 메커니즘은 그림 1에 표시 됩니다. 세균 오염 물질의 표면 주위 MFnS의 클러스터링 방해는 MFnS의 magnetic cores와 주변 수소 핵 사이 상호 작용. 이 클러스터링, 자기 휴식의 결과로 값이 증가합니다. 세균 오염 물질의 농도 증가, 클러스터링, 줄이고 T2 값에 변화를 감소. 따라서, 형광 적임의 결정적 이다. 세균성 농도 증가, MFnS에 의해 생산 하는 형광 신호 증가, 모두 낮은 높은 농도 범위에서 세균 오염 물질의 민감한 감지에 대 한 허용 합니다.

프로토콜, 다음¹⁶ MFnS 합성 되었고 처음 PBS (1 X, pH 7.4)의 솔루션에서 테스트. 검색, 자기 휴식에 사용 되는 초기 양식 적임 T2 값에 변화를 기록 하기 위해 사용 되었다. 프로토콜에 따라 샘플은 다음 centrifuged 하 고 펠 릿 했다 resuspended 형광 데이터 수...

Discussion

이 프로토콜 단순히 완전 한 기능 MFnS을 생산 하도록 설계 되었습니다 가능한. 그러나, 많은 핵심 포인트를 변경 하는 프로토콜의 사용자의 최종 목표에 따라 유용할 수 있습니다 있다. 예를 들어 다른 항 체를 사용 하 여 다른 많은 병원 체의 허용 것 이다. 또한,이 프로토콜 분자를 대상으로 항 체의 사용에 국한 되지 않습니다. 호스트 세포 수용 체, 등 대상 병원 체에 대 한 특정 바인딩 선호도 어떤 분자는 분자를 대상으로 사용할 수 있습니다. 대상 분자는 1 차 아민 또는 알콜 그룹, 또는 하나도 functionalized 수, EDC/NHS 활용 화학 프로토콜에 따라 산화 철 나노 입자의 표면에 활용 수 있습니다. 둘째, 각 탐지 솔루션에 사용 되는 MFnS의 금액을 다양 한 될 수 있습니다. (용 매 및 대상 병원 체 없이 nanosensor 포함) 기준 솔루션에 대 한 T2 값 100-250 양 범위에 경우 기준 값 100, T2 값의 변화는 덜 민감한 것 충...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
염화철 사수화물	Fisher Scientific	I90-500
염화철 육수화물	Fisher Scientific	I88-500
수산화암모늄	Fisher Scientific	A669S-500
염산	Fisher Scientific	A144S-500
폴리아크릴산	시그마-알드리치	323667-100G
EDC	Thermofisher Scientific	22980
NHS	Fisher Scientific	AC157270250
Anti-E. coli O111 항체	혈청 케어	5310-0352
Anti-E. coli O157:H7 항체 [P3C6]	Abcam	ab75244
DiI 스테인	피셔 사이언티픽	D282
영양 육수	Difco	233000
동결건조 E. coli O157:H7 펠릿	ATCC	700728
자기 릴랙소미터	Bruker	mq20
Zetasizer	Malvern	NANO-ZS90
플레이트 리더	Tecan	Infinite M200 PRO
마그네틱 컬럼	QuadroMACS	130-090-976
원심분리기	Eppendorf	5804 시리즈
원심분리기 (accuSpin Micro 17)	Fisher Scientific	13-100-676
바닥 모델 쉐이킹 인큐베이터	SHEL LAB	SSI5
분석 저울	Metler Toledo	ME104E
디지털 볼텍스 믹서	Fisher Scientific	02-215-370
옥외 흔들 셰이커	피셔 사이언티픽	02-217-765