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방법 논문

신생아 생쥐의 척수 신경 세포 분리 및 배양

19.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55856

⸱

2017년 7월 11일

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Cardiothoracic Surgery, University of Colorado Anschutz Medical Campus

이 논문에서

요약

이 연구는 WT 신생아 마우스에서 뉴런을 분리하는 기술을 제시합니다. 신생아 마우스에서 척수를주의 깊게 절개 한 다음 기계적 및 효소 적 절단을 통해 척수 조직에서 뉴런을 분리해야합니다.

초록

우리는 척수 신경 세포의 분리 및 배양에 대한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런은 신생아 C57BL / 6 생쥐에서 얻은 있으며 출생 후의 하루 1-3에 격리되어 있습니다. 일반적으로 하나의 번식 쌍에서 태어난 4-10 마리의 강아지가 한 실험을 위해 모여지고, 척수는 isoflurane으로 안락사 한 후에 각 마우스에서 개별적으로 수집됩니다. 척수가 해부 된 다음 척수가 기둥에서 빠져 나옵니다. 척수는 조직에서 방출되는 뉴런 및 다른 세포를 허용 효소 프로 테아 제에 대한 배달의 표면적을 증가시키기 위해 다음 minched 있습니다. 이어서 분쇄를 사용하여 세포를 용액으로 방출한다. 이 용액을이어서 농도 구배로 분획하여 용액 중의 여러 세포를 분리하여 뉴런을 분리시킨다. 하나의 깔짚 그룹에서 약 1-2.5 x 106 개의 뉴런을 분리 할 수 ​​있습니다. 그런 다음 뉴런을 접착제로 코팅 한 우물에 뿌린다적절한 성장과 성숙을 허용하는 rs. 뉴런은 성장 및 배양 배지에서 성숙에 도달하기까지 약 7 일이 걸리고 이후 치료 및 분석을 위해 사용될 수 있습니다.

서론

척수 병리학을 이해하기 위해서는 거시적 인 수준과 미세한 수준 모두에서 다양한 모델을 사용해야합니다. 대형 및 소형 동물 모델 1 , 2 , 3 은 척수 질환 및 상해에 대한 생체 내 조사에 사용됩니다. 생체 내 에서 이러한 문제 를 연구하는 것은 장점이 있지만, 척수 분석은 전체 척수 균질 또는 조직 섹션 4 로 제한됩니다. 이것은 상주 뉴런과 주변 glia 사이의 척수에서 특정 반응과 표적을 격리하려고 할 때 약간의 모호성을 만듭니다. 유 전적으로 조작 된 생쥐가 증가함에 따라 세포 및 분자 수준에서 생물학에 대한보다 상세한 조사가 가능 해졌다. 따라서 신생아 마우스 모델이 여기에 사용 되어 시험 관내에서 척수 뉴런의 독특한 성질과 생물학적 특성을 연구 할 수 있습니다.

엔트 "> 체외에서 뉴런의 분리 및 유지 보수는 특히 간단하지 않습니다. 성인 설치류의 피질 조직에서 뉴런을 분리하기위한 기술이 상대적으로 풍부하여 고립 된 뉴런 ( 즉, 수백만 개 ) 대조적으로, 척수 조직으로부터의 뉴런의 수율은 부분적으로 조직의 질량이 더 적기 때문에 8 , 9 , 10 보다 낮다. 또한, 생쥐에서 신생아의 분리를위한 기술이 상대적으로 부족하다 척수 뉴런 및 기존 방법은 낮은 뉴런 수율 (수백) 또는 배아 마우스 10 의 고립을 요구 힘든 및 자원 무거운 기술에 의해 제한됩니다.

이 프로토콜에서 우리는신생아 생쥐의 척수에서 상당한 수의 뉴런을 비용 효율적이고 자원 효율적으로 격리 할 수있는 기술을 사용하십시오. 이전에 발표 된 기술에서 흔히 볼 수 있듯이 우리는 파파인을 효소 적 프로테아제로 사용하여 척수 조직에서 뉴런의 방출을 허용합니다 5 , 6 . 또한, 우리는 정제 된 세포 분리를 위해 밀도 구배를 사용하는데, 이는 이전에 효과가 6 , 10 인 것으로 나타났습니다. 세포가 배양되는 배지는 다를 수 있지만, 우리의 경험 및 이전에 발표 된 11에서 , 신선한 B27 배양 배지 보충 물은 뉴런 수명에 결정적인 것으로 입증되었다. 뉴런은 일반적으로 치료를 수행 할 수 있도록 최대 10 일 동안 실행 가능합니다.

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프로토콜

이 절차에서 동물의 보살핌과 치료는 콜로라도 대학의 동물 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 솔루션 준비

  1. 표 1 에서와 같이 적절한 온도에서 모든 용액을 준비하고 보관하십시오.

2. 코팅 웰 및 슬라이드

참고 : 뉴런은 플라스틱이나 유리 표면에 잘 부착되지 않습니다.

  1. 뉴런을 분리하기 하루 전에 0.5 ML의 폴리 -D- 리신 (PDL; 표 2 )으로 멸균 된 24- 웰 배양 플레이트의 웰을 코팅하고 층류 후드 O / N에 남겨 둡니다.
    참고 : 선호하는 방법은 24 웰 플레이트를 사용하고 주변 웰에서의 증발이 더 가속화되어 일치하지 않는 결과를 초래하는 경향이 있으므로 중앙 웰만 코팅하는 것입니다. 또한 유리 슬라이드는 이전에 우물 안쪽에 놓을 수 있습니다.o 코팅. 뉴런은 코팅 된 유리 슬라이드에 부착되며 나중에 추가 현미경 이미징을 위해 제거 할 수 있습니다 .
  2. 격리 당일에 우물에서 PDL을 제거하십시오. 남아있는 물을 제거하기 전에 몇 분 동안 멸균 수로 씻어서 1 시간 동안 건조시킵니다 (아래 참조).
  3. 건조 후 슬라이드를 라미닌으로 코팅하십시오 ( 표 2 ).
    참고 : 약 10 μL의 laminin (10 μg / μL)로 멸균 된 24-well plate의 각 well을 코팅 할 수 있습니다. 이것은 전체 웰을 덮기 위해 340 μL의 배지 (총 부피 : 350 μL)와 혼합됩니다. 이것을 문화 후드에서 실온에서 2 시간 동안 놓은 다음 세포를 코팅하기 전에 대기음을 둡니다.

3. 척추 수확

참고 : 모든기구는 멸균을 위해 고압 증기 멸균해야합니다 (135 ° C 및 30 psi에서 4 x 7 분주기).

  1. 이소 플루 란 (isoflurane)이있는 챔버에서 1-3 일 된 C57BL / 6 마우스를 안락사하십시오. 기다림30 초 후에 움직이지 않고 다리를 꼬집고 응답이 없음을 확인합니다.
  2. 머리를 몸체에서 분리하려면 가위를 사용하십시오.
  3. 등받이가 사용자를 향하도록 절차 테이블에서 뒷다리 또는 꼬리와 팔을 안정시킵니다.
  4. 구부러진 홍채 가위로 피부를 자릅니다.
  5. 엉덩이 위의 요추 부위에서 척수를 잘라 내고 흉부의 양측을 절단하여 몸에서 분리하십시오.
    참고 : 이것은 다른 장기에 대한 부주의 한 손상을 피하기 위해 내장 기관에서 척수를주의 깊게 절개해야합니다 ( 그림 1a ).
  6. 과량의 조직을 제거하는 0.2 μm의 필터 멸균 인산염 - 버퍼 식염수 (PBS) 5 ML을 포함하는 3 X 10cm 페트리 접시 10 초 동안 연속적으로 씻으십시오.
  7. 척주의 꼬리 끝에 5 ML의 필터 멸균 PBS로 가득 22 G 바늘과 주사기를 삽입하고 cranially 플러시, 코드를 허용 to 네 번째 배양 접시로 빠져 나간다 ( 그림 1b ).
  8. 얼음 위에서 HABG ( 표 1 ) 5 ML과 15 ML 관에서 척수를 수집합니다. 척수가 부러지지 않도록주의하십시오.
  9. 깔개에있는 각 강아지에 대해 3.1-3.8 단계를 반복합니다.
    참고 : 이상적으로이 과정은 건강한 신경 세포의 분리를 보장하기 위해 척수 당 30 분 미만이 소요됩니다.

4. 고립 뉴런

참고 : 다음 단계는 층류 후드에서 수행해야합니다. 기본적인 멸균 기술에 익숙해야합니다.

  1. 조직 채집
    1. 척수가 들어있는 튜브를 가볍게 흔드는 다.
    2. 튜브에서 조직을 60mm 유리 페트리 접시에 넣고 면도날로 주사위를 굴려 ~ 0.5mm 크기의 미세 조각을 만듭니다.
    3. HABG 5 ML가 들어있는 15 ML 튜브에 와이드 보어 피펫으로 조직을 전송하십시오.
    4. 그것을세포가이 온도에서 평형을 유지하도록 30 분 동안 30 ℃의 수조에서. 세포를 쉐이커에 방치하여 유체에 부유되도록하십시오.
      참고 :이 단계는 얼음에서 소화 매개체로 세포가 옮겨지는 것을 막기 위해 수행됩니다. 세포를 30 ° C로 유지하면 37 ° C에서 신진 대사가 증가하는 것과 관련된 세포 사멸을 감소시키는 데 도움이됩니다.
  2. 소화 매체를 준비하십시오 ( 표 1 ).
  3. 밀도 구배를 준비하십시오 (표 1).
    1. 표 1에 나와있는 것처럼 4 개의 개별 15 mL 튜브에 4 개의 각 층을 준비하십시오.
    2. 새로운 15 mL 튜브에 각 층의 1 mL를 넣으십시오. 하단의 레이어 1부터 시작하여 상단의 레이어 4에 도달 할 때까지 순차적으로 추가합니다. 추가하는 동안 레이어를 방해하지 마십시오.
  4. 2.2 단계에서 PDL 코팅 판을 씻으십시오. 남아있는 물을 제거하기 전에 몇 분 동안 멸균 수로 씻으십시오.1 시간 동안 건조시킨다.
  5. 조직을 소화 배지에 옮기십시오.
    1. 30 ° C의 쉐이커 수조에서 조직 함유 튜브를 제거하고 몇 분 동안 침전되도록하십시오.
    2. 37 ° C 수조에서 소화 매체 튜브를 제거하고 leur-lock 주사기에 대기음을 내십시오.
    3. 조직 함유 튜브에서 과량의 HABG를 기음합니다.
    4. 시린지에 leur-lock 0.2 μm 필터를 사용하여 조직 함유 튜브에 소화 물질을 첨가하십시오.
    5. 튜브를 30 ° C의 수 욕조에 30 분간 놓습니다. 세포가 유체에 매달려있을만큼 충분히 흔들 리도록하십시오.
      참고 : 소화제에 세포를 너무 오랫동안 보관하지 않거나 온도가 너무 높아져 과도한 소화로 이어져 조직이 젤라틴 혼합물에 부유하게 될 수 있습니다.
  6. 이 기간 동안 단계 2.3에서와 같이 라미닌을 코팅하십시오.
    7. <trituration을 수행하십시오 ( 즉 , 세포를 조직에서 분리하는 것).
    1. 흔들어서 30 ° C 수 욕조에서 튜브를 제거하고 몇 분 동안 침전되도록하십시오.
    2. 과량의 소화 매질을 대기음.
    3. HABG 2 ML에 휴지를 일시 중지합니다.
    4. 좁은 구경 피펫을 사용하여 45 초 동안 10 배로 씹습니다.
      참고 : 이것은 아마도 가장 중요한 단일 단계 일 수 있으며 제대로 수행되지 않으면 생산량을 크게 줄일 수 있습니다.
      1. 피펫으로 조직을 대기음 즉시 내용을 다시 비우십시오.
      2. 실용적인 생산량을 현저히 감소 시키므로 공기 주입을 피하십시오.
        참고 : 이상적인 피펫은 9 "유리 피펫입니다 피펫의 끝 부분은 거친 표면을 부드럽게하기 위해 폴리싱해야합니다. 그런 다음 클로로포름에 디클로로 디메틸 실란 (DMDCS)의 1:20 용액에 넣고 실리콘 처리해야합니다. / N 피펫을 꺼내어 공기를 건조시킨 다음,살균을 위해 고압 증기 멸균해야합니다.
        주의 사항 : DMDCS와 클로로포름은 매우 인화성이 있으므로 실리콘 연소는 흄 후드에서 수행해야합니다.
    5. 상층 액 2 mL를 기증하고 "collection"이라고 표시된 새 15 mL 튜브에 넣으십시오.
    6. 4.7.3-4.7.5 단계를 두 번 더 반복하십시오 (세포 수집 튜브 끝에 6 mL가 있어야합니다).
    7. 수집 튜브 내용물을 4.2 단계에서 준비한 그래디언트 튜브로 천천히 옮겨 그라데이션 중단을 피하십시오.
  7. 이 시점에서, 냉장고에서 이전에 준비 neurobasal 매체 ( 표 1 )를 제거하고 37 ° C 목욕에서 따뜻하게 수 있습니다.
  8. 뉴런을 정화하십시오.
    1. 800 xg 및 22 ° C에서 15 분 동안 그라디언트 튜브를 원심 분리하십시오.
    2. 피펫으로 원하는 층을 채취하고 ( 그림 2 ) 새로운 15 mL 튜브에 넣으십시오. 가장 높은 순도의 신경( 즉 > 90 %), 층 3을 수집하십시오.보다 적은 순도 ( 즉, > 70-80 %)로 더 많은 수율을 얻으려면 2 층과 3 층을 수집하십시오.
    3. 새로 수집 된 층에 HABG 5 ML을 추가하여 밀도 기울기를 희석.
    4. 22 ° C에서 2 분 동안 200 XG에서 원심 분리하십시오.
    5. 뜨는 물을 버리고 HABG 5 mL에 다시 부어 넣고 펠렛을 가볍게 쳐서 세포를 부순다.
    6. 22 ° C에서 2 분 200 XG로 원심 분리기.
    7. 뜨는을 버리고, neurobasal 매체의 3 ML에 resuspend, 그리고 세포를 resuspend에 펠렛을 가볍게 두드리십시오.
  9. 세포를 센다.
    1. neurobasal 매체의 세포와 솔루션의 10 μL을 가지고, Trypan 블루 10 μL와 섞는다.
    2. 이 혼합물의 10 μL를 유리 세면기에 넣으십시오.
    3. 표준 유리 계수 챔버를 사용하여 네 4 x 4 사분면 각각의 셀 수를 계산합니다. 카운트 된 셀 (n), 멀티 셀 모두 추가(희석 인자)를 곱하고, 4로 나눈 값 (4 분면의 수), 3 (신경 매체의 부피)을 곱하고, 10 4 를 곱하여 세포 / mL의 세포 농도를 구한다.
      figure-protocol-1
  10. 배양 판에 세포를 뿌린다.
    1. neurobasal 매체 1 ML 300,000 세포로 세포 현탁액을 희석.
      참고 : 위의 단계에서 얻은 세포의 농도를 기반으로 추가 neurobasal 매체는 3 * 10 5 세포 / ML의 최종 농도를 얻기 위해 추가됩니다. 방정식은 C 1 V 1 = C 2 V 2 이고, 여기서 C 1 은 수확에서 얻은 세포의 초기 농도이다. V1은 3 mL; C 2 는 상기 논의 된 바와 같이 3 * 105 세포 / mL이다. 방정식은 V 2에 대해 풀립니다. 솔루션에 세포의 총 볼륨을 만드는 데 필요한 neurobasal 매체의 볼륨을 추가V 2 .
    2. 부드럽게 흔들어 용액에 세포를 분배하고 코팅 24 잘 접시에 각 잘 1 ML을 추가합니다.

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결과

이 기술을 사용하여, 단일 쓰레기 (4-10 새끼) 문화 플레이트에 시딩에 적합한 1-2.5 10 6 뉴런의 고립 수 있습니다. 일반적으로, 4-8 우물은 위에서 언급 한 농도 ( 즉 300,000 세포 / ML)에 뿌렸다. 그림 3 은 낮은 ( a ) 및 높은 ( b ) 배율 광학 현미경에서 문화에서 일주일 후이 농도에서 뉴런의 모습을 보여줍니다. 그러나, 우리는 또한 50 만 세포 / 웰 및 100,000 세포 / 웰만큼 낮은 농도로 세포를 배양 할 수 있었다. 높은 농도를 사용하면 영양 상태가 빨리 고갈되어 세포에 독성이있는 산성 환경으로 이끄면서 환경 조건에보다주의 깊게주의를 기울일 필요가 있습니다. 농도가 낮을수록 세포는 완전한 성숙에 이르지 못하며지지 세포의 과증식 (oligodendrocytes, microg...

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토론

이 기술은 척수 신경 세포의 안정적인 배양을 가능하게합니다. 기술 숙달이 완료되면 완료하는 데 약 3.5 시간이 걸립니다. 우리는 약 4 시간 동안 2 마리의 분리 된 새끼 (총 16 마리의 마우스)로부터 뉴런의 분리를 수행 할 수있었습니다. 실행 가능성의 핵심 단계는 쥐에게서 능숙하게 척수를 추출 할 수 있다는 것입니다. 항복은 여러 개의 웰을 플레이 팅하고 다양한 조건 하에서 뉴런을 테스트하는 능력을 허용합니다. 우리는 성숙 후 뉴런을 치료하고 웨스턴 블랏 분석을 사용하여 단백질 발현을 신뢰할 수있게 평가할 수있었습니다. 또한, 뉴런 첨부 파일에 대한 우물 내부에 유리 슬라이드를 사용하면 뉴런의 더 얼룩 분석을 허용합니다.

이 절차는 배아 조직 및 관련 노동 강도를 필요로하지 않는다는 점에서 유리하다. 또한, 적절한 척추 조직을 얻기 위해 성인 척수를 사용할 필요가 없습니다.e 신경 세포 격리. 이것은 성인 생쥐에서 볼 수 있듯이 뉴런 생리학에서 나이 합성의 요인을 방지합...

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공개 사항

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감사의 글

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재료

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이름회사카탈로그 번호댓글
Hibernate A Medium - 500 mLThermo-FisherA1247501https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501
Hibernate A 마이너스 칼슘 - 500 mLBrainbitsHA-Cahttp://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/
Glutamax 100X - 100 mLThermo-Fisher35050061https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079
B27 보충제 50X - 10 mLThermo-Fisher17504044
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 Papain, 동결건조 - 100 mgWorthingtonLS003119http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html
Neurobasal A 매체 - 500 mLThermo-Fisher10888022https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)Thermo-Fisher15140122
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 폴리-D-라이신(PDL) 하이드로브롬화물 - 5mg시그마-알드리치P6407-5MG
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US 마우스 라미닌 - 1mgThermo-Fisher23017015https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015
Trypan Blue - 20mLSigma-AldrichT8154-20MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US
OptiPrep 밀도 그라디언트 매체 - 250mLSigma-AldrichD1556-250MLhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US
디클로로디메틸실란( DMDCS, 시그마 실리코트)시그마-알드리치440272-100ML
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US 클로로포름시그마-알드리치288306-1Lhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US
유리 피펫 - 9"시그마-알드리치13-678-20Chttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US
피펫 전구 - 5 mLSigma-AldrichZ186678-3EAhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1
BRAND®   페트리 접시, 유리 - 60 x 15 mmSigma-AldrichBR455717-10EA
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US 멸균 24-Well Cell Culture PlateSigma-AldrichM8812-100EAhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US
Hausser Hemacytometer (glass counting chamber)Fischer Scientific02-671-6https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716
유리 슬라이드 - 12mm 멸균 커버 유리 - 코팅되지 않은NeuvitroGG-12-1.5-Pre
http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm NeuN Rabbit 단클론 항체 - 100 µ LAbcamab177487파라포름알데히드(PFA)에 고정하고 5% BSA로 차단한 후, 12mm 커버슬립의 세포를 4°°C에서 18시간 동안 1:200으로 희석한 항체에서 배양했습니다. C
MAP-2 Mouse Monoclonal 항체 - 50 µ LAbcamab11267파라포름알데히드에 고정하고 5% BSA로 차단한 후, 12mm 커버슬립의 세포를 4°C에서 18시간 동안 1:500으로 희석한 항체에서 배양했습니다. 씨

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