방법 논문

인플루엔자-특정 항 체 Titers 계량에 최적화 된 Hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과

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DOI:

10.3791/55833

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2017년 12월 1일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Applied Microbiology Research, Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3Swiss Institute of Bioinformatics, 4Clinical Microbiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

제시 프로토콜 인플루엔자 백신 받는 사람 혈 청 샘플에서 인플루엔자-특정 항 체 titers 척도를 hemagglutination 억제 시험을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 첫 번째 분석 결과 hemagglutination에 의해 최적의 바이러스 성 항 원 농도를 결정합니다. 두 번째 분석 결과 hemagglutination 저해 하 여 인플루엔자-특정 항 체 titers 단정.

초록

항 체 titers 인플루엔자와 다른 병원 체에 대 한 혈 청 학적인 보호에 대 한 대리 표식으로 일반적으로 사용 됩니다. 사전 및 사후 예방 접종 항 체 생산의 상세한 지식은 백신 유도 면역을 이해 해야 합니다. 이 문서에서는 인플루엔자-특정 항 체 titers를 확인 하는 신뢰할 수 있는 포인트 프로토콜을 설명 합니다. 첫 번째 프로토콜 hemagglutination, 두 번째 프로토콜 (hemagglutination 분석 결과, 분석 결과 HA)에 후속 사용 농도 표준화에 필요한 항 원 금액을 지정 하는 방법을 설명 합니다. 두 번째 프로토콜 인간의 혈 청 또는 셀 문화 supernatants (hemagglutination 저해 분석 결과,이 분석 결과)의 직렬 희석을 사용 하 여 다른 바이러스 성 긴장에 대 한 인플루엔자-특정 항 체 titers의 정량화를 설명 합니다.

적용 예를 들어, 우리는 trivalent inactivated 인플루엔자 백신을 접종 하는 건강 한 코 호트의 항 체 응답을 보여줍니다. 또한, 다른 인플루엔자 바이러스 사이의 분 표시 되 고 동물 적혈구 (Rbc)의 다른 종류를 사용 하 여 분을 최소화 하는 방법을 설명 했다. 토론 하이라이트 장점과 제시 분석의 단점 및 어떻게 인플루엔자-특정 항 체 titers 결정 백신 관련 면역의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.

서론

인플루엔자 바이러스 감염 상당한 질병 률, 사망률, 및 높은 의료 비용1,2,,34와 연결 됩니다. 특히, 신생아, 임산부, 노인과 만성 질병을 가진 환자는 더 심한 임상 결과 대 한 위험이 있습니다. 따라서, 순환 하는 인플루엔자 바이러스 변종에 대 한 예방 접종이 고 위험도 인구에 있는 질병의 부담을 줄이기 위하여 기본 척도 이다. 예방 접종, 예를 들면, 보호 임계값 이상 인플루엔자-특정 항 체 후 개별 면역 반응의 증가 감염의 개별 위험과 일반 인구 내에서 바이러스 성 전송의 가능성을 감소 5. 백신 유도 체액 면역 반응의 다른 인구에 다양 한 연령층에 걸쳐 자세한 이해는 중요 한 임상 질문6,,78 대답 하는 핵심 요소 , 9와 같은: 왜 일부 노인 환자 이전 예방 접종에도 불구 하 고 감염을 해야 합니까? "좋은"와 "충분 한" 백신 유도 보호는 무엇입니까? 얼마나 자주 백신 보호 titers 도달 immunosuppressed 환자에 게 적용 한다? 가장 효과적인 복용량 무엇입니까? 예방 접종 후 항 체 titers에 소설 보조의 영향 이란 무엇입니까? 백신 관련 항 체 생산의 측정 이러한 중요 한 질문에 대답 하 고 예방 접종 결과 개선 하는 데 도움이 있습니다.

바이러스 특정 항 체 titers의 정량화는 다양 한 면역 방법으로 수행할 수 있습니다. 이 고체 상10 또는 비드 기반 ELISA11 분석 실험,이 분석 결과12및 중화 분석 실험13포함 됩니다. ELISA 기반 메서드는 상대적으로 많은 양의 다양 한 항 원에 대 한 혈 청 샘플의 검사를 수 있습니다. 또한, 병원 체 관련 면역 글로불린 (Ig) M와 IgG 수 수 별도로 탐험. 항 원, 예를 들면, 선형 아미노산 시퀀스 또는 바이러스와 같은 입자의 특성 항 체의 바인딩을 영향을 미칠 수 있습니다, 비록 잠재적인 epitopes의 스펙트럼은 매우 광범위 하 고 여부 항 체에 정보를 제공 하지 않습니다. 응답 기능 관련이 있다.

반면, 중화 시험 기능 세포의 감염을 억제 하는 항 체의 잠재력을 결정 하 고 따라서 잠재적인 중립화를 반영 한다. 그러나,이 방법은 매우 노동 집약 이다, 라인 세포 및 바이러스, 라이브 특정의 경작 그리고 그러므로, 그것은 소모, 비싼, 특별 한 장비가 필요 합니다 필요 합니다.

이 문서에서는 인플루엔자-특정 항 체 titers 척도를 세계 보건 기구 WHO 기반이 프로토콜12 는 단계별 설명. Hemagglutination은 적혈구의 교착을 선도 하는 일부 바이러스의 특성 효과 이다. 환자 혈 청이이 효과의 저해 중화 효과 반영 하는 억제 항 체 농도의 측정을 허용 한다.

우리는 동시에 여러 샘플의 효율적 처리 및 필요한 시간을 줄일 수 있도록 WHO 프로토콜의 워크플로 수정 했습니다. 첫 번째 프로토콜 특정 인플루엔자 항 원의 교착 잠재력의 결정을 설명합니다. 이 과정에서 두 번째 프로토콜에 대 한 올바른 인플루엔자 항 원 농도 결정 됩니다. 이 부분은 혈액의 각 배치 뿐 아니라 모든 새로운 바이러스 성 항 원, 반복 한다.

두 번째 프로토콜 인플루엔자-특정 항 체 titers 결정을 설명합니다. 그러나 제시 프로토콜 인플루엔자 바이러스와 인간 혈 청 샘플의 수사를 위해 최적화 된, 그것은 또한 적용할 수 마우스 혈 청 샘플 또는 셀 문화 supernatants 자극된 면역 세포, 예를 들어, 바이러스 특정 B 세포에서. 절대 측정된 titers로 결과 확인할 수 있습니다. 많은 백신 연구,은 titers 및 95% 신뢰 구간에는 각 특정 인구 표시 됩니다. 해석, seroprotection 또는 혈에 대 한 특정 바이러스 인구의 민감성을 설명 하기 위해 자주 사용 됩니다. Seroprotection 이상 4-fold titer 두 시간 점 (가장 일반적으로 사전 예방 접종과 30 일 사후 예방 접종에 사용 되는) 사이 seroprotective titers 달성과 증가의 ≥1:40, 그리고 혈 titer로 정의 됩니다.

두 프로토콜은 사용 하기 쉽게 하 고 그들은 연구 질문의 광범위 한 범위에 적용할 수 있습니다. 특히, 안정적이 고 신속 하 게 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다 hemagglutination, 홍 역, polyomaviruses, 유행 성 이하선염, 또는 풍 진14,15,16 등에 대 한 용량을 가진 다른 다양 한 바이러스에 대 한 항 체 titers .

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프로토콜

연구 프로토콜 로컬 윤리 검토 위원회 (www.EKNZ.ch)를 통해 승인 하 고 모든 참가자 로부터 서 면된 동의 얻어.

1. 혈 청 컬렉션

  1. 인간 관심의 시간 시점에서 혈 청 샘플을 수집 합니다. 이 연구를 위해 우리는 예방 접종 후 0 (독감 예방 접종의 시간), + 7, + 30, 60, 및 180 일에서 세라를 수집.
  2. 혈 청을 얻기 위해 상 온 (20-25 ° C)에서 10 분 동안 1200 x g에서 샘플 튜브 원심.
    참고: 4 ° C, 그리고 24 시간 보다는 더 이상 비 centrifuged 혈액 샘플 저장 되어야 한다.
  3. 약 수 다른 튜브 (cryo-튜브) 및 사용까지-80 ℃에서 동결으로 혈 청.
  4. 수행 후속 분석 실험 batch-wise, 모든 시간-포인트 환자 내에서 다양성을 줄이기 위해 한 사람의 포함 하 여.

2입니다. 항 원 준비

주의: 5 가지 항 사용 됩니다 ( 재료의 표참조). Biosafety 수준 2 (BSL-2) 실험실에서 항 원 준비.

  1. 제조업체의 지침에 따라 1.0 mL 증류수와 한 동결 건조 된 인플루엔자 항 원 앰 풀의 전체 내용을 다시 구성 하 고 진행 하기 전에 실 온에서 5 분의 최소 서 녹아 항을 허용 합니다.
  2. Aliquot 1.5 mL를 항 원 솔루션 튜브 및 추가 사용까지-80 ° C에서 동결.

3입니다. 콜레라 여과 액의 준비

참고: 콜레라 filtrate 파괴 하는 효소 (RDE) WHO 프로토콜12에 따라 수용 체로 사용 됩니다. 이 분석 결과17를 방해할 것 이다 혈 청에서 타고 난 억제제를 제거 합니다.

  1. 제조업체의 지침에 따라 동결 건조 된 RDE reconstitute
  2. 추가 사용 때까지 4 ° C에서 15 mL 튜브에 RDE 솔루션을 저장 합니다.

4. 하 분석 결과

참고:이 분석 여러 판 사이의 비교 되도록 바이러스 입자의 동일한 금액 각 접시 사용할 수 있어야 합니다. (HA 적정 라고도 함) 하 분석 결과 바이러스 입자 hemagglutination에 필요한 계량 하기 수행 되 고 HA 단위로 기록 됩니다. Hemagglutination의 "단위" HA 적정에 사용 되는 방법에 의존 한 운영 단위 이며 바이러스의 절대 금액의 측정 되지 않습니다. 따라서, HA 단위 표준화 된 RBC 정지의 동등한 볼륨 agglutinate 필요가 바이러스의 금액으로 정의 됩니다. 에 따르면 WHO는,이 분석 결과 대 한 사용 표준 금액 25 µ L 당 4 하 단위입니다. HA 분석 결과의 원리의 이해를 돕기 위해 그림 1을 참조 하십시오.

figure-protocol-1
그림 1 : Hemagglutination 및 hemagglutination 금지의 원칙. 아니 hemagglutination 없이 바이러스와 항 체 (왼쪽된 열), 부정적인 컨트롤 상황에서 발생 하 고 적혈구 인플루엔자 바이러스 (중간 열)의 존재만 hemagglutinate. 그러나, 조류 독감 바이러스의 바이러스 특정 항 체 다음 아무 hemagglutination에 의해 차단 되는 때 (오른쪽 열)을 발생할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

참고: 사용 하는 Rbc 분석 결과 (표 1)에서 인플루엔자 바이러스의 종류에 따라 달라 집니다. 또한, 96-잘 마이크로 titer 접시의 다양 한 종류, 보육 시간 뿐만 아니라 비 agglutinated 셀의 모양을 (표 2) 다.

인플루엔자 항 원A/캘리포니아/7/09 (H1N1)A/스위스/9715293/2013 (H3N2)A/텍사스/50/2012 (H3N2)B/브리즈번/60/08B/매사 추세 츠/02/2012
RBC 종치킨기니 돼지기니 돼지터키터키

표 1: 인플루엔자 항 원 및 해당 종의 Rbc. 제조업체의 지침 (NIBSC) 따라.

RBC 종치킨터키기니 돼지인간의 유형 O
Rbc (v/v)의 농도0.75%0.75%1%1%
결정 접시의 유형V 하단V 하단U 하단U 하단
보육 시간, RT30 분30 분1 시간1 시간
비 agglutinated 셀의 모양버튼 *버튼 *헤일로헤일로

표 2: Rbc의 다른 종족과 조건 시험. WHO 프로토콜에 따르면. (* 기울이면 흐름).

  1. RBC 서 스 펜 션의 준비
    1. RBC 재고 현 탁 액 희석 (10%, v/v; 인간의 유형 O를 제외 하 고) ( 재료의 표참조)와 성 식 염 수 (PBS) 0.75%와 1%의 조류 및 포유류 RBCs에 대 한 적절 한 농도 각각 있도록 버퍼링.

figure-protocol-2
그림 2 : 하 분석 결과의 디자인 접시. HA 적정 중복에서 수행 됩니다. 아니 항 제어 행에 추가 되었습니다. 또한 최고의 항 원 농도의 결정에 대 한 그림 4 를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 96-잘 마이크로 Titer 접시의 준비
    참고: 격판덮개 디자인에 대 한 그림 2 를 참조 하십시오.
    1. (그림 2) 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 PBS의 25 µ L 96 잘 마이크로 titer 플레이트의 사용된 행 각의 우물 1 ~ 12를 추가 합니다. V 모양의 마이크로 titer 플레이트를 사용 하 여 닭 및 칠면조 같은 조류 Rbc 작업할 때. U 자 모양의 마이크로 titer 플레이트를 사용 하 여 포유류 Rbc, 기니 피그와 인간의 유형 O 처럼 (표 2)와 함께 작업 하는 경우.
    2. 중복에서 배열 되는 항 원 행, 첫 번째 우물에 인플루엔자 항 원의 25 µ L를 추가 합니다. 아니 항 제어 행에 추가 됩니다. 컨트롤 행 하지 hemagglutination 효과 표시 하 고 부정적인 컨트롤 (그림 2)으로 제공 해야 합니다.
    3. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 연속 웰 스 항 원 행의 첫 번째 우물에서 25 µ L를 전송 하 여 직렬 2-fold 희석을 수행 합니다. 부드럽게 10 번 위아래로 pipetting으로 각 희석 단계를 혼합.
    4. 최근 웰 스의 최종 25 µ L를 삭제 합니다.
    5. 잘 당 50 µ L의 총 볼륨에 도달 하기 위해서는 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 사용된 하는 각 행의 웰 스 1 ~ 12에 PBS의 25 µ L를 추가 합니다.
    6. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 잘 사용 하는 각 증권 서 스 펜 션의 50 µ L를 추가 합니다.
    7. 누릅니다 접시 신중 하 게 10 번 혼합 모든 4 개의 측에.
    8. 뚜껑을 가진 접시를 커버 하 고 는 RBC 종 사용된 (표 2참조)에 따라 시간의 적절 한 금액에 대 한 실 온에서 품 어. 잠복기 동안 접시를 이동 하지 마십시오.

figure-protocol-3
그림 3 : 조류 및 포유류 RBCs의 교착 패턴. V 모양의 마이크로 titer 접시 조류 RBCs를 작업할 때 사용 됩니다. 판독 기울이면된 플레이트 위치에서 수행 되 고 비 agglutinated Rbc 형성 눈물 모양 아래로 실행 시작. U 자 모양의 결정 플레이트 포유류 RBCs를 작업할 때 사용 됩니다. 판독 비 기울이면 위치에서 다음 수행 하 고 비 agglutinated Rbc 형성 작은 후광. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 접시를 읽고
    참고: 다른 모양의 마이크로 titer 우물 (그림 3) 때문에 포유류 RBCs에 비해 조류 RBCs를 사용 하 여 판독은 약간 다릅니다.
    1. 조류 RBCs의 판독
      1. 플레이트 25 90 ° 기울기 s.
        참고: 모든 세 가지 유형의 교착 패턴 (완전히 agglutinated, 부분적으로 agglutinated 및 비 agglutinated) 하지 기울이면 버튼으로 표시 하기 때문에 조류 패턴의 분화에 대 한 중요 한은 접시를 기울이기.
      2. 접시는 96 잘 접시의 인쇄 방식에 기울어진된 위치에 아직도 하는 동안 결과 즉시 표시 합니다. 조류 RBCs의 교착 패턴은 그림 3에 나와 있습니다.
    2. 포유류 RBCs의 판독
      1. 플레이트 (벤치에 수평 위치)을 기울이기 없이 96 잘 접시의 인쇄 방식에 결과 표시 합니다.
        참고: hemagglutination 경우 agglutinated 셀 할 침전 하지 아래로, 반면 비 agglutinated 셀 아래쪽 우물의 후광으로 나타납니다. 부분적으로 agglutinated 셀의 후광 덜 강렬 하 고는 더 큰 직경 (그림 3).
    3. 4 HA 단위의 결정입니다.
      참고: HA 적정 끝점은 마지막 잘 완전 한 hemagglutination 발생 합니다. 이것 잘 바이러스의 1 하 단위를 포함 한다. 항 원의 2-fold 희석 하 적정 끝점 앞서 두 우물 이므로 바이러스 (그림 4)의 4 하 단위를 포함 하는 우물.

figure-protocol-4
그림 4 : 4 HA 단위의 titer를 결정 하기 위해 조류 Rbc와 HA 적정의 판독. Hemagglutination에 필요한 최적의 항 원 금액 hemagglutination 분석 결과 (항 원 적정 분석 결과)에 의해 측정 됩니다. 완전 한 hemagglutination가 발생 하는 마지막 잘 하 적정 끝점 이며 1 하 단위를 포함 합니다. 항 원, HA 적정 끝점 앞서 두 우물의 2-fold 희석 때문에 titer 4 하 단위에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

5. 안녕하세요 분석 결과

참고: 프로토콜의 작업 흐름은 동시에 여러 개의 샘플의 더 효율적인 처리를 허용, PCR를 사용 하 여 튜브 줄무늬 고 열 cycler (아래 참조)에 최적화 되었습니다.

  1. 혈 청 샘플의 준비
    참고: BSL-2 실험실에서 혈 청 샘플 준비.
    1. 모든 사람의 각 시간 점의 냉동된 혈 청 샘플을 녹여 (단계 1.2 참조) 실내 온도에.
    2. PCR 튜브 스트립 (1 개의 지구에 있는 10-튜브) 튜브를 각 해 동된 혈 청 샘플의 10 µ L의 약 수를 추가 합니다.
      참고: 큰의 PCR 튜브 스트립을 사용 하 여 장점은 멀티 채널 피 펫이 분석 결과;의 다음 단계에 사용할 수 있습니다. 이 때 많은 양의 혈 청 샘플을 테스트 및 다른 바이러스 변종에 대 한 항 체 titers에 대 한 동일한 샘플의 측정을 반복 수행 하는 경우 시간을 많이 저장 합니다.
    3. -80 ° C에서 PCR 튜브 스트립 사용까지 aliquoted 혈 청 샘플을 저장 합니다.
    4. 이 분석 결과 수행 하기 전에 1 일 실 온에서의 혈 청 샘플 aliquots 녹여.
    5. 빈 PCR 튜브에 적절 한 항 혈 청의 10 µ L를 추가 합니다.
      참고: 긍정적인 통제로 봉사 하는 특정 바이러스에 대 한 항 혈 청 사용된 바이러스를 일치 해야 합니다. 긍정적인 통제 여러 접시에 접시 성능의 표준화에 대 한 수 있습니다.
    6. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 30 µ L 콜레라 filtrate 솔루션의 각 혈 청 약 수를 항 혈 청 (혈 청의 1 볼륨을 콜레라 filtrate의 3 볼륨)을 추가 합니다.
    7. PCR 96 잘 랙 또는 빈 팁-상자와 5 소용돌이에 PCR 튜브를 계속 s.
    8. 사용 하 여 열 cycler 37 ° C에서 하룻밤 샘플을 품 어.
    9. 콜레라 filtrate 열 cycler를 사용 하 여 비활성화를 30 분 동안 56 ° C에서 샘플을 품 어.
      참고: 열 cycler에 따라이 단계는 과정을 더 자동화를 프로그래밍할 수 있습니다.
    10. PCR 96 잘 랙 또는 빈 팁-상자와 5 소용돌이에 PCR 튜브를 계속 s.
    11. 이 분석 결과 대 한 사용까지 냉장고에 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

figure-protocol-5
그림 5 : 디자인 및 워크플로이 분석 결과의 접시. 한 접시에 2 명의 사람들의 5 시간 포인트를 측정할 수 있습니다. 안녕 titer 1024 8에서 배열 한다. 사용된 항 원의 항 혈 청 긍정적인 제어로 역임 하 고 다시 적정 항 원 희석 4 하 단위 같음 경우 확인 위해 수행 되었습니다. 혈 청 샘플의 직렬 희석 2 개별 백신 받는 사람에 대 한 표시 됩니다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 안녕하세요 분석 결과
    참고:이 분석 결과의 원리의 삽화 그림 1참조. 바이러스, 따라 Rbc의 종 분석 결과 (표 1)에 사용 됩니다. Rbc의 종 96 잘 접시의 다양 한 종류에 사용 되 고 부 화 시간 뿐만 아니라 비 agglutinated 셀의 모양을 다릅니다 (표 2). 이 분석 결과 대 한 바이러스의 항 원 4 하 단위는 샘플의 2-fold 희석 시리즈에 추가 됩니다.
    1. 항 원 솔루션의 준비
      1. 계산 사용 하는 96 잘 접시의 수에 따라 필요한 항 원 솔루션의 볼륨 (25 µ L 항 원 당 96 잘 접시; 잘 × 96 = 2400 µ L 항 원 당 100 µ L 플레이트 멀티 채널 피 펫;에 대 한 저수지의 사용으로 인해 추가 당 추가 총 antige의 2.5 mL 접시 당 n)입니다.
        참고: 예를 들어 100 세럼 샘플을 측정 하는 경우 다음 10 접시는 필요한 (접시 당 10 샘플): 항 원 솔루션 총에서 필요의 2.5 mL x 10 = 25 mL.
      2. PBS를 사용 하 여 계산 된 볼륨에 대 한 4 HA 단위의 적절 한 희석을 준비 합니다.
        참고: 4 하 단위 하 분석 결과 대 한 결정 됩니다. 적절 한 양의 항 원에 대 한 계산된 볼륨 4 하 단위 해당 titer 나눕니다. 예를 들어 4 하 단위 1/64의 희석에 해당 하 고 우리가 필요한 15000 µ L 항 원 솔루션의 필요: 15000/64 = 234.4 녹아 동결 건조 된 인플루엔자 항 원의 µ L 추가 됩니다.
    2. RBC 서 스 펜 션의 준비
      1. RBC 서 스 펜 션 사용 96-잘 마이크로 titer 번호판의 수에 따라 필요한 양의 계산 (50 µ L RBC 정지 당 96 잘 접시; 잘 × 96 = 4800 µ L RBC 정지 당 200 µ L 플레이트 멀티 채널 피 펫에 대 한 저수지의 사용으로 인해 추가 당 추가) .
      2. RBC 재고 현 탁 액 희석 (일반적으로 10%, v/v; 인간의 유형 O를 제외 하 고) 각각 0.75%와 1%의 조류 및 포유류 RBCs에 대 한 적절 한 농도 만들기 위해 PBS를 가진.
    3. 96-잘 마이크로 titer 접시의 준비
      1. 레이블을 96 잘 마이크로 titer 플레이트 (샘플 ID, 긍정적인 제어, 그리고 다시 적정). 그림 5 의 접시 방향을 신중 하 게 확인 하시기 바랍니다.
      2. "다시 적정" 행 (그림 5, 12번째 행)의 첫 번째 음을 제외 하 고 모든 잘을 PBS의 25 µ L를 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여.
        참고: 다시 적정 사용된 항 원 희석 4 하 단위 같음 경우 확인 위해 수행 되었습니다. 4 HA 단위의 항 titer 표시 됩니다 hemagglutination 발생 합니다 4에 "다시 적정" 행의 처음 세 개의 우물만 잘.
      3. "다시 적정" 행 (12번째 행)의 첫 번째 잘 준비 된 항 원 솔루션 (5.2.1 참조)의 50 µ L를 추가 합니다.
      4. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 접시에 1 ~ 10 행의 첫 번째 우물을 RDE 치료 혈 청 샘플의 25 µ L를 추가 합니다.
      5. 긍정적인 통제로 11번째 행의 첫 번째 우물에 적절 한 항 혈 청의 25 µ L를 추가 합니다.
      6. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 연속 웰 스 (1-12) 각 행의 첫 번째 우물에서 25 µ L를 전송 하 여 직렬 2-fold 희석을 수행 합니다. 위쪽 및 아래쪽 각 희석 단계에 대 한 10-15 회를 pipetting으로 혼합. 같은 팁 샘플 당 각 희석 단계에 사용할 수 있습니다.
      7. 최근 웰 스의 최종 25 µ L를 삭제 합니다.
      8. 행 1 ~ 11 (혈 청 샘플 및 항 혈 청)의 각 음에 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 항 원 솔루션의 25 µ L를 추가 합니다. 그들은 우물을 만지지 않는 경우 같은 팁을 사용할 수 있습니다.
      9. "다시 적정" 행 (12번째 행)의 각 음에 항 원 대신 PBS의 25 µ L를 추가 합니다.
      10. 누릅니다 접시 신중 하 게 10 번 혼합 모든 4 개의 측에.
      11. 뚜껑을 가진 접시를 커버 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어. 잠복기 동안 접시를 이동 하지 마십시오.
      12. 모든 우물에 RBC 서 스 펜 션의 50 µ L를 추가 합니다.
      13. 누릅니다 접시 신중 하 게 10 번 혼합 4 면 모두에.
      14. 뚜껑을 가진 접시를 커버 하 고 는 RBC 종 사용된 (표 2참조)에 따라 시간의 적절 한 금액에 대 한 실 온에서 품 어. 잠복기 동안 접시를 이동 하지 마십시오.
    4. 접시를 읽고
      참고: 안녕 titer (안티-) 혈 청을 완전히 억제 hemagglutination의 마지막 희석의 역 이다. 그것은 RDE 취급 세라 1: 4와 직렬 희석 단계 후에 이미 희석 했다, 첫 번째 스에서 세라 희석된 1:8, 8의 안녕 titer에 해당 하는 고려 하는 것이 중요.
      1. 조류 RBCs의 판독
        1. 플레이트 25 90 ° 기울기 s.
          참고: 모든 세 가지 유형의 교착 패턴 (완전히 agglutinated, 부분적으로 agglutinated 및 비 agglutinated) 하지 기울이면 버튼으로 표시 하기 때문에 조류 패턴의 분화에 대 한 중요 한은 접시를 기울이기.
        2. 접시는 96 잘 접시의 인쇄 방식에 기울어진된 위치에 아직도 하는 동안 결과 즉시 표시 합니다. 조류 RBCs의 교착 패턴은 그림 3에 나와 있습니다.
      2. 포유류 RBCs의 판독
        1. 접시를 기울이기 없이 96 잘 접시의 인쇄 방식에 결과 표시 합니다.
          참고: hemagglutination 경우 agglutinated 셀 할 침전 하지 비 agglutinated 셀 아래쪽 우물의 후광으로 표시 하는 반면. 부분적으로 agglutinated 셀의 후광 덜 강렬 하 고는 더 큰 직경 (그림 3).
        2. 각 샘플의 안녕을 확인 하 고 컴퓨터 기반 테이블 (그림 6)에 전송
        3. 참고: 부분적으로 agglutinated 우물 낮은 titer로 결정 했다. 예를 들어 혈 청 샘플 완전히 억제 잘 4까지 hemagglutination (1: 64 희석)와 5일 잘 하는 경우 (모범 희석) agglutinated 부분적으로 다음이 titer 최종 분석 (그림 6에 대 한 낮은 titer 64로 설정 되어 4번째 행)입니다.

figure-protocol-6
그림 6 : 조류 Rbc와이 분석 결과의 판독. 사전 및 사후 예방 접종 독감이 분석 결과 의해 결정은 특정 항 체 응답을 유도 한다. 이 예제에서는 한 사람이 두 사람 보다 더 높은 titers 합니다. 두 사람; 예방 접종 후 항 체 응답을 보여 두 사람의 항 체 titers 다시 감소 예방 접종 후 180 일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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결과

인플루엔자 A H3N2에 대 한 사전 및 사후 예방 접종 유도 항 체 응답
백신 유발 항 체 응답 26 건강 한 자원 봉사자는 사 3가 소 단위 독감 백신을 접종, 포함 된 인플루엔자 A/H1N1/캘리포니아/2009 A/H3N2/텍사스/2012, B/매사 추세 츠/02/2012는 2014 이전에 평가 되었다 / 2015 독감 시즌입니다. 그림 6 2 백신 수령인의 대표적인 예를 보여 줍니다. 흥미롭게도, 그 특정 독감 시즌 동안 A/H3N2/텍사스/2012는 순환 하지, 그리고 시즌 다소 다른 바이러스 성 긴장을 포함 하는 대신: A/H3N2/스위스/2013. A/H3N2/텍사스/2012 A/H3N2/스위스/2013의 바이러스 성 조류 97% 순서 신원 표시 하 고 단지 11 아미노산 ( 표 4참조), 그 위치는 그...

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토론

사전 및 사후 예방 접종 독감 바이러스 titers 특정 항 체의 정량화 백신 연구에 필요한 중요 한 도구입니다. Seroprotection 같은 바이러스 감염에 대 한 보호의 대리 측정에 따라 (> 1시 40분) 또는 혈 (4-fold titer 증가), 예방 접종 전략 수9에 최적화 된. 제공 된 프로토콜을 사용 하 여 확인할 수 있습니다: (i) 특정 바이러스, 및 (ii) 항 체 titers 관심의 바이러스에 대 한 hemagglutination 잠재력.

수정 및 문제 해결:

이 프로토콜은 WHO 표준12를 기반으로 합니다. 우리는 혈 청 준비 (단계 5 참조)에 대 한 PCR 튜브 스트립을 사용 하 여 프로토콜을 수정. 이 수정 도움을 크게 줄이고 작업 분석 결과의 처리량을 증가. 또한, 우리 비용 효과적인...

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공개 사항

A.E.에 의해 지원 되었다 연구 보조금 (PZ00P3_154709), "SNSF Ambizione 점수" 프로그램에서 "Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte" 바젤의 대학, Stiftungsinfektionskrankheiten 바젤, 및 Bangeter Rhyner 재단. L.K. 기술 대학의 그라츠, 오스트리아의 교부 금에 의해 지원 되었다. : J.L. 시스템 생물학 프로그램 (9번째 전화)에서 SystemsX.ch 이니셔티브의 iPhD 친교에 의해 지원을 인정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
25ml 일회용 멀티채널 피펫 저장소Integra4312
8웰 PCR 튜브브랜드 GMBH781332혈청 분취액
96웰 마이크로타이터 플레이트, U자형TPP92097포유류 적혈구 사용 시 HI 분석용
96웰 마이크로타이터 플레이트, V자형Corning Costar3897조류 적혈
구 사용 시 HI 분석용아쿠아 광고 iniect. SterilBichsel AG1000004인플루엔자 항원 및 콜레라 여과액 용액 제조용
닭 RBC(10%)CedarlaneCLC8800Alsever의 용액에서 닭 적혈구 10% 현탁
콜레라 여과액Sigma-AldrichC8772수용체 파괴 효소(RDE)로 사용
Dulbecco의 PBSSigma-AldrichD8537혈청 시료, 적혈구 및 항원 희석용
Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µ lSigma-AldrichZ683949
Eppendorf 멀티채널 피펫, 8채널, 10-100 &마이크로; lSigma-AldrichZ683930
Guinea Pig RBC (10%)CedarlaneCLC1800Alsever의 용액에서 기니피그 적혈구의 10% 현탁
Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum NIBSC14/134 HI 분석에서 positive control로 사용
인플루엔자 Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum NIBSC14/272HI 분석
Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum에서NIBSC13/178HI 분석
Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum 에서NIBSC13/254 HI 분석에서 positive control로 사용
인플루엔자 Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA 세럼 NIBSC13/182HI 분석에서 양성 대조군으로 사용됨
인플루엔자 항원 A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) NIBSC12/168비활성화, 부분 정제 A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)  바이러스 (ca. 46µ gHA/ml)
인플루엔자 항원 A/스위스/9715293/2013 (NIB88)NIBSC14/254불활성화, 부분 정제 A/스위스/9715293/2013 (NIB88) 바이러스 (ca. 55µ gHA/ml)
인플루엔자 항원 A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223)NIBSC13/112불활성화, 부분적으로 정제된 A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) 바이러스 (ca. 74µ gHA/ml)
인플루엔자 항원 B/Brisbane/60/2008NIBSC13/234불활성화, 부분 정제 B/Brisbane/60/2008 바이러스(ca. 42µ gHA/ml)
인플루엔자 항원 B/Massachusetts/02/2012NIBSC13/134불활성화, 부분적으로 정제된 B/Massachusetts/02/2012 바이러스(ca. 35µ gHA/ml)
혈청 튜브S-Monovette, Sardstedt01.1601.100응고 활성제를 사용한 혈청 추출용
단일 기증자 인간 적혈구, 유형 0혁신적인 연구IPLA-WB3 Alsever's solution에서 단일 기증자 인간 적혈구의 현탁액(약 26%)
터키 RBC (10 %)CedarlaneCLC1180에서 칠면조 적혈구의 10 % 현탁
Gibco
액 액 는 양성 대조군으로 사용됩니다. 양성 대조군으로 사용됨; Alsever의 용액 인산염 완충 식염수 (PBS)액

참고문헌

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