이 연구는 WT 신생아 마우스에서 뉴런을 분리하는 기술을 제시합니다. 신생아 마우스에서 척수를주의 깊게 절개 한 다음 기계적 및 효소 적 절단을 통해 척수 조직에서 뉴런을 분리해야합니다.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 척수 신경 세포의 분리 및 배양에 대한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런은 신생아 C57BL / 6 생쥐에서 얻은 있으며 출생 후의 하루 1-3에 격리되어 있습니다. 일반적으로 하나의 번식 쌍에서 태어난 4-10 마리의 강아지가 한 실험을 위해 모여지고, 척수는 isoflurane으로 안락사 한 후에 각 마우스에서 개별적으로 수집됩니다. 척수가 해부 된 다음 척수가 기둥에서 빠져 나옵니다. 척수는 조직에서 방출되는 뉴런 및 다른 세포를 허용 효소 프로 테아 제에 대한 배달의 표면적을 증가시키기 위해 다음 minched 있습니다. 이어서 분쇄를 사용하여 세포를 용액으로 방출한다. 이 용액을이어서 농도 구배로 분획하여 용액 중의 여러 세포를 분리하여 뉴런을 분리시킨다. 하나의 깔짚 그룹에서 약 1-2.5 x 106 개의 뉴런을 분리 할 수 있습니다. 그런 다음 뉴런을 접착제로 코팅 한 우물에 뿌린다적절한 성장과 성숙을 허용하는 rs. 뉴런은 성장 및 배양 배지에서 성숙에 도달하기까지 약 7 일이 걸리고 이후 치료 및 분석을 위해 사용될 수 있습니다.
서론
척수 병리학을 이해하기 위해서는 거시적 인 수준과 미세한 수준 모두에서 다양한 모델을 사용해야합니다. 대형 및 소형 동물 모델 1 , 2 , 3 은 척수 질환 및 상해에 대한 생체 내 조사에 사용됩니다. 생체 내 에서 이러한 문제 를 연구하는 것은 장점이 있지만, 척수 분석은 전체 척수 균질 또는 조직 섹션 4 로 제한됩니다. 이것은 상주 뉴런과 주변 glia 사이의 척수에서 특정 반응과 표적을 격리하려고 할 때 약간의 모호성을 만듭니다. 유 전적으로 조작 된 생쥐가 증가함에 따라 세포 및 분자 수준에서 생물학에 대한보다 상세한 조사가 가능 해졌다. 따라서 신생아 마우스 모델이 여기에 사용 되어 시험 관내에서 척수 뉴런의 독특한 성질과 생물학적 특성을 연구 할 수 있습니다.
엔트 "> 체외에서 뉴런의 분리 및 유지 보수는 특히 간단하지 않습니다. 성인 설치류의 피질 조직에서 뉴런을 분리하기위한 기술이 상대적으로 풍부하여 고립 된 뉴런 ( 즉, 수백만액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 절차에서 동물의 보살핌과 치료는 콜로라도 대학의 동물 동물 관리 및 사용위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 표 1 에서와 같이 적절한 온도에서 모든 용액을 준비하고 보관하십시오.
2. 코팅 웰 및 슬라이드
참고 : 뉴런은 플라스틱이나 유리 표면에 잘 부착되지 않습니다.
- 뉴런을 분리하기 하루 전에 0.5 ML의 폴리 -D- 리신 (PDL; 표 2 )으로 멸균 된 24- 웰 배양 플레이트의 웰을 코팅하고 층류 후드 O / N에 남겨 둡니다.
참고 : 선호하는 방법은 24 웰 플레이트를 사용하고 주변 웰에서의 증발이 더 가속화되어 일치하지 않는 결과를 초래하는 경향이 있으므로 중앙 웰만 코팅하는 것입니다. 또한 유리 슬라이드는 이전에 우물 안쪽에 놓을 수 있습니다.o 코팅. 뉴런은 코팅 된 유리 슬라이드에 부착되며 나중에 추가 현미경 이미징을 위해 제거 할 수 있습니다 . - 격리 당일에....
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결과
이 기술을 사용하여, 단일 쓰레기 (4-10 새끼) 문화 플레이트에 시딩에 적합한 1-2.5 10 6 뉴런의 고립 수 있습니다. 일반적으로, 4-8 우물은 위에서 언급 한 농도 ( 즉 300,000 세포 / ML)에 뿌렸다. 그림 3 은 낮은 ( a ) 및 높은 ( b ) 배율 광학 현미경에서 문화에서 일주일 후이 농도에서 뉴런의 모습을 보여줍니다. 그러나, 우리는 또한 50 만 세포 / 웰 및 100,000 세포 / 웰만큼 낮은 농도로 세포를 배양 할 수 있었다. 높은 농도를 사용하면 영양 상태가 빨리 고갈되어 세포에 독성이있는 산성 환경으로 이끄면서 환경 조건에보다주의 깊게주의를 기울일 필요가 있습니다. 농도가 낮을수록 세포는 완전한 성숙에 이르지 못하며지지 세포의 과증식 (oligodendrocytes, microg.......
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토론
이 기술은 척수 신경 세포의 안정적인 배양을 가능하게합니다. 기술 숙달이 완료되면 완료하는 데 약 3.5 시간이 걸립니다. 우리는 약 4 시간 동안 2 마리의 분리 된 새끼 (총 16 마리의 마우스)로부터 뉴런의 분리를 수행 할 수있었습니다. 실행 가능성의 핵심 단계는 쥐에게서 능숙하게 척수를 추출 할 수 있다는 것입니다. 항복은 여러 개의 웰을 플레이 팅하고 다양한 조건 하에서 뉴런을 테스트하는 능력을 허용합니다. 우리는 성숙 후 뉴런을 치료하고 웨스턴 블랏 분석을 사용하여 단백질 발현을 신뢰할 수있게 평가할 수있었습니다. 또한, 뉴런 첨부 파일에 대한 우물 내부에 유리 슬라이드를 사용하면 뉴런의 더 얼룩 분석을 허용합니다.
이 절차는 배아 조직 및 관련 노동 강도를 필요로하지 않는다는 점에서 유리하다. 또한, 적절한 척추 조직을 얻기 위해 성인 척수를 사용할 필요가 없습니다.e 신경 세포 격리. 이것은 성인 생쥐에서 볼 수 있듯이 뉴런 생리학에서 나이 합성의 요인을 방지합.......
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공개 사항
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감사의 글
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참고문헌
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ische....
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