라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

요약

Odorant 수용 체의 기능을 특성화 deorphanization 과정에서 필수적인 부분을 제공 합니다. 우리 캠프 분석 결과 사용 하 여 실시간으로에서 odorant 수용 체의 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다.

초록

포유류 odorant 수용 체 (OR) 가족의 거 대 한 크기는 수많은 휘발성 화학 물질 가운데 그들의 동족 ligands를 찾는 데 어려움을 제시. 효율적이 고 정확 하 게 ORs deorphanize, 우리 표현 포유류 ORs와 유전자 변형된 바이오 센서 플라스 미드 실시간으로 또는 활성화의 하류 캠프 생산을 측정 하는 분리 셀 라인의 사용을 결합. 이 분석 결과 ORs와 반대로화면 odorants을 사용할 수 있습니다. 화면에서 긍정적인 odorant 수용 체 상호 작용 이후에 다양 한 악취 농도, 농도-응답 곡선을 생성에 대 한 테스트 하 여 확인할 수 있습니다. 여기 우리는 인간 또는 라이브러리 Hana3A 세포에 표현 하 고 긍정적으로 반응 하는 수용 체의 화합물에 대 한 동족 수용 체 확인 향기로운 화합물의 높은 처리량 검열을 수행 하기 위해이 방법을 사용. 우리 효율적이 고 또는 활성화 평가에 신뢰할 수 있는 것이 높은 처리량 탐지 방법을 발견 하 고 우리의 데이터 또는 기능 연구에 그것의 잠재적인 사용의 예를 제공.

서론

냄새의 감각을 음식을 얻기, 육 식 동물 및 위험 방지, 종, 구분 선택 메이 트^1,2의 후 각 능력에 의존 하는 그들은 동물의 생존에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 기능의 실현 odorant 수용 체 (ORs), 후 각 상피 (OE)에 위치한 후 각 감각 신경 (OSNs)의 속눈썹 표면에 개별적으로 표현 되는에 따라 다릅니다. ORs 구성 최대 약 400와 1200 다양 한 OR 유전자 인간에서 G-단백질 결합 수용 체 (GPCR) superfamily의 가족 및 마우스, 각각^3,4,5. ORs odorants에 의해 활성화 후 각 G-단백질 (G_olf)의 순차적 활성화를 통해 증가 시킨된 세포내 캠프 수준 이어질 고 III adenylyl 있고 (ACIII)를 입력 합니다. 세포내 캠프의 결과 증가 수준 두 번째 메신저, 세포 표면에 뉴클레오티드 개폐 통로 열어, 트리거링 양이온 등 캘리포니아^{2 +} 활동 전위, 그리고 궁극적으로 시작의 유입으로 작동할 수 있습니다. 신경-잠재적인 전송 그리고 후 각 지 각입니다. 감지 하 고 ORs로 odorants의 많은 수를 감 별 하는 과정은 후 각 지 각^6,7의 첫 번째 단계로 간주 된다.

때문에 벅과 악 셀⁸ 먼저 성공적으로 복제 odorant 수용 체 ORs에서 시작 하는 후 각 인식의 메커니즘을 해명, 또는 가족의 deorphanization이이 필드에 핫스팟 중 하나가 되었다. 다양 한 에 비보, ex vivo 생체 외에서 메서드와 OR 활성화를 측정 하는 보고 된^9,10,,1112되었습니다. 캘리포니아^{2 +} 영상 단일 셀 RT-PCR OSNs에 다음을 사용 하는 전통적인 방법 지방 족 odorants^13,,1415다른 ORs의 식별을 사용할 수 있습니다. 더 최근에, 대규모 transcriptome 분석의 등장 더 많은 비보에 높은 처리량 방법의 개발 추진. 켄터키 분석 결과 eugenol 및 muscone 응답 마우스 ORs S100a5 tauGFP 기자 마우스 긴장과 microarray 분석⁹를 사용 하 여 식별합니다. Odorant 노출 후 또는 mRNA 수준에서 감소에 따라, 꿈의 기술 고용 모두 척추 및 비 척추 동물¹⁶OR 활성화 프로필을 확인 하려면 transcriptomic 접근. Matsunami 신경 활성화에 s 6의 인 산화를 감안할 때, 응답 ORs¹²식별 phosphorylated 리보솜 immunoprecipitations에서 시퀀스 된 mRNAs를 유사 하 게, 그룹. 마지막으로, 파인 그룹 슈퍼 스니퍼 쥐 냄새에서 vivo에서, MouSensor 기술¹⁷로 알려진 코딩을 공부 하는 플랫폼으로 서 역할을 수 있는 보고.

생체 외에서 영역에서 OSNs 경작의 도전은 OR 기능 식에 vivo에서 모방 분리 식 시스템 ORs 향기로운 화학 제품의 대규모 심사를 실시 하 이상적인 솔루션입니다. 그럼에도 불구 하 고, 이후 네이티브 OSNs에서 다 비 후 각 근원의 경작된 셀 라인 또는 단백질 바인딩과 그물에 원형질 막에 트래픽을 수 없습니다 유지 됩니다, 또는 저하 및 수용 체 기능¹⁸ 의 손실에 결과 ^{, 19}.이 문제를 해결 하려면 광범위 한 작품을 만들어왔다 OR 기능 식 분리 세포의 세포 막에 복제. Krautwurst 외. 먼저 연결할 rhodopsin (Rho-태그)의 처음 20 아미노산 또는 단백질의 N 맨끝 그리고이 승진 (HEK) 인간 미 발달 신장 세포²⁰일부 ORs의 세포 표면 표현. 단일 OSNs에서 진 식 (세이 지) 도서관 분석의 직렬 분석을 실시 하 여 사이토 외. 먼저 수용 체 수송 단백질 (RTP) 가족 구성원, RTP1, RTP2, 및 수용 체 식 증강 단백질 1 (REEP1) 또는 세포 막에 매매를 촉진 하 고 ORs에서 HEK293T 셀 ^{의 응답 odorant 중재 하는 복제 21}. 이러한 결과에 따라, Matsunami 그룹 Hana3A 세포 라인을 설립 성공적으로, 안정적으로 HEK293T에서 RTP1, RTP2, REEP1, 및 Gα_olf 와 페 고 뚜렷이 효율적인 또는 기능에 대 한로 태그 ORs와 페 식입니다. 후속 연구 1) 짧은 형태의 RTP1, RTP1S, 홍보 하거나 원래 RTP1 단백질과 2) 유형 3 muscarinic 아 세 틸 콜린 수용 체 (M3R) β-arrestin-2의 억제를 통해 또는 활동을 향상 시킬 수 있는 보다 기능 더 견고 하 게 수 있는 공개 모집, 둘 다 최적화 실험을 분리 표현 시스템에 도입 되었다^22,23출력.

여러 가지 검색 방법은 분리 시스템에서 수용 체 활성화를 계량에 사용 되었습니다. 은닉 placental 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (SEAP) 분석 결과 또는 활성화를 평가 하기 위한 매력적인 옵션을 기자 효소 transcriptionally 캠프 응답 요소 (CREs)에 의해 규제로 작동 합니다. 형광은 SEAP 검출 시 약²⁴를 가진 외피 후 문화 매체의 샘플에서 쉽게 감지 된다. 이 메서드를 사용 하 여 아민 관련 수용 체 (TAARs) 되어 OE는 추적 표현 chemosensory 수용 체의 보조 클래스 ORs의 기능^25,,2627특징. 또 다른 일반적인 방법은, luciferase 분석 결과, 야영지 응답 성분 (CRE)의 제어에서 반딧불 luciferase 취재 원 유전자를 사용합니다. Luciferase 생산에 의해 생성 된 발광 측정 또는 활성화^10,,1128측정의 효율적이 고 강력한 수단을 제공 합니다.

실시간 캠프 분석은 또한 널리 사용 되었습니다 분리 또는 생 GPCRs의 함수를 동적으로 모니터링. 이러한 고급 분석 실험의 한 예로 유전자 인코딩된 바이오 센서 변종, 돌연변이 형태의 luciferase 융합 캠프 바인딩 도메인을 보유 하 고 활용 합니다. 캠프 묶을 때 구조적 변화 luciferase, 있는 발광 다음 화학 리더^29,30으로 측정 될 수 있다의 활성화에 지도 한다. 실시간 캠프 기술 드 HEK293 NxG 108CC15 세포에 인간의 odorant 수용 체의 분리에 적합 보고 되었습니다.엉덩이 = "외부 참조" > 31^,,3233, 뿐만 아니라 HEK293T에서 파생 된 Hana3A^34,35세포로. 또한 Krautwurst 그룹 양방향 대규모 또는 검사 방법^32,33에 적합 하도록 실시간 캠프 기술을 자세히 설명 합니다.

여기는 Hana3A 세포에서 실시간 캠프 분석 결과 사용 하 여 또는 활성화를 측정 하기 위한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜에서 미리 equilibrated 라이브 셀의 발광 운동 측정 30 분 다음 특정 휘발성 화합물과 치료, 보다 효율적이 고 정확한 분석에 덜 취약 또는 활성화의 대표 연장 시간과 냄새 유발 세포 독성 세포 환경에서 발생 하는 아티팩트 이 실시간 측정 ORs의 ligands, 대규모 심사로 관심의 특정 또는 ligand 쌍의 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리가 성공적으로 OR5AN1로 식별 사향 복합 muscone에 대 한 수용 체 379 인간의 ORs에 대 한 심사를 수행 하 고 이후에 긍정적인 심사 결과 확인 하 여.

프로토콜

1. Culturing 및 유지 보수의 Hana3A 셀

1. 최소 필수 매체 (MEM)와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100의 10 mL에 있는 유지 세포 µ g/mL 페니실린-스, 그리고 1.25 µ g/mL 암포 B 100 m m 5% CO ₂와 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서 셀 문화 요리. 모든 다른 통로와 1 µ g/mL puromycin 플라스 (참조 소개)의 안정 되어 있는 transfection를 유지 하기 위해 추가.
   참고: 클래스 II 생물 안전 캐비닛 되도록 무 균 환경에서에서 세포 배양과 관련 된 모든 단계를 수행 하십시오.
2. 100mm 요리 2-3 일 마다 10-20%의 비율로 subculture.

2. Transfection에 대 한 셀을 도금

1. 세포 생존 능력을 보장 하 고 합류 추정 단계 대조 현미경 Hana3A 세포 관찰.
2. 세포 배양 접시에서 모든 매체를 발음.
3. 접시에 10 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 추가 하 고, 접시, 소용돌이, PBS 발음 하 여 세포를 씻어.
4. 접시에 0.05 %trypsin 에틸렌 diamine tetraacetic 산 (EDTA) 3 mL를 추가합니다. 믹스 1 분 또는 때까지 모든 셀이 해상.
   참고: 필요에 따라 현미경 아래 접시의 하단에서 분리 하는 세포의 진행을 관찰.
5. 비활성화 trypsin 10 %FBS 피 펫의 덩어리 헤어를 위아래로 MEM의 5 mL을 추가 하 여 셀 미사
   참고: transfection 전에 도금, 사용 매체 없어야 항생제 합니다. 항생제의 추가 transfection 효율 저하 될 수 있습니다.
6. 페 수에 번호판의 수에 따라 15-mLl 튜브에 세포의 적절 한 금액을 전송. 각 96 잘 접시, 접시 2 x 10 ⁶ 셀, 또는 100% confluent 100 mm 접시의 약 1/5, 주는 2 x 10의 세포 수 ⁴ 셀 잘 또는 약 15-30% 합류의 밀도 잘 당. 5 분 동안 200 x g에서 튜브 원심 및 셀 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음.
   참고: 셀 overgrowing 또는 자극 전에 셀 undergrowing을 피하기 위해 96 잘 접시에 도금 될 올바른 금액 계산.
7. 10% FBS 15 mL로 튜브 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 셀의 덩어리 헤어 대용량 메모리의 적절 한 금액을 추가 합니다. 각 96 잘 접시 resuspend 10 %MEM 6 mL와 함께 셀 FBS.
   참고: 수 튜브에 공기 방울을 생성 하지 않도록 주의 하십시오.
8. 는 저수지로 정지 셀을 추가합니다. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 96 잘 접시의 각 음에 셀의 50 µ L 플라스틱. 5% CO ₂와 37 ° C에서 밤새 품 어.

3. 플라스 미드의 transfection

1. transfection, 이전 관찰 단계 대조 현미경 잘 당 약 30-50%의 적절 한 합류를 보장 하는 인큐베이터 돌아갑니다 도금된 셀.
2. 준비 미리로 태그 또는 구성 ^{11 , 21 , , 22 28}, 액세서리 요소 구성 (RTP1S ^{22 , 36}과 M3R ²³), 바이오 센서 변종 구성 ^{29 , 30} miniprep에 의해. DNA 농도 분 광 광도 계에 의해 측정 하 고 필요에 따라 증류수와 플라스 미드 DNA 농도 (예를 들어, 100 ng / µ L을)을 조정.
3. Transfection 혼합물의 준비
   1. 표 1에 따라 각 96 잘 접시 MEM의 500 µ L에 플라스 미드 transfection 혼합물 준비.
      참고: 다른 ORs 같은 96 잘 접시에 테스트 하는 경우 transfection 혼합물 및 플라스 미드 DNA 추가 금액의 볼륨 해야 합니다 적응 주어진된 OR와 transfected 우물의 수의 기능에.
   2. 준비 transfection 지질 중재 시 약 MEM.의 500 µ L에서의 18 µ L 튜브에 transfection 혼합물
4. 아래로 pipetting transfection 혼합물으로 플라스 미드 혼합물을 혼합. 15 분에 대 한 실 온에서 품 어
5. 10 %MEM 5 mL을 추가 하 여 반응을 중지 FBS.
6. 셀 문화 후드에서 무 균 종이 타 올의 두꺼운 층에 밖으로 퍼졌다. 인큐베이터에서 셀 96 잘 접시를 가져가 라. 매체는 종이 타월에 의해 완전히 흡수 되도록 부드럽게 하 고 반복적으로 접시 종이 타월의 더미에 거꾸로 누릅니다.
   참고: 않습니다 하지 강제로 또는 갑자기 들어오기 접시 하나의 세포를 잃을 수.
7. 결합된 transfection 혼합물의 50 µ L 96 잘 접시의 각 음을 하 고 5% CO ₂와 37 ℃에서 18-24 h에 대 한 밤새 품 어.
   참고: 시간 관리 transfection 자극 일정 앞에 야 측정 하나 이상의 96 잘 접시는 모든 접시 transfection 동시 자극 노출 시간 후 측정 하기 위해서는 한 실험에서 테스트 했을 때.

4. 자극 및 측정 또는 실시간 캠프 분석 결과 사용 하 여 활동

1. transfected 세포를 잘 당 50-80%의 적절 한 합류 보장 인큐베이터에 단계 대조 현미경 관찰.
2. 5 m m 10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic 산 (HEPES)를 추가 하 여 행 크에 포도 당 자극 매체를 준비 ' s 균형 소금 솔루션 (HBSS).
3. 녹여 얼음에 실시간 캠프 분석 결과 기질 시 약 aliquots. PCR 튜브에 기질 시 약 55 µ L 튜브 당에서-80 ° C에 저장 합니다. 접시 당 1 튜브 사용.
4. 2750 µ L HBSS/HEPES/포도 당 솔루션의 기판 시 약 55 µ L를 혼합 하 여 2% 재래식 솔루션 준비.
5. 벤치에 종이 타 올의 두꺼운 층에 밖으로 퍼졌다. Transfection 매체는 종이 타월에 의해 완전히 흡수 되도록 부드럽게 하 고 반복적으로 접시 종이 타월에 거꾸로 누릅니다.
6. 각 잘 HBSS/HEPES/포도 당 솔루션의 pipetting 50 µ L로 세포 세척.
7. 부드럽게 하 고 반복적으로 96 잘 접시에서 HBSS/HEPES/포도 당 솔루션에 밖으로 두드리는.
8. 각 2% 재래식 솔루션의 피 펫 25 µ L 고 2 헤 대 한 어둠 속에서 실 온에서 품 어
9. 준비 사전에 1 M DMSO에-20 ° C까지 사용에서 저장소 odorant 재고 솔루션.
10. 이전 보육 시간의 끝에 희석 HBSS/HEPES/포도 당 자극 매체에서 작업 농도 odorant 재고 솔루션.
    참고:이 단계에서 준비 odorant 희석 농도 각 잘에서 올바른 최종 농도를 두배로 한다.
11. 플레이트 리더는 화학을 사용 하 여 및 odorant 추가 하기 전에 잘 ³⁴ 당 1000 밀리초의 속도에서 2 연속 번 접시의 기저 발광 수준 측정.
12. 는 플레이트 리더에서 접시를 신속 하 게 제거를 각 잘을 25 µ L odorant 희석을 추가 하 고 즉시 20 사이클에 대 한 모든 우물의 연속 발광 측정을 시작 30 분 이내
    참고: 피 펫 주변 오염 방지 하려면 신중 하 게 우물 같은 접시의 다른 odorants 또는 동일한 odorants의 다른 농도 사용 하 여 때.

5. 데이터 분석

1. 화학 플레이트 리더 소프트웨어에서 데이터를 내보냅니다.
2. 계산 수식을 사용 하 여 각 시간 지점에 대 한 응답 또는 정규화
   (발광 _N – 발광 _기저) / (발광 _높은 – 발광 _기저)
   어디 N = 특정의 발광 값 잘; 기저 기저 2의 평균 발광 값 = 발광 값; 최고 = 접시의 가장 높은 발광 값 또는 격판덮개의 세트.
   참고: 실험의 목적에 따라 대체 그래픽 표현은 채택 될 수 있다. 심사 분석 ( 그림 1 참조) 예를 들어 고 농도-응답 곡선, 최대값 등 운동 측정 중 원하는 시간에 특정 잘 발광 값을 생성 또는 최종 값을 사용할 수 있습니다.

결과

Muscone 천연 사향에서 주요 향기로운 구성 요소입니다. 최근은 muscone 및 마우스 또는, MOR215-1, 쥐^37,38행동에 muscone 응답 glomeruli에서 복제에 상 동에 따라 다른 macrocyclic 사향 화합물에 대 한 인간의 수용 체로 확인 된 OR5AN1을 공부 한다. 또한 인간 또는 레 퍼 토리, 우리의 그룹 및 Touhara 그룹을 심사 하 여 OR5AN1 2 macrocyclic 사향 화합물, cyclopentadecanone 및 muscone, 주요 수용 체로 서 각각 사용 하 여 식별 luciferase 분석 결과 시스템^38,39 .

토론

특정 odorant에 노출 시 OR의 활성화를 정확 하 게 측정 하는 것은 후 각 정보의 코딩을 해독에 첫걸음 이다. 어떻게 하나의 예로 식별할 수는 생체 외에서 사용 하 여이 연구 대표 OR 식 시스템, 관심 및 이후에 수용 체의 향기가 있는 화학에 대 한 인간의 또는 레 퍼 토리 가운데 응답 ORs 에서처럼 실험 약리학은 화학 물질의 다양 한 농도 사용 하 여입니다. 우리의 결과 muscone에 대 한 진실 fide 수용 체로 OR5AN1를 확인합니다. 이것은 이전 보고서³⁹ 와 일치 하 고 수용 체 수가 적은 사향 냄새^27,40감지에 관련 된 추측에 대 한 추가 증거를 제공 합니다. 사토-Akuhara 그 외 여러분 luciferase 분석 결과 유사 하거나 분리 식 시스템에 의해 생성 되는에서 심사 데이터와 비교, 검사 결과 약...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Amphotericin B	Sigma	A2942
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Gibco	10099-141
GloSensor cAMP 시약	Promega	E1290
pGloSensor-20F cAMP 플라스미드	Promega	E1171
Hana3A 세포			요청 시 작성자로부터 제공됩니다.
HBSS, 칼슘 또는 마그네슘 없음	GIBCO 14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019
함께 pCI MEM과 같은 포유류 발현 벡터로 복제되었습니다
	Cruz	sc-200528
Musk tibetene	Sigma-Aldrich	S359165
pCI PBS와 같은 포유류 발현 벡터에 Rho-tag로 복제된	플라스미드
	Cellgro	21-040-CV
페니실린-스트렙토마이신	하이클론	SV30010
플라스미드 miniprep kit	Tiangen	DP103-03
Puromycin	Sigma	P8833
RTP1S 플라스미드
0.2-mL PCR 튜브	Axygen	PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf 튜브	Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube	BD Falcon	352096
8-well 및/또는 12-well 멀티채널 피펫맨	Eppendorf
96-well flat-bottom white cell culture plate	Greiner	655098
100 mm x 20 mm cell culture dish	BD Falcon	353003
Class II 생물 안전 작업대(laminar flow
포함)Cell Culture incubator, 5% CO2
Centrifuge, 15ml 코니컬 튜브
Infinite F200 플레이트 리더	Tecan
위상차 현미경(x10 및 x20 대물렌즈 포함)
분광광도계
다채널 분배
멸균 종이 타월