이 프로토콜은 두 개의 플라스미드 감염성 cDNA 클론으로부터 감염성 Zika 바이러스의 회수를 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
전염성 cDNA 클론은 바이러스의 유전자 조작을 허용하여 백신, 병인 발생, 복제, 전달 및 바이러스 진화에 대한 작업을 용이하게합니다. 여기에서는 Zika 바이러스 (ZIKV)에 대한 전염성 클론의 구축에 대해 설명합니다. ZIKV는 현재 미국에서 폭발적인 발병을 일으키고 있습니다. 플라 비 바이러스 유래 플라스미드에서 흔히 볼 수있는 박테리아에 대한 독성을 막기 위해 우리는 NS1 유전자에서 게놈을 분리하는 2 플라스미드 시스템을 만들었으며 돌연변이없이 성공적으로 복구 할 수 없었던 완전한 길이의 구조물보다 더 안정적이었다. 두 조각을 연결하기위한 소화 및 결합 후, 전장 바이러스 RNA는 T7 RNA 폴리머 라제로 시험 관내 전사에 의해 생성 될 수있다. 전사 된 RNA가 세포 내로 전기 천공 된 후 바이러스와 유사한 생체 내 성장 동역학 및 생체 내 독성 및 감염 표현형이 마우스 및 모기에서 각각 나타났다.
서론
Zika 바이러스 (ZIKV, Family Flaviviridae : Flavivirus 속)는 2013-14 년 브라질에 도착한 모기에 의한 플라 비 바이러스로 이후 미주 전역에 퍼져 있던 열병의 대규모 발생과 관련이 있습니다 1 . 또한, ZIKV는 성인의 길랑 발레 증후군 및 태아 및 신생아의 소두증과 같은 심각한 질병 결과와 관련되어 있습니다 2 . 서반구에서 급속하게 확산되기 전에 ZIKV에 대해 알려진 것이 거의 없다. 여기에는 분자 도구가 없어 기계 론적 연구가 어려웠습니다. 감염성 cDNA 클론과 같은 바이러스의 분자 도구는 백신 및 항 바이러스 치료 개발을 촉진하고 차별적 인 바이러스 병인, 면역 반응 및 바이러스 성 진화와 관련된 바이러스 유전 인자의 평가를 허용합니다.
플라 비 바이러스 전염성 클론은 cr 때문에 박테리아에서 매우 불안정한 것으로 알려져있다그들의 게놈에 존재하는 유익한 원핵 생물 프로모터 3 . 이 문제를 개선하기 위해 몇 가지 접근법이 사용되었습니다. 바이러스 서열 4의 상류 중계 반복의 삽입, 추정 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 감염성 클론 Plasmid의 형질 전환 및 회수
- 상업적 형질 전환 프로토콜 ( 예 : NEB 5 Minute Transformation Protocol)을 사용하여 두 가지 플라스미드 (일부분)를 변형하여 변형시킨다. 두 플라스미드 모두 암피실린 내성을 나타내는 유전자를 포함하고 있으므로 선택시 암피실린이나 카 베니 실린을 사용하십시오. Carbenicillin은보다 안정적이므로 선호됩니다.
- -80 ° C의 냉동고에서 세포 (물질 표 참조)를 제거하고 5-10 분 동안 얼음 위에서 녹입니다. 37 ℃에서 카파 보이트 억제 (SOC (항생 물질 없음) - 세포와 함께)와 함께 prewarm lysogeny 국물 (LB) (10g / L NaCl 및 25 μg / ML carbenicillin을 포함, LB - carb라는) 접시와 국물.
- 50 μL의 유능한 세포가 들어있는 튜브에 1 μL의 플라스미드 DNA에 100 pg-10 ng을 첨가하십시오. 튜브를 가볍게 흔들어서 가볍게 섞는다.
- 5 분 동안 얼음에 튜브를 품어 라.
- 42 ° C에서 30 초 동안 열 충격 튜브수조에. 열 충격 직후 2 분 동안 얼음으로 되돌아갑니다.
- 각 튜브에 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
여기에 설명 된 프로토콜은 전염성 클론 파생 Zika 바이러스의 복구를 허용합니다. 2 플라스미드 감염 복제 시스템을 조작하는 것은 매우 불안정한 전장 버전 (데이터는 표시되지 않음)과 비교하여 신중하게 수행하면 간단합니다. 두 개의 개별 조각의 소화 및 연결 후, 봉쇄 된 RNA는 Vero 세포 ( 그림 1 )로 electroporated 다음 T7 중합 효소와 시험 관내 전사를 사용하여 생산됩니다. 올바른 플라스미드 서열은 miniprep ( 그림 2a ) 다음에 프록시로 제한 소화를 사용하고 RCA 또는 maxiprep로 대규모 DNA 생산 후 Sanger 시퀀싱을 통해 모니터링 할 수 있습니다. 시퀀싱으로 클론을 확인한 후, 감염성 바이러스의 회복은 소화, 결찰, 시험 관내 전사 및 최종 전기 천공만을 요구한다. 이 단계는 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
여기에서는 ZIKV에 대한 이분자 감염성 cDNA 클론 시스템의 회수 방법을 설명합니다. 이전에 기술된 ZIKV에 대한 클론은 감쇠를 겪거나 인트론의 추가가 필요하여 플라스미드를 더 크게 만들고 곤충 세포에서 구조를 방해합니다. 감염성 바이러스는 포유류 또는 곤충 세포에서 2-플라스미드 클론 시스템을 사용하여 회수할 수 있습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한, 이 시스템에서 회수된 바이러스는 여러 세포주, 면역 저하 마우스 모델 및 모기에서 야생형 바이러스와 유사하게 행동합니다.
플라비바이러스 게놈3에 비밀스러운 박테리아 프로모터가 존재하기 때문에 전장 플라비바이러스 클론은 작업하기 어렵고 일반적으로 플라스미드에서 돌연변이, 삽입, 결실 또는 재배열을 초래합니다. 우리는 ZIKV 게놈을 두 개의 플라스미드로 분리하여 바이러스 NS1 유전자에 존재하는 독성 서열을 파괴함으로써 이러한 우려를 완화하려고 했습니다. 그 결과 변경 사항을 통.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 클론 파생 바이러스의 특성 규명에 도움을 주신 Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic 및 Claudia Rückert에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (NIH)에서 AI114675 (BJG) 및 AI067380 (GDE) 보조금으로 일부 지원되었습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | 다양한 | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 단위/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 단위/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 단위/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 단위/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 단위/ml |
| illustra TempliPhi 100 증폭 키트 | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| 새우 알칼리성 인산가수분해효소(rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| 알칼리성 인산가수분해효소, 송아지 장(CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | 다른 기계도 사용할 수 있습니다. |
| 한천을 곁들인 LB 육수(밀러) | 시그마 | L3147 | 홈메이드도 가능합니다. |
| 훌륭한 국물 | 시그마 | T0918 | 수제로도 할 수 있습니다. |
| 페트리 접시 | Celltreat | 229693 | |
| 배양 튜브 | VWR International | 60818-576 | |
| T75 플라스크 | Celltreat | 229340 | |
| T182 플라스크 | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 L-글루타민 | Corning | 10-040-CV | |
| 포함L-글루타민 및 4.5g/L 포도당이 함유된 DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12웰 플레이트 | , Celltreat | 229111 | |
| 염기서열분석 올리고, | IDT, | 표 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | 등 다른 방법도 사용할 수 있습니다. |
| Qubit dsDNA BR 어세이 키트 | , ThermoFisher | Q32850 | 다른 방법도 사용할 수 있습니다. |
| Qubit RNA HS 어세이 키트 | , ThermoFisher | Q32852 | 다른 방법도 사용할 수 있습니다. |
| Class II Biosafety | Cabinet Varies | N/A | 이것은 살아있는 바이러스 작업에 필요합니다. |
참고문헌
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guill....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
