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방법 논문

Vestibular Schwannoma 연구를위한 통합 방법론 체계

7.3K 조회수

DOI:

10.3791/55827

2017년 6월 20일

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 목표는 vestibular schwannoma 및 Schwann 세포 연구에서 여러 하류 응용 프로그램에 대한 인간의 수술 샘플 수집 및 처리를 설명하는 것입니다.

초록

전정 신경초종은 cerebellopontine 각의 가장 흔한 신 생물이며 모든 두개 내 성장의 6-8 %를 차지합니다. 이 종양은 영향받은 개체의 최대 95 %에서 감각 신경성 청력 손실을 일으키지 만,이 청력 손실의 근간을 이루는 분자 메커니즘은 아직 파악하기 어렵습니다. 이 기사는 전정 신경초종 연구에 필수적인 다운 스트림 연구 응용을위한 다양한 1 차 인간 조직 샘플의 수집과 처리를 용이하게하기 위해 연구실에서 수립 된 단계를 설명합니다. 특히,이 연구는 외과 표본에서 Schwann과 schwannoma 세포의 수집, 가공 및 배양에 대한 통일 된 방법 론적 틀을 설명합니다. 이것은 종양과 신경 분비물의 수집, RNA의 보존과 수집 된 조직에서의 단백질 추출, 절편 준비를위한 조직 고정, 현재의 연구에 필수적인 것으로 간주되는 병행 처리 단계와 통합되어 있습니다.유전자 치료에 응용하기 위해 아데노 관련 바이러스에 일차 인간 세포를 노출시키는 것. 또한,이 연구는이 종양을 내이 및 외음부에서 인간의 감각 상피를 얻을 수있는 독특한 기회로 수집하는 외과 적 접근법을 강조합니다. 실험적인 품질을 향상시키기위한 팁이 제공되고 일반적인 함정이 강조 표시됩니다.

서론

Vestibular schwannomas (VSs)는 10 만명당 1 명꼴로 진단되는 소뇌 뼈의 각도에서 가장 흔한 신 생물입니다. 비 전이성이더라도이 종양은 환자의 삶의 질 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6에 심각한 영향을 미칩니다. 영향을받는 개인은 일반적으로 난청, 이명 및 청각 충만감을 느낍니다. 종양이 성장함에 따라 증상이 점점 쇠약하게되어 균형 문제, 안면 마비 및 다른 뇌 기능의 손상을 초래합니다. 뇌간 압박으로 인한 생명을 위협하는 합병증 또한 발생할 수 있습니다.

대장 증후군의 관리 옵션은 근본적으로 정적 종양 및 확립 된 방사선 요법 또는 성장하는 종양의 외과 적 절제를 기다리는 것에주의해야합니다 8. 연구 제휴 병원에서이 종양을 외과 적으로 제거하면 환자 수술 중에 수집 된 신선한 종양 조직을 수집하고 분석 할 수있는 기회가 제....

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프로토콜

모든 샘플 채취에 대한 서면 동의 동의서는 수술 전에 얻었으며 실험은 세계 의학 협회 (헬싱키 선언)의 윤리 강령에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜의 모든 섹션은 매사추세츠 안과 / 기관 및 매사추세츠 종합 병원의 기관 검토위원회 (Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다.

참고 : 아래 1 ~ 7 절은 수술실에서 1 차 인간 VS 또는 GAN 샘플을 받으면 순차적으로 수행하도록 고안되었습니다. 처리는 항상 섹션 1부터 시작해야합니다. 그런 다음 원칙적으로 RNA를 먼저 보존하고 (섹션 2),이어서 분비물 수집 (섹션 3) 및 단백질 추출 (섹션 4)을위한 조직을 준비해야합니다. 배양 될 조직 (VS에 대한 섹션 5, GAN에 대한 섹션 6)은 보충 된 배양 배지에 놓일 수 있고, 섹션 2, 3 및 4는 수행 될 수있다. 절개를위한 조직의 고정 (7 절)은 매우 짧고 c임의의 원심 분리 단계에서 수행 될 수있다. translavrinthine 대 절제술을 시행하는 동안 수술실에서 외 림프 또는 뇌척수액을 받으면 제 8 절 (외음부 처리) 및 제 9 절 (CSF 처리)을 수행 할 수 있습니다. 섹션 10 (바이러스 형질 도입)은 배양중인 성장하는 VS 또는 Schwann 세포에서 수행 할 수 있습니다.

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결과

5 장에서 확립 된 것처럼 배양 된 1 차 인간 VS 세포는 많은 하류 연구 응용에서 질병 관련 과정에 대한 유익한 모델로 취급 될 수있다 ( 그림 1 ). 6 절에서 배양 된 건강한 Schwann 세포는 직접적이고 객관적인 비교 점을 ​​제공합니다. 아래에 요약했듯이이 통일 된 방법론 프레임 워크에 따라 처리 된 VS 및 GAN의 광범위한 데이터는 이전에 12 , 13 , 14 , 15 , 27 에 게시 된 여러 기사에서 사용할 수 있습니다.

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토론

이 원고는 VS 연구를위한 통일 ​​된 방법 론적 틀을 설명하며, 하류 연구 응용을위한 인간 VS와 GAN 표본의 동시 처리를 개괄합니다. VS 연구가 정밀 의학의 시대에 접어 들면서 수많은 연구 질문에 답할 수있는 형태로 동일한 샘플을 준비하면 개별 환자에게 특유한 분자, 세포, 유전 및 proteomic 통찰력을 발견 할 수 있습니다.

인간 Schwann 세포와 VS 배양의 순도는 S100 마커에 양성인 세포와 DAPI 핵 염색체에 양성인 세포의 비율을 사용하여 면역 세포 화학 법으로 시간이 지남에 따라 철저히 평가되었습니다. 따라서,이 세포의 순도가이 기간 동안 가장 높기 때문에, 세포를 플레이 팅 한 후 처음 2 주 이내에 일차 인간 슈반 세포 배양에 대한 실험을 수행하는 것이 권장된다. 이후에 섬유 아세포와 같은 세포가 우세하기 시작한다. 천개gh VS 세포 배양 물은 또한 배양 2 주에서 최대로 순수하며, VS 세포는 접촉 매개 저해가 없으며 이후 단계에서 계속 증.......

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작품은 국방부 보조금 W81XWH-14-1-0091 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), 국방부 보조금 R01DC015824 (KMS) 및 T32DC00038 (JES 및 SD 지원) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauer Tinnitus Research Center (KMS) 및 Barnes Foundation (KMS)이 포함됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 독일 유리 커버슬립Corning354087또는 Corning Laminin (CB-40232) 및 Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)으로 커버슬립을 준비하십시오
CELLSTAR 15 mL 원심분리기 튜브, 원뿔형 바닥, 눈금, SterileGreiner Bio-One188161
CELLSTAR 50 mL 원심분리기 튜브, 원뿔형 바닥, 눈금, SterileGreiner Bio-One227261
CELLSTAR 세포 배양 접시,Greiner Bio-One628160
콜라겐 분해 효소, 멸균 여과Sigma-AldrichC1639
Costar 24 Well Clear TC 처리 다중 웰 플레이트, 멸균Corning3526
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM, 고포도당, 피루브산염, 글루타민 없음, 500mLThermo Fisher Scientific10313-039
DMEM/F-12, 500mLThermo Fisher Scientific11320-033
Dumont #3 겸자, DumoxelFine Science Tools11231-30사용 전 오토클레이브
Dumont #5 겸자, 표준 팁, InoxFine Science Tools11251-20사용 전 오토클레이브
소 태아 혈청, 적격, USDA 승인 지역, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028분취액을 50 mL 튜브에 담아 -20°C에 보관; C 냉동고
소 고환에서 Hyaluronidase, 유형 I-S, 동결 건조 분말Sigma-AldrichH3506
Millex-GP 주사기 필터 장치, 0.22 & 마이크로; m, 폴리에테르설폰, 33mm, 멸균EMD MilliporeSLGP033RS
파라포름알데히드, 시약 등급, 결정질시그마-알드리치P6148사용 전: 온라인에서 사용 가능한 프로토콜에 따라 표준 작동 절차를 수립합니다
PBS, pH 7.4, 500mLThermo Fisher Scientific10010-023오토클레이브 사용 전
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL), 100mL열 Fisher Scientific15140-122
PhosSTOP 인산가수분해효소 억제제 정제Roche04906845001
Pierce 프로테아제 억제제 정제Thermo Fisher Scientific88666
피펫 및 피펫 팁, 1.5/2.0 mL 마이크로튜브용 5/10/25 mL가변
가변 플라스틱 균질화 유봉E& K ScientificEK-10539
PrecisionGlide 바늘, 27 g x 1 1/2 inBD301629
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Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 1.5 mLEppendorf022363204Autoclave 사용 전
식염수 - 0.9% 염화나트륨 주입, 정균, 20 mLHospira0409-1966-05
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표본 용기, 또는 멸균, 4OZMedlineDYND30331H
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투베르쿨린 주사기 전용, 슬립 팁, 1 mLBD309659
투베르쿨린 주사기 전용, 슬립 팁, 3 mLBD309656
초음파 균질기, 4710 시리즈, CV18 프로브Cole-ParmerCP25013
. Clostridium histolyticum의 60mm . .

참고문헌

  1. Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
  2. Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and manage....

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