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방법 논문

삼투압 펌프 또는 직접적인 근육 주사를 이용한 피하 뉴로트로핀 4 주입으로 노화 후두 근육 강화

8.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55837

⸱

2017년 6월 13일

 ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation Sciences, University of Kentucky, 2Department of Physiology, University of Kentucky

이 논문에서

요약

여기에서 우리는 쥐 노화 후두 근육을 재구성하기 위해 전신적으로 그리고 직접적으로 뉴로 트로 핀 4 (NTF4)의 사용을 기술하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

노인에서 후두 장애는 음성 장애에서부터 연하 장애로,기도 보호 반사 신경 장애로 이어집니다. 연령 관련 후두 근육 기능 장애를 표적으로하는 치료법은 거의 없습니다. 뉴로 트로 핀 (neurotrophin)은 근육 신경 분포 및 신경근 접합부 (NMUs)의 분화에 관여합니다. 뉴로 트로 핀은 신경 전달 물질 방출을 증가시킴으로써 신경근 전달을 향상시키는 것으로 생각됩니다. neuromuscular junctions (NMJs)는 노화 된 쥐의 후두 근육에서 작고 덜 풍부 해지고, 기능적 소실의 증거가 있습니다. 우리는 노화 후두 근육의 기능을 향상시키는 치료제로서 미래의 임상 적 사용을위한 NTF4의 효과를 탐구했다. 여기서는 NTF4 적용에 대한 반응으로 쥐의 두드러기 후두 근육이 재 형성되는 능력을 조사하기 위해 NTF4의 전신 투여 및 직접 주사에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법에서는 쥐가 NTF4를 전신적 으로 o자극적 인 펌프 또는 성대를 통한 직접 주입에 의한 것입니다. 후속 근육을 절개하여 형태학 및 연령 관련 소실에 대한 조직 학적 검사에 사용 하였다.

서론

후두 근육은 신속하고 지속적으로 수축하며 노화의 부작용에 취약합니다. 이 지속적인 활동은 65 세 이상의 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 명에서 관찰되는 목소리 문제 또는 연하 장애에 기여하는 것으로 생각됩니다. 몇 가지 분자 및 pathophysiologic 메커니즘이 나이 관련 기능 장애에 기여한다. 이러한 메커니즘은 후두 점막의 재건, 근육 섬유 위축 또는 손실, 성대의 굽힘과 성문 폐쇄의 원인이되는 근섬유 재생 또는 위축의 결핍을 포함 할 수 있습니다 8 , 9 , 10 , 11 . 현재로서는 입증 된 의학 요법이 없습니다.이러한 근육의 연령 관련 변화를 철저히 예방하거나 재활시킵니다.

신경근 전달의 효과를 조절하면 신경 모터의 성능에 큰 영향을 줄 수 있습니다. 뉴로 트로 핀의 계열은 신경 성장 인자 (NGF), 뇌 파생 신경 성장 인자 (BDNF), 뉴로 트로 핀 3 (NTF3) 및 NTF4 12 , 13을 포함 한다. 뉴로 트로 핀은 시냅스 효능을 조절하는 것으로 나타났습니다. 간세포 성장 인자, 형질 전환 성장 인자 베타 및 섬유 아세포 성장 인자는 최근 성대 흉터 치료를 위해 인간에서 사용되어왔다. NTF4는 또한 NMJ 효과를 조절합니다. NTF4가 결핍 된 마우스는 해체 된 NMJs 11 , 18 , 19를 보여준다. 이 연구는 치료자의 유망한 효과를 가져옵니다고령화 된 후두 근육 장애 및 성장 인자로 인한 노화.

성대 주름의 조직에 대한 직접 주사 치료제는 인간에게 전례가 없습니다. 예를 들어, 보툴리누스 독소의 국소 주사는 경련성 발성 장애 및 양측 재발 성 후두 신경 마비와 같은 후두 근육에 영향을 미치는 신경 학적 운동 장애에 대한 효과적인 치료법으로 현재 사용되고 있습니다 20 , 21 . Hyaluronic acid hydrogel은 보컬 폴드 징후와 성문 기능 부전을 치료하는 데 사용되는 또 다른 주사제입니다 22 , 23 . 주사 후두 성형술은 다양한 의사 소통 장애 치료에 사용될 수 있습니다 24 . 이러한 직접적인 주사 방법은 노령 인구에서 보컬 기능과 삼킴을 향상시킬 수 있습니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 대해 6 개월에서 30 개월 된 수컷 Fischer 344-Brown Norway 쥐를 사용하십시오. 랫트는 국립 늙은 쥐 서식지 연구소 (National Institute of Aging)의 설치류 식민지에서 얻은 것이다. 랫트 후두의 구조는기도 보호 및 종 특이 적 발성을 위해 기능적으로 작용하는 인간의 것과 유사하기 때문에 본 연구를 위해 쥐를 사용했다.이 연구는 실험실 동물의 인간애 관리 및 사용에 관한 PHS 정책에 따라 수행되었으며, 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NIH 안내서 및 동물 복지법 (7 USC 외); 동물 사용 프로토콜은 University of Kentucky의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었습니다.

1. 쥐의 마취

  1. 완충 식염수에 ketamine hydrochloride (해리 성 마취제)와 xylazine hydrochloride (진정제 및 진통제)를 혼합하여 마취약을 준비합니다. 최종 용액에서 ketamine과 xylazine의 농도는 kg 당 100 mg / 8 mg체중 각각.
  2. 25G 바늘과 주사기를 사용하여 intraperitoneal 투여하여 쥐에 마취제를 주사.
  3. 쥐가 포셉과 발가락이나 발을 꼬집어 의해 충분히 anesthetized 있는지 확인하십시오. 쥐가 꼬집음에 반응하지 않으면 수술을 시작할 수 있습니다. 쥐가 반사 또는 근육 수축으로 발가락 핀치에 반응하면 1 ~ 2 분을 기다렸다가 핀치 테스트를 반복하십시오. 쥐가 다시 반응하면 쥐를 새 동물로 바꾸고 1.2 단계부터 시작하여 절차를 반복하십시오.
  4. 쥐가 움직이지 않으면 각막이 마르지 않도록 쥐의 눈에 안 연고를 바릅니다.

2. 삼투압 펌프 이식

  1. 쥐를 무균 수술 부위에 복강으로 놓습니다. Preanesthetic 약물로 meloxicam를 관리하십시오. 25G 주사 바늘이 달린 주사기를 사용하여 체중 1kg 당 1-4mg의 용량으로 복강 내 투여.
  2. 클리퍼를 사용하여 근사치 제거목 뒤에서 모피 1 "x 1"정사각형, 어깨 사이에 약 1 "꼬리 공간. 가능하면 피부 가까이에 면도하십시오.
  3. 에탄올 소독 (70 %)으로 목과 뒷부분을 적시십시오.
  4. 면도 후, 알코올로 요오드 - 알코올 마무리를 연속적으로 3 번 문지르면 목의 등면을 문지릅니다.
  5. 34 ° C로 설정된 가열 패드 위에 놓아 쥐의 체온을 유지하십시오.
  6. 전신 NTF4 처리를 위해 50 μL의 NTF4 또는 식염수로 무균 처리 된 삼투 펌프를 채 웁니다 ( 그림 1 ).
    1. 메스를 사용하여 피부를 가로 지르는 약 2cm의 수평 절개를하고, 견갑골 사이의 공간으로 단지 두개의 절개를하십시오. 한쪽 손으로 겸자로 절개의 후부 가장자리를 들어 올리면서 hemostats의 팁을 삽입하고 절개 부분을 부드럽게 밀어 넣습니다.
    2. 지혈 기 끝이 약 2 cm c목덜미를 절개 부위에 놓고 지혈대의 손잡이를 열어 절개 부위의 피하에 중공 "포켓"을 형성하도록 팁을 확장시킵니다. 이것은 펌프의 배치 사이트가됩니다.
  7. NTF4의 상호 작용과 포켓 절개 부위의 치유를 최소화하기 위해 삽입시 펌프 전달 포털 끝을 먼저 배향하십시오.
  8. NTF4 생리 식염수 50 μL를 7 14 일 동안 전달하십시오. 7 일군은 6.72 mg / day의 NTF4를 투여 받았고 총 용량은 47.04 mg이었다. 14 일군은 6.72 mg / 일을 투여 받았고 총 용량은 94.08 mg NTF4 25 이었다.
  9. 5-0 나일론 봉합사, hemostats 및 포셉 펌프 배치를 위해 만들어진 절개를 닫습니다.
  10. 마취에서 회복되면서 최소 30 분 동안 쥐를 관찰하십시오. 모니터링 완료 기준은 동물이 활성화되고, 새장 주위로 이동하고, 식수를 공급하고, 정리와 같은 기타 정상적인 활동을 시작하는 것을 포함합니다.
  11. 매일 동물 관찰수술 부위의 치유, 정상적인 사료 및 물 소비, 소변 / 대변 통과, 스트레스, 통증 또는 기타 수술후 합병증의 비정상적인 행동 징후를 관찰하여 첫 주.
  12. 쥐가 통증이나 고통을 겪고있는 것으로 나타나면 통증 완화를 위해 최대 24 시간마다 carprofen을 5 mg / kg 피하 주사하여 5 일 동안 투여하십시오.
  13. 감염이있는 경우 수의사와상의하여 상처가 적절하게 치료되도록하십시오.
  14. 어떤 실험 그룹에 따라 쥐가에 스레드에서 자극을 방지하기 위해 수술 후 7-10 일 5-0 나일론 봉합을 제거합니다.

3. 직접 주입을위한 쥐의 마취

  1. 수술 전날 밤에 쥐에게서 음식물을 보류하십시오. 이렇게하면 내시경이나 주사 바늘을 막을 음식이 없습니다.
  2. 쥐를 체중을 줄이고 아세 롤마 민 1 ~ 2 mg / kg 체중을 준비하십시오. 근육 주사로 주사하십시오 (IM 위치는thyroarytenoid 근육을 떠났다.
  3. 유도 상자에 쥐를 놓으십시오. 5 % isoflurane과 1 LO 2로 유도 상자에서 마취를 유도하십시오.
  4. 2 % isoflurane과 600mL O 2 를 사용하여 쥐 원추로 쥐를 이동하십시오.
  5. 쥐가 포셉과 발가락이나 발을 꼬집어 의해 충분히 anesthetized 있는지 확인하십시오. 쥐가 핀치에 반응하지 않으면 주사 프로토콜을 시작할 수 있습니다. 쥐가 반사 또는 근육 수축으로 발가락 핀치에 반응하면 1 ~ 2 분을 기다렸다가 핀치 테스트를 반복하십시오. 쥐가 다시 반응하면 쥐를 새 동물로 바꾸고 단계 3.4부터 시작하여 절차를 반복하십시오.

4. 직접 주입 및 시각화

  1. NTF4 또는 생리 식염수가 포함 된 무균 적으로 준비한 50 μL 용량을 주사하기 전에 30 분 동안 25 ° C로 설정된 H2O 배스에 놓습니다.
  2. 플렉시 유리 플랫폼 ( 그림 2 )에서 쥐를 앙와위 자세로 올려 놓습니다. Sus플랫폼의 꼭대기를 가로 지르는 가이드 와이어를 통해 정면 상단 절치에서 젖혀지는 자세로 쥐를 지키십시오.
  3. 50 mm, 30 게이지, 100 μL 주사기를 1.9 mm, 30 ° sinus 내시경에 부착하십시오 ( 그림 3 ).
    참고 : 주사기 어셈블리는 내시경의 외벽에 캐뉼라를 단단히 고정하는 지그를 통해 부착됩니다. 내시경은 성대의 시각화 및 구강 내 주사기 안내를 허용합니다. 각 동물에 앞서 캐 뉼러 팁의 위치를 ​​조정하여 팁이 내시경보기를 통해 완벽하고 명확하게 보이는지 확인합니다 ( 그림 4 ).
  4. 혀를 연장하고 그것을 옆으로 움직이려면 고무로 깎은 한 쌍의 집게를 사용하십시오. 그런 다음 구강 개통을 유지하기 위해 플라스틱 견본을 삽입하십시오. 1.5 ~ 2 cm 길이로 자른 5 mL 플라스틱 시린지 배럴에서 검체를 만들고, 절단 된 가장자리는 떨림을 제거하고 부드럽게 연마합니다.
  5. 루아의 조명을 끄십시오.할로겐 광원을 내시경에 부착하십시오. 비디오 레코더를 켜서 절차를 캡처하십시오.
  6. 쥐의 입에 넣을 때 유리 팁에 결로 현상을 최소화하기 위해 내시경의 말단을 따뜻한 물에 몇 초 동안 담그십시오.
  7. 모니터의 시각적 피드백을 사용하여 바늘을 왼쪽 성대 영역으로 조심스럽게 당깁니다.
  8. 성대에 완전히 접근하기 위해 동물 호흡주기의 흡기 단계로 용액 주입을 시간을 재십시오. 호흡의 흡기 단계에서 성대가 완전히 노출됩니다.
    1. 성대가 완전히 보이면, 바늘을 음성 골격의 흰색 중앙 가장자리 옆쪽에있는 왼쪽 thyroarytenoid에 삽입하십시오. 주사 바늘을 제 위치에 놓고 주사기의 우울증을 통해 주사액을 전달하십시오.
  9. 내시경과 비디오 플레이어의 할로겐 광원을 끄고 ro를 다시 켭니다.옴 조명.
  10. 쥐를 집에 넣고 가열 패드에 놓습니다.
  11. 발열 패드에서 제거하기 전에 쥐가 회복되도록하십시오. 새장에서 음식과 물을 교체하십시오.
  12. 주입 후 7 일 동안 래트를 모니터링 한 다음 안락사하십시오. 절제를위한 후두 제거 24 .

5. 쥐의 안락사

  1. 쥐를 케타민 하이드로 클로라이드 및 크 실라 진 하이드로 클로라이드 (체중 kg 당 100mg / 8mg 복강 내 주사)로 마취시킨다.
  2. 내측 thoracotomy 다음 exsanguination에 의해 안락사.

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결과

2 주 동안 삼투압 펌프를 주입하거나 NTF4를 직접 주입 한 후 1 주일 동안 랫트를 안락사시켰다. 후두를 수확하고 동결 방지제 (30 % 자당 및 70 % 인산 완충 생리 식염수)에 넣은 다음 저온 유지 장치를 사용하여 10-μm 폭으로 연속 절편을 만들었습니다. 나이가 들어간 후두 근육은 NTF4 투여로 영향을받습니다 25 . 젊고 오래된 쥐 이외에, 우리는 thyroarytenoid 근육의 주입 된 것과 주입되지 않은 것을 비교했다. 일반적으로 NTF4의 투여 경로에 따라 연령에 따라 섬유 크기가 달라집니다 ( 그림 5 ). 섬유화가 적 으면 치료 후에도 질적으로 관찰됩니다. 노화 된 래트에서 NTF4의 전신 투여 및 직접 적용으로 탈질 된 섬유의 백분율이 감소한다 ( 도 6 ). NMJ의 양도 증가한다 (

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토론

후두 근육은 노화의 부작용에 취약합니다. 이전의 연구들은 수축 기능과 myosin isoform 변이의 변화뿐만 아니라 섬유 크기, 총 섬유 수, 재생 능력, NMJ 크기 및 양 변화에 대한 후두 근육의 변화를 보여주었습니다 4 , 11 , 27 , 30 , 31 . 노화 후두 근육은 신경 영양소의 적용으로 바꿀 수 있습니다. 이러한 변화는 쉽게 측정 할 수 있습니다. 따라서 쥐의 후두 근육은 노화와 성대 질환 / 장애의 영향을 연구하는 데 유용한 모델을 제공합니다. 이 근육의 연구는 또한 노화 된 인간의 개입이나 보호 과정을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.

NTF4를 전신 또는 직...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 난청 및 기타 의사 소통 장애 (R21DC010806에서 CAM 및 JCS로, R01DC011285에서 CAM로)의 국립 연구소로부터의 보조금에 의해 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Neurotrophin 4Pepro Tech450-04200 ng 50 μ L
Alzet Osmotic PumpDURECT Corporation2001D
30° 내시경Stoltz61029D
50 mm 30 게이지 100-μ L 주사기Hamilton84850 및 201812
식염수 (염화나트륨 용액)Sigma-AldrichS8776
케타민 염산염Henry Schein56344
자일라진 염산염Henry Schein33198
25 G 5/8 바늘Becton-Dickinson305901
1 mL 주사기Becton-Dickinson
안과 연고Henry Schein8897
가위Oster44-018
에탄올Decon2716
요오드 (Betadine)Purdue Pharma L.P.
가열 패드Sunbeam731-5
5-0 나일론 봉합스레드 AD SurgicalPMN-518R6
crile hemostatFine Science Tools13005-14
섬세한 봉합사 묶는 집게Fine Science Tools11063-07
meloxicamHenry Schein49756
carprofenMerritt Veterinary Supplies148700
항생제 연고Henry Schein57110
아세프로미진 AceprojectHenry Schein3845
이소플루란 IsothesiaHenry Schein50033
인덕션 박스(마취 상자)Harvard Apparatus50-0116
산소 압축 탱크Scott GrossUN1072
플렉시 글라스 플랫폼Small Parts Inc (Amazon)
고무 팁 겸자미세 과학 도구 고무11075-00
Lowe's42518위의 집게용 액체 고무
(BD 주사기 길이로 절단)Becton-Dickinson309659
할로겐 광원 코뿔소 후두 스트로보스코프Kay-PentaxRLS 9100 B
비디오 레코더Kay-Pentax
자당Sigma-AldrichS0389-500G
인산염 완충 식염수Sigma-AldrichP4417-100TAB
저온 유지 장치 Mictotom HM525Thermo ScientificHM 525
Gill 1 hematoxylinVWR10143-142
Sigma-AldrichS0819
alpha-bungarotoxin alexa fluor 488 conjugateThermo Fisher ScientificB-13422
Shandon eosin-Y alcoholicThermo Fisher6766007
기계스미스 의료CDS 9000
309659606404사 플라스틱 스펙튤라토끼 Texas red-X phalloidin Sigma-Aldrich T7471 소동물 마취에서 생산된 Scientific 항나트륨 채널 Nav1.5 항체

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