방법 논문

단백질 영화 적외선 전기 화학 [NiFe] Hydrogenase에 의해 H2 산화의 연구에 대 한 설명

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DOI:

10.3791/55858

⸱

2017년 12월 4일

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Oxford, Inorganic Chemistry Laboratory

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 우리 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 탄소 전극에 직접 전기 통제 시선 공부 고정된 산화 단백질을 수 있는 설명 합니다. 단일 단백질 시료의 적외선 스펙트럼 적용된 잠재력의 범위는 다양 한 솔루션 조건 아래에 기록할 수 있습니다.

초록

단백질 내 센터 화학 산화 환 원 정밀 하 게 제어를 제공 하는 산화 환 원 단백질 요구 방법의 이해. 있는 단백질은 움직일 전극 표면에 전극 대체 생리 전자 기증자 또는 수락자, 그런 단백질 필름 전기 화학의 기술을 다양 한 다른의 산화 환 원 반응으로 기능 통찰력 제공 단백질입니다. 전체 화학 이해 전기 제어를 추가 구조 및 기계적 통찰력을 추가할 수 있는 다른 기술로 결합 될 필요 합니다. 여기 기술, 단백질 영화 적외선 전기 화학, 산화 환 원 단백질의 적외선 분 광 샘플링 단백질 영화 전기 화학을 결합 하 여 설명 합니다. 기술은 높은 표면적 카본 블랙 전극에 움직일 산화 단백질을 다중 반사 감쇠 총 반사율 기하학을 사용 합니다. 흐름의 셀이 전극의 결합 솔루션 pH 또는 용 질 농도를 측정 하는 동안 변경 될 수 있습니다. 이것은 특히 강력한 산화 환 원 효소, 촉매 급속 한 회전율을 지속 수 있으며 촉매 메커니즘에 긴 중간 종의 분 광 관측을 허용 하는 전극에서 제어 해결. 회전율 (H2 산화)와 비-매출 조건에서 대장균 hydrogenase 1에 실험 기술을 설명합니다.

서론

단백질 기능 연구에 핵심 과제 중 vivo에서 또는 사용 하 여 그들의 생리 적 역할을 수행 하는 단백질의 직접 관찰 절연 단백질 샘플을 허용 하는 현장에서 방법의 개발을 포함 한다. 이 단백질 기능 동시에 측정 하는 동안 컨트롤 또는 트리거링 실험 절차와 평가 될 모두 반응성을 허용 하는 결합 된 기술의 사용 프로세스의 통합 및 개별 화학 단계 필요 합니다. 산화 단백질의 경우이 종종 동일한 정확 하 게 적용 된 잠재력을 제어 하지만 화학적으로 특정에 민감한 분 광 기술로 직접 아무 화학 정보를 제공 하는 전기 화학 기법을 결합 하 변경 연관 단백질 기능입니다. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry는 다양 한 분 광 기술 및 전기 제어의 수준을 포함 하는 결합 된 전기 및 분 광 방법의 범위에 대 한 일반적인 용어입니다. 이 작은 분자를 사용 하 여 전자 전송, UV-표시,4,5 와 결합을 포함 하 여 중재를 연구에 이용 되 고 많은 단백질 인공, 수용 성 전자 기증자와 수락자로 전자를 교환할 수 있습니다. , 6 , 7 자석 원형이 색 성8 및 적외선5,,910,11,12,13,14 (IR) spectroscopies입니다. 제한 된 수의 경우 단백질과 전극 unmediated, 보급 통제 전자 교류를 악용 수 입증 했다. 15 , 16

촉매 반응에 대 한 실시 산화 환 원 효소, 현재의 솔루션 전기 화학 방법에 의해 명확한 불리. 될 가능성이 높습니다 확산 제어 전자 전송을 통해 redox 중재자 솔루션에서 속도 제한. 효소에 대 한 운동 및 기계 정보 손실 될 수 있습니다 또는 적어도 실험 방법에서 발생 하는 확산 유물에서 deconvolute 어려워. 직접, unmediated 전기 제어 따라서 산화 단백질 및 효소의 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 단백질 필름 전기 (PFE)의 기술 산화 환 원 전극 움직일 단백질, 전극 잠재력의 시리즈에서 편광으로 직접 또는 산화 환 원 공동 인자 단백질 내에서 전자 전송 되는 방식으로 사용 합니다. 17 , 18 , 19 PFE은 산화 환 원 효소에 의해 촉매 산화 또는 감소 반응의 연구에 대 한 특정 값의 계면 전자 전송 매우 높은 속도로 달성 될 수 있다. 예를 들어 Allochromatium vinosum 에서 니켈-철 합금 ([NiFe]) hydrogenase의 electrocatalytic 이직 률 PFE에 의해 H2 산화에 대 한 ca 1000-10000의− 1 로 측정 되었다. 20 잠재적인 전극 촉매 '' 또는 '해제' 및 효소 활동에 electrocatalytic 현재 보고서를 방 아 쇠 역할을 합니다. PFE 잠재력, [페]의 디-철 활성 사이트의 반응 등을 속속들이 의존 하는 복잡 한 효소의 반응성을 분석 하기 위한 유용한 방법 이므로-CO와 O2,21 hydrogenases 또는 잠재력 유도 hydrogenases,22 일산화 탄소 효소,23 및 다른 복잡 한 산화 환 원 효소의 비활성화 반응. 24

산화 환 원 효소, 1-2 pmol cm-2 [NiFe] hydrogenase A. vinosum에서 순서의 낮은 표면 범위에서 발생 하는 주요 장벽 PFE에 의해 받으면 직접 전기 제어와 분 광 기법을 결합 하 대량 금속 전극에 작은 분자 adsorbates의 표면 과학 연구 현장에 상대적인 20 . 이 분 광 측정의 감도 대 한 도전을 선물 한다. 여러 가지 spectroelectrochemical 방법을 보고 되었습니다 공부에 대 한 다양 한 다른 전극에서 산화 환 원 단백질 움직일: 투명 금속 산화물 전극;에서 UV 보이는 분광학 25 , 26 , 금 전극;에서 27 형광 분광학 28 , 29 (세이 라) 표면 강화 된 적외선 흡수 분광학에서 금 전극; 30 , 31 , 32 , 33 그리고 표면 강화 라만 분 광 기술을, 주로 실버 전극. 34 , 35

여기는 커플링 PFE IR 분광학, 단백질 영화 적외선 전기 화학 (PFIRE)로 알려져 있는 기술에 대 한 방법에 설명 합니다. 36 는 PFIRE 메서드는 산화 환 원 효소를 이용 하는 다양 한 탄소 표면에 단백질의 흡착의 용이성 감쇠 총 반사율 (ATR-IR) IR 기하학와 함께에서 높은 표면적 탄소 작업 전극에 움직일 수를 공부 한다. 적외선 분광학은 많은 작은 분자, ligands 및 공동 인자는 반응성, 바인딩, 억제 및 산화 환 원 상태를 평가 하는 데 사용할 수 있는 진단 absorbances 산화 환 원 효소와 단백질의 연구에 유용 합니다. 아니 철 황 센터, flavoproteins,38,,3940 작은 분자 헤 센터 등을37 연구의 바인딩을 등이 있습니다. 41 는 ATR-IR 형상 최적화 된 3-전극 (spectro) 전기 화학 셀42 의 건설을 허용 하 고 따라서 우수한 전기 제어를 제공 합니다. 솔루션 저항 및 잠재적인 드리프트 작업 전극 가까이 참조 전극 배치 하 여 최소화 됩니다. 높은 표면적 카운터 전극 빠른 효소 회전율 작업 전극에 의해 생성 하는 높은 electrocatalytic 전류와 호환 되는 사용 됩니다. Spectroelectrochemical 셀 솔루션의 흐름 손쉬운 제어를 기판, 저 해제 및 pH의 농도 수 있습니다. 36 , 43 , 44 는 PFIRE 메서드는 따라서 IR 스펙트럼이 지속적인된 효소 electrocatalysis 동안 기록 된 위치에 있을 수 있습니다. 36 , 44 PFIRE PFE 산화 환 원 효소에서 이외의 촉매 프로세스에서 정보를 추출이 어려울 수 있습니다 어디 달리 촉매 현재,43 의 부재에 화학 정보를 제공 하는 능력 이기도 합니다. 45 , 46

우리는 [NiFe] hydrogenases, 바이메탈 액티브 사이트에서 Fe를 조정 하는 내장 CO와 CN ligands를 포함 하 여 electrocatalytic H2 산화의 연구에 대 한 PFIRE 메서드를 증명 하고있다. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases는 따라서 PFIRE에 의해 공부 하는 데 특히 적합. PFIRE 메서드를 사용 하면 정상 매출 중 존재 하는 종족에 대 한 정보를 제공 합니다. 및 따라서 실험적인 통제 없이 hydrogenases의 IR 분광학에 문학 부 뿐만 아니라 중요 한 기계적 통찰력을 제공 합니다. 동안 회전율. 47 , 48 다이어와 동료 고용 시간 해결 IR 메서드 NiFe hydrogenases,49,50,51 작은 부정적인 잠재적인 단계 (를 통해 사용 하거나 적용할 빛 방 아 쇠를 사용 하 여 연구를 솔루션 중재자와는 '감 금된' 전자 소스) 또는 photolyse 바운드 수소. PFIRE 메서드를 사용 하면 수 없습니다, 현재 제공 시간 분해능이이 측정에 맞게40 연구 공정의 감소와 산화 촉매, 잘 정의 된 잠재력의 범위에 액세스를 허용 하지 않으며 대량 전송에서 무료 제한입니다.

PFIRE 메서드는 산화 환 원 단백질, 또한 ATR IR 기하학을 사용 하 고 전극 표면에 흡착 분자의 IR 흡 광도 향상 시키기 위해 나노 roughened 금속 전극 사용의 세이 라 연구에 다릅니다. 30 세이 라 막 단백질, 특히 흡착 공부에 대 한 매우 중요 한 기술 또는 모방 막 내 아키텍처,32 그러나 금속 전극에 대 한 필요성 때문에 반응성 기판 및 억제제 범위를 제한할 수 있습니다. 작은 분자 CO, CN-, 공동2 등 을 향한 전극 지원의 양성자 감소와 자기 조립된 단층 탈 착은 매우 부정적인 잠재력에 금속 표면에 문제가 될 수 있습니다,1,52 보호에 효소 electrocatalysis 금속 전극 비록 보고 되었습니다. 53 , 54 세이 라를 기준으로 PFIRE의 단점은 막 단백질 네이티브 또는 모방 멤브레인 구조에 통합의 상대 어려움입니다. 그러나, 경쟁 작은 분자 활성화 반응에 탄소 전극의 상대 화학 inertness는 PFIRE 효소 electrocatalysis, 생물학 산화 환 원에 관련 된 낮은 잠재력 도메인에 특히 공부에 대 한 우수한 기술 hydrogenases에 의해 양성자 감소 등 프로세스입니다. 1 , 43

이 문서의 목표는 산화 환 원 전극 움직일 단백질, 예를 들어 대장균 에서 NiFe hydrogenase 1 (Hyd1)를 사용 하 여 공부에 대 한 기법으로 PFIRE 메서드를 소개 하는 것입니다. 샘플 준비, 좋은 기질 흐름과 데이터 처리에 대 한 요구의 고려 사항은 설명 합니다. PFIRE은 광범위 하 게 적용 가능한 기술, (와 함께 독특한 IR absorbances) 수 흡착 될 탄소 전극에도 직접 모든 산화 단백질을 공부 하 고 또는 그것으로 전자를 교환할 수 있는 그런 표면 개 질를 사용 하 여 적합된 합니다 전극입니다.

프로토콜

1. 혐 기성, 건조 글러브 및 일반적인 실험적인 요구는 FTIR 계의 내부 샘플 실 재현

  1. 외부 수은 카드뮴 텔 룰라 이드 (MCT) 검출기와 ATR 액세서리 상업 연결 분석기를 사용 합니다. 건조 한 공기 또는 이질소, 분석기의 시체를 제거 하거나 또는 한 분석기를 사용 하 여 대피 광학 벤치와 함께 합니다.
  2. 혐 기성으로 같은 높이에서 안정, 진동 없는 테이블에 분석기를 배치 (< 1 ppm O2), (노점 <-75 ° C) 글러브를 건조. 충분히 큰 defocused 빔 IR 투명 창을 통해 글러브에는 분석기의 IR 광선을 전환.
    참고: 중요 하다 글러브와 분석기 사이의 간격도 제거 또는 대피, NaCl 등 케이시 검 습기 창 소재, 예를 들어 사용 하는 경우에 특히.
  3. 복제는 글러브 안에 계의 내부 샘플 구획.
    1. 이상적으로 계의 내부 초점 거울으로 동일한 초점 거리와 함께 축에서 타원 거울에 글러브 안에 빔 직접.
      참고: 그것은 높이 글러브; 내부 조정 IR 광선의 방향으로 수 있도록이 초점 거울 앞에 배치 하는 두 추가 평면 거울에 유용 이 계의 초기 배치에 있는 부정확을 상쇄 된다.
    2. 외부 MCT 발견자, 적당 한 완전 한 글러브, 내부 (짧은 초점 거리 ZnSe 렌즈, 또는 꺼짐-축 포물선 거울, 짧은 초점 거리) 등 시 초점 위치와 같은 내부 샘플의 크기를 복제 분석기의 구획입니다.
    3. 적외선 빔 초점 거울 및 MCT 발견자 사이 대략 등거리 수의 '초점'을 조정 합니다.
  4. 액체 질소로 외부 MCT 발견자의 dewar 쿨.
  5. ATR 액세서리 글러브 샘플 구획에 탑재. 입력 및 출력 광학 및 MCT 발견자에 최대 처리량을 달성 하기 위해 ATR 액세서리에 초점을 맞춥니다. 필요한 경우, 검출기 신호의 oversaturation을 조리개 또는 다른 적당 한 감쇠 (와이어 그리드) 등을 사용 합니다.
    참고: 위해 데이터 제시 여기, 모든 반사 광학 및 내부 반사 요소 (분노)를 사용 하는 이동식 사다리꼴 시 5-반사 ATR 액세서리 (크리스탈 GmbH, 차원 ca 5 × 8 × 1 m m3, 얼굴 각도 39.5 °). 분노는 폴 리 에테르 에테르 케 톤 (PEEK)에서 가공 하는 이동식 baseplate에 거치 된다.
  6. 글러브를 사용 하 여 외부에서 지 내게 potentiostat 연결할 수 있도록 적당 한 피드스루와 재현된 샘플 구획 집 (가스 꽉 BNC 연결은 유용 하 게이 목적을 위해), 가스 접속과 MCT에서 신호를 전송 하는 케이블 탐지기입니다. 그것은 어떤 소개 또는 측정에 간섭을 피하기 위해 감지기 케이블에 차폐 유지 해야 합니다.
  7. 연동 펌프, 유량 60 mL/min은 글러브 안에 보다 큰 수를 놓습니다. 계의 도식 보기, ATR 액세서리, 연동 펌프 및 potentiostat 설치 그림 1에 표시 됩니다.
  8. Spectroelectrochemical 셀에에서 표시 된 개요로 그림 2ATR에 물개는 액세서리 등을 생성 합니다. 셀 높은 표면적 카운터 전극 Pt 와이어 (거 즈), 작업 전극 (탄소 막대)과 소형 기준 전극에 대 한 연결을 포함 해야 합니다. 셀은 입구와 셀 통해 솔루션의 빠른 흐름에 대 한 콘센트로 적어도 2 개의 추가 포트를 포함 해야 합니다.
    참고: 미니어처 포화 calomel 참조 전극이이 목적을 위해 이상적입니다. 36

2. 카본 블랙의 입자 대장균 Hydrogenase 1로의 준비

  1. '젖은' 혐 기성 글러브 혼합 높은 표면적의 20 밀리 그램 카본 블랙의 입자 (> 1000 m3/g) 1 mL 초고 순도 물 (저항력 > 18 m ω c m) microcentrifuge 관에서. 낮은 전력 쥡니다에 의해 입자를 분산 (< 100 W) 적어도 15 분, 또는 때까지 분산 유니폼 이며 약 20 mg/mL에의 한 로드 카본 블랙 분산을 주고 1 시간 안에 침전 하지 않는다.
  2. ~ 7 mg 단백질/mL의 농도에서 대장균 hydrogenase 1 (Hyd1, 약 50 µ L,55게시 절차 따라 준비)의 약 수를 받아 하 고 (전자 포인트 가까운 pH에서 낮은 이온 강도 버퍼 교환 예를 들어 칼륨 인산 염, 15 m m, pH 5.8, 추가 소금). 최상의 결과 얻기 위해 가능한 활성화 효소 준비 사용 하 여. 농도와 희석 한 적절 한 분자량 컷오프와 원심 필터 장치에 버퍼 교환 (50 kDa 작품 잘 Hyd1에 대 한)을 수행 합니다.
    1. 필터 장치에는 Hyd1를 추가 합니다.
    2. 교환 버퍼의 약 450 µ L로 희석.
    3. 온화한 원심 분리를 사용 하 여 50 µ L의 볼륨을 reconcentrate (< ~ 2700 × g) 돌이킬 수 없는 강 수를 방지 하기 위해.
    4. 2.2.2, 2.2.3 단계를 반복 하 여 버퍼 교환 완료 되 면 (일반적으로 이내 ~ 5 주기).
  3. 버퍼 교환 Hyd1의 50 µ L 약 수 카본 블랙 분산 (2.1에서 준비) 20 mg/mL의 5 µ L 볼륨 믹스. (0 ° C)에서 냉장고에 효소 입자 혼합을 저장 하룻밤 adsorb 효소 수 있도록 합니다. 그것은 때때로 입자 분산 유지 되도록 혼합을 흔들 해야 합니다.
  4. Microcentrifuge (~ 2700 × g)에서 연속적으로 침전 및 재 분산 주기에 의해 낮은 이온 강도 버퍼 (칼륨 인산 염, 15 m m, pH 5.8, 추가 소금) Hyd1 수정 입자를 씻어. 이 과정을 3-5 회 반복 비 흡착 효소를 제거 하.
    참고: 첫 번째 세척 하기 전에 상쾌한 이어야 한다 거의 무색, 효소의 좋은 흡착을 나타내는.
  5. 효소 수정 입자의 ~ 20 mg/mL의 최종 로드를 주고 ~ 5 µ L의 최종 볼륨을 입자를 집중.
    참고: Hyd1 수정 입자 경우 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 2 주 동안 그들이 남아 화; 이 가장 ~ 50 µ L의 초고 순도 물 희석 하는 입자를 저장 하 여 이루어집니다.

3. 대장균 Hydrogenase 1에 PFIRE 측정을 위한 준비

  1. 그래서 저전력 쥡니다 (< 100 W), H2에서 처음으로 시 분노를 청소4 (< 90 %w / w) 15 ~ 분, 그리고 HNO3 (70 %w / w)에 대 한 최대 1 시간. 이 청소 절차는 친수성 분노 표면에 연결 되어야 합니다. 분노 피 솔루션에 놓일 수 있습니다 더 청소 하는 것이 필요한 경우 (H2O2의 1:3 비율: H2등4) 어떤 잔여 유기 물질을 산화.
    참고: 가혹한 산 성 청소 방법 모든 분노 재료로 사용 하기 위해 적합 한 않을 수 있습니다. 피 라 솔루션 높게 부식성 이며 강한 산화 제, 표면 되어야 합리적으로 깨끗 한 피 솔루션 및 관리의 사용 준비 하는 동안 이동 해야 하기 전에 과정-항상 발열 특성상 피 솔루션의 사용 추가 H2O 2 천천히 H2이렇게4 고 준비, 사용 및 폐기에 대 한 적절 한 안전 절차를 참조 하십시오.
  2. 초고 순도 물에 깨끗 한 분노를 헹 구 고 건조 질소 가스의 흐름에서 건조. 깨끗 한 핀셋을 사용 하 여 오염을 방지 하는 모든 프리즘 처리를 실시 합니다.
  3. 전기 등급 실리콘 실 란 트의 얇은 스트립을 사용 하 여 ATR 액세서리 baseplate에 분노를 봉인. 분노의 가장자리에 실 란 트를 제한 하는 것을 주의. 완전히 건조 실 란 트를 허용 합니다.
  4. ATR 액세서리 baseplate 분석기 글러브에 전송 그리고 ATR 액세서리에 탑재. 4000-1000 c m-1 4 cm-1 해상도 사용 하 여 표준 급속 사이 참조 (배경) 스펙트럼 측정 검사는 계의 모드와 1024 평균된 interferograms (측정 시간 3-5 분). 입력으로이 스펙트럼을 사용 하 여 실험의 뒷부분에 나오는 흡 광도 스펙트럼의 계산을 허용.
    참고: 작은 흡 광도 Hyd1 활성 사이트에 대 한 기대로 인해 그것은 잡음 비율 높은 신호 스펙트럼을 수집 하는 데 필요한.
  5. 미리 준비 된 Hyd1 수정 입자 분산 (제 2)를 포함 하는 '젖은' 글러브 ATR 액세서리 baseplate 전송. 드롭-캐스트는 분노의 큰 얼굴에 입자 분산의 1 µ L 약 수 표면에 걸쳐 균일 하 게 그들을 확산. 참고: 팬 들은 분노에 완전히 건조 될 입자의 정보를 허용 하지 않습니다.
  6. M m (즉, ca. 8.2 × 4.9 m m2) 분노의 표면 크기 보다 작은 크기 ~0.1을 연료 전지, 가스 확산 층 재료로 사용 하는 것과 같은 탄소 종이의 한 조각 잘라. 탄소 종이의 표면 영역 드롭 캐스트 Hyd1 수정 입자를 커버 하기에 충분 해야 하지만 이렇게 중복으로 큰 실리콘 실 란 트 사용 하는 분노를 확보. 물, 탄소 종이 담근 다 고 부드럽게 입자 필름 위에 그것을 배치. 탄소 종이 전체 입자 필름에서 좋은 전기 연결을 제공 합니다.
    참고: 사전에 여러 조각의 탄소 종이 준비 하 고 미리 '젖은' 혐 기성 글러브 안에 초고 순도 물에 담가 저장에 유리 하다.
  7. 분노를 통해 spectroelectrochemical 셀 (1.7에서 설명 하 고 개요로 그림 2에 표시 된)를 탑재, 나사 baseplate에 그것을 확보. 계속 수산화 효소 실험 버퍼의 ~ 200 µ L를 추가 합니다. 넓은 pH 범위, 버퍼링 수 혼합된 버퍼 시스템 유용 NiFe hydrogenases에 대 한 연구:56 나트륨 아세테이트, 2-[N'-morpholino] 탄 sulfonic 산 (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazine-N' -[2 탄-sulfonic 산] (HEPES), N'-트라이앵글 [hydroxymethyl] 메 틸-3-아미노-프로 판-sulfonic 산 (도청), 그리고 2-[N'-cyclohexylamino] 탄 sulfonic 산 (CHES), 15 mM의 최종 농도에 각 구성 요소와 포함 된 0.1 M NaCl 전해질, 산도 pH 6을 사용 하 여 조정 지원 집중 NaOH 및 HCl.
    참고: 작업 전극 연결 해야 내 다 약간 탄소 종이 (그림 2)에 좋은 전자 연결 spectroelectrochemical 셀 상단 (~0.1 m m)의 비행기 아래.
  8. 연동 펌프 튜브와 실험 버퍼의 유리병을 포함 하는 흐름 시스템 솔루션 입구와 출구 spectroelectrochemical 셀의 연결. 포함 하는 분석기 '건조' 글러브 조립된 셀 전송.
  9. Spectroelectrochemical 셀 어셈블리 ATR 액세서리에 장착 합니다. potentiostat에 연결할 작업, 카운터 및 기준 전극. 연동 펌프 튜브 펌프에 연결 합니다.
  10. 4000-1000 c m-1의 스펙트럼 범위 4 cm-1 해상도 1024 평균 interferograms로 흡 광도 스펙트럼을 기록, 참조/배경으로 3.4에서 수집 된 스펙트럼을 사용 하 여. 이 시점에서 스펙트럼 중요 한 포함 한다 (> 100 mO.D.) 아 미드 II ~ 1,540 c m-1 에서 밴드와 Hyd1의 활성 사이트 밴드는 스펙트럼 영역 1,850 2,150 cm-1, 산화, 비활성 상태 (그림 3에서 크게에 분명 해야한다 ).

4. 대장균 Hydrogenase 1 및 Spectroelectrochemical 셀 테스트 활성화

  1. Hyd1 수정 입자 필름을 감소 잠재력 (−0.8 V vs SCE)를 적용 합니다. Spectroelectrochemical 셀 통해 천천히 H2 와 흐름 버퍼와 실험 버퍼 포화. 예제는 Hyd1를 활성화 완전히 하룻밤 둡니다.
    참고: 그것은 중요 한 혐 기성 H2, N2 등, 그래서 모든 혐 기성 가스를 사용 하는 O2 필터를 통해 전달 되어야 합니다.
  2. 활성화 후 샘플의 흡 광도 스펙트럼을 기록 합니다. ΝCO 와 활성 사이트의 vCN 밴드 이제 감소, '활성'의 배포를 표시 합니다. 이것은 스펙트럼 3.10 (그림 4)에 기록 된 상대적인 차이 스펙트럼의 사용을 통해 가장 쉽게 관찰 된다.
  3. Spectroelectrochemical 셀의 전기 연결을 테스트 합니다. 이 위해 실험 버퍼 N2 가스로 포화. 일련의 산화 (0 V vs SCE)와 Hyd1 수정 입자 필름 (−0.8 V vs SCE) 후보 ( ca 30 분 기간)의 감소를 적용 하 고 각에서 흡 광도 스펙트럼을 기록. Hyd1 해야 될 급속 하 게 산화 하 고 감소, 그리고 입자 영화는 잘 연결 하는 경우 샘플의 100% 적용된 가능성에 응답 해야 합니다.
  4. 실험적인 버퍼의 적절 한 흐름 속도 설정 합니다. 이렇게 하려면 샘플, 감소 잠재력 (−0.8 V vs SCE)를 적용 하 고 실험 버퍼 H2와 함께 포화. -0.707 사이 순환 voltammograms의 일련을 기록-0.039 V vs SCE 10 mV/s 스캔 속도에 점차적으로 H2의 흐름 속도 증가-voltammograms 촉매 형상 평면 회전에서 그를 닮을 때까지 사이 포화 버퍼 디스크 전극55 고 최대 전류는 유량 (그림 5)의 독립.
    참고: H2 물에서의 용 해도 293 K와 1 개의 막대기에 ~0.8 m m 이다.
  5. 샘플은 지금 PFIRE 측정을 위한 준비, 스펙트럼 솔루션 조건 (pH, 온도, H2 의 농도 등)의 범위 내에서 전위의 범위에서 수집 합니다. Electrocatalytic 프로세스 Hyd1에 의해 H2 산화 등을 공부 하는 때에 특히 광 및 전기 화학 데이터를 연결할 수 있어야 하는 것이 중요 하다 potentiostat 소프트웨어를 사용 하 여 모든 전기 화학 데이터를 기록 합니다.

5. 분 광 데이터 처리

  1. 그 활성 사이트는 영구적으로 변경 되지 측정 과정 0 V −0.8 V vs 실험의 끝에 SCE에서 스펙트럼을 기록 하 여 확인 합니다. 이러한 스펙트럼 4.3에 기록 된 동일 해야 하 고 활성 사이트의 손실 측정 (그림 6) 동안 관찰 해야 합니다.
  2. 적합 한 형태로 분석기 소프트웨어에서 절대 흡 광도 스펙트럼을 내보내기 (.csv, ASCII, 'matlab', Jcamp 등) 원본 또는 Matlab과 같은 소프트웨어를 사용 하 여 처리를 위해.
  3. 초기 계획 데이터를 그림 7에 나와 있는 프로세스를 사용 하 여 수정 합니다.
    1. 작은 식별 범위 1800 2,150 cm-1에 각 흡 광도 스펙트럼의 두 번째 파생을 받아 (< 1 mO.D입니다.) 액티브 사이트 밴드 높은 곡선 물 배경.
    2. 원래 흡 광도 스펙트럼에 기준선 마커 포인트를 놓고 ' 스냅 ' 실험 스펙트럼에 포인트를 설정 합니다.
    3. 입방 스플라인 보간된 함수 또는 다항식 함수를 사용 하 여 포인트를 통해 기준에 맞게. 이 초기 함수를 실험 데이터에서 뺍니다.

결과

그림 1 에서는 PFIRE 측정을 위해 사용 하는 분석기, 글러브, ATR 액세서리, potentiostat, 가스 흐름 시스템의 실험적인 배열의 도식 표현. 그림 2 는 spectroelectrochemical 셀의 그림 대표.

그림 3 은 드롭-캐스트 Hyd1 수정 입자의 실험적인 버퍼 (혼합된 버퍼 시스템, 3.7, pH 6.0에서에서 설명)와 함께 흡 광도 스펙트럼 spectroelectrochemical 셀 통해 흐르는. Hyd1의 표면 범위 ~ 235 mO.D의 아 미드 II 밴드 진도 그림 3에 표시 된 예제에서 특히 높다. 그리고 최소한의 '대량' 물에 의해 입증으로 O-H 기지개 지역 3000 ~ 3600 c m-1의 크기 ~ 1640 c m-1는 아 미드의 회선은에서 밴드를 기준으로 나 Hyd1의 밴드와 물 H-O-H 벤드. 때문에 단백질 추가 밴드 C H 기지개 지역 (ca 2900 c m-1)에서 볼 수 있습니다. 2100 cm-1 을 중심으로 광범위 한 밴드는 낮은 에너지 libration 밴드는 H2O 분자 때문에 액체 물에 수소 결합 네트워크의 제한 된 회전의 세트와 함께 H-O-H 굽 힘 진동의 조합 밴드가 이다. 활성 사이트의 산화, 비활성, Ni-B 상태의 ν공동 밴드 1,943 c m-1, 기준선 보정 없이에서 명확 하 게 분명 하 고 νCN 기능 2,050 2100 c m-1 명확 하 게 볼 수 있습니다. . 높은 Hyd1 보장 범위, 카본 블랙 영화57 의 미소 한 구멍이 있는 구조의 많은 효소에 의해 차단 되 고 따라서 '대량' 물 농도 PFIRE 측정 동안 낮춘 다.

그림 3 에서 스펙트럼 표시, 활성화 하기 전에 Hyd1 영화 포함 산화, 비활성 상태에서 Hyd1. 활성화 된 (감소) - -준비 (산화) 차이 스펙트럼을 보여 주는 그림 4 에서 같이 활성화는 −0.8 V vs H2 분위기에서 SCE 리드 형성의 감소, 촉매로 활성 상태에서 하룻밤 Hyd1의. Hyd1의 차이 스펙트럼은 ν공동 영역을 사용 하 여 가장 명확 하 게 해석 수 있습니다. 활성 사이트의 각 고유 상태는 2 개의 CN 밴드에 비해 하나의 공동 밴드 이며 따라서 νCN 지역 본질적으로 더 복잡 한, 많은 겹치는 밴드와 함께. 그림 4에서 차이 스펙트럼 활성화 손실 (부정적인 흡수 밴드)의 산화, 비활성 Ni-Ni-시 (가장 산화 '활성' 상태)로 준비 Hyd1 필름에 있는 그의 작은 금액에 이르게 보여줍니다. 이러한 Hyd1;의 '활성' 상태로 대체 됩니다. Ni-C, Ni-R 및 Ni-L. 참고 두 ν공동 밴드에 의해 입증으로 두 가지 형태의 Ni-R 및 Ni L 상태는 그림 4에이 종족에 대 한 관찰. 여러 Ni-R 및 Ni L 상태 관찰은 다른 NiFe hydrogenases 계약. 48 , 58 , 59

PFIRE 메서드의 키 확인 순환 voltammograms spectroelectrochemical 흐름 셀 표시 평면 회전 디스크 전극에 그들과 유사한 촉매 파형 기록 내부 Hyd1의 기록 이다. 55 실제로 즉 기판 (H2) 및 spectroelectrochemical 셀에 고정된 Hyd1에서 제품 (H+)의 대량 전송 PFIRE 측정 시 사용 유량에 효율적입니다. 촉매 형상에 유량의 효과 그림 5, spectroelectrochemical 셀 솔루션 유량 증가 H2 분위기 (1 바) 아래 기록 연속 voltammograms를 보여주는 표시 됩니다. 모든 경우에 overpotential Hyd1에 의해 H2 산화는 동일한 (빨강 회색된 사각형)을 산화 비활성화의 범위 하지만 (산화 하 고 감소 하는 동안 현재 사이 히스테리시스 스윕 ca 0 V 이상의 전위에 대 SCE)와 현재 최대 H2 산화 솔루션 유량에 따라 결정 됩니다. 52 mL/min (밝은 회색 voltammogram) 촉매 형상 추가를 구분 하지 않습니다 위에 유량에서 유량은 증가 합니다.

그림 6 초기 활성화 및 혐 기성 재-0 V vs SCE (아래는 Ar 분위기, 4.3에 설명 된 대로)에서 산화 후 고 아래 혐 기성 산화 비활성화 후 Ni-B의 ν공동 밴드의 상대 농도 비교 Ar는 (5.1에서 설명)으로 연속 실험에의 한 0 V vs SCE 48 시간 후에 대기권. 활성 사이트 밴드 강도의 손실 측정, 동안 관찰 하 고 모든 Hyd1 샘플 적용된 잠재력에 응답.

그림 7 에서는이 작품을 통해 사용 기준 개정 절차를 보여 줍니다. 액티브 사이트 (그림 7는) 지역에서 Hyd1 샘플의 절대 스펙트럼에는 물으로 인해 상당한 곡률을 포함 되어 있습니다. 사실, 용 매로 물을 사용 하는 요구 사항을 생명 과학에서 IR 분광학의 대부분의 응용 프로그램에 대 한 문제 이다. 절대 스펙트럼 (그림 7b), Savitsky-Golay 9 포인트 창에 부드럽게와 근원 소프트웨어를 사용 하 여 계산의 두 번째 파생 곡선 배경 Hyd1 활성 사이트의 날카로운 밴드를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 두 번째 파생 스펙트럼을 사용 하 여 대략적인 피크 위치의 식별 초기 앵커 포인트를 활성 사이트 밴드 ( 그림 7는에 원형)의 무료 절대 스펙트럼의 영역에 배치 될 수 있습니다. 입방 스플라인 함수 다음 기준 수정 스펙트럼 Hyd1 액티브 사이트 (그림 7 에서 발생 하는 봉우리만을 포함 하 게 절대 스펙트럼에서 뺀 다음 수 기준 함수를 만들려면 이러한 앵커 포인트를 통해 장착 c)입니다.

그림 8 -매출 (Ar 분위기)와 전위의 범위에서 회전율 (H2 분위기) 조건에서 Hyd1에 PFIRE 측정의 결과 보여 줍니다. 36 현재 시간 추적 (그림 8는) 보고서 각 촉매 전류에 잠재력을 적용 하 고 비 매출 조건 (Ar 분위기)에서 제로 전류 가까이 남아 있다. 그림 8b 부분 spectroelectrochemical 산화 환 원 적정 촉매 회전율의 부재에서 각 잠재력에 기대의 분포를 보여 주는 액티브 사이트의 평형 redox 동작에 따라서 보고 합니다. 그림 8c 스펙트럼 (H2 분위기)에서 매출 조건 하에서 기록 된 고 따라서 Hyd1에 의해 촉매 H2 산화 동안 활성 사이트의 정상 분포를 나타냅니다. 촉매 H2 산화 현재 (그림 8는, H2) −0.199 V −0.074 V vs 그녀;에서 시간의 기능으로 일정 하 게 유지 하는 사실에 의해 확인 된다 정상 상태 조건 달성 +0.356 V에서 전류에 점진적 붕괴 vs 그녀 Hyd1의 유명한 혐 기성 산화 비활성화 예정 이다. 55 활성 사이트의 배포는 명확 하 게 모든 잠재력에 Ar과 H2 에서 다른 Hyd1 촉매를 수행 (그림 8b, −0.199, −0.074 및 +0.356 V 스펙트럼 vs 그녀). 그러나 Ar과 H2 에 아래에 기록 하는 스펙트럼은 −0.594 V vs 그녀, 거의 동일, 그리고이 실험 일관성;의 중요 한 테스트를 나타냅니다. Hyd1 pH 6.0 ( 그림 8는 Ar과 H2 에 전류는 0에 가까운)에 상당한 속도로 H+ 를 감소 하지 않습니다 그리고 −0.594 V에 스펙트럼 따라서 같은 것으로 예상 된다.

그림 9 에 혐 기성 산화 비활성화 방법을 보여 줍니다. Hyd1 통해 +0.35636 대에서 H2 산화 중 Ni-B Ni-시에서의 형성의 스펙트럼은 현재 시간 추적에 회색 시간 간격 동안 기록 되었다 그림 9는에. −0.074에서 V Hyd1 산화 비활성화를 받아야 하지 않습니다 하 고 활성 사이트의 배포 전체 잠재적인 단계에 걸쳐 일정 하 게 유지 합니다. 이것은 그림 9b나, −0.074 잠재적인 단계, 및 나중에 기록 된 그림 9bii 의 시작에 절대 기준 수정 스펙트럼을 보고 스펙트럼에 의해 증명 잠재적인 단계에서 시간과 그림 9b나상대적인 차이 스펙트럼으로 보고 됩니다. 그림 9biii 에 스펙트럼 및 biv 또한 그림 9b나, 상대적인 차이 스펙트럼으로 보고 하 고 잠재적인 높은 동안 Ni-b Ni-네의 점진적 변환 표시 비활성화, 그림 9는에서 +0.356 V에서 전류에서 단조 감소와 일치.

솔루션 산도의 범위에서 기록 된 스펙트럼 촉매 Hyd1 동안 단계 주기 양성자 전송에 통찰력을 줄. 43 그림 10 pH 3.0 및 pH 9.0, 실험적인 버퍼 교환 spectroelectrochemical 셀에서 솔루션 흐름을 사용 하 여 동일한 Hyd1 필름에 기록 하는 PFIRE 스펙트럼을 보여줍니다. Ni C 및 Ni-L의 상대 농도이 두 스펙트럼에 명확 하 게 다르다. 비-매출 조건 하에서 적용된 가능성을 변화 하 여 NiC 및 Ni-L의 잠재적인 의존 상태 pH 값 (그림 10의b)의 범위에서 빠르게 확인할 수 있습니다 그리고 두 국가 발견 isopotential 넓은 pH 범위. ( 그림 10b 피크 absorbances만 편의상, Hyd1의 titrations 히 달고 그 외 여러분에 의해 보고 된 전체 redox Ni C와 Ni L 상태 표시 note) 36 Ni C 및 Ni-L의 농도의 pH 적정 다음 추출할 수 있습니다, 잠재력에서 최대 흡 광도 복용 하 여 총 Ni C와 Ni L 농도그림 10(c) 각 pH에서 최대 이다. 이 방법에서는, 및 EPR 데이터와 함께에서, Ni C와 Ni L 상태 사이 pH 평형 확인 되었습니다. 43

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그림 1: 적외선 분석기, 혐 기성 글러브, ATR 액세서리, MCT 발견자 배열의 회로도 가스 흐름 시스템 및 PFIRE 측정을 위해 사용 하는 potentiostat. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-2
그림 2: 입구/출구 연결 전극 및 솔루션의 배치를 보여주는 PFIRE 측정을 위해 사용 되는 spectroelectrochemical 셀의 회로도. 셀 및 baseplate 폴 리 에테르 에테르 케 톤 (PEEK)에서 탄소 막대 전극 연결, Pt 와이어 카운터 전극, 포화 calomel 참조 전극 및 솔루션 입구 및 출구를 위한 나사 구멍 가공 됩니다. 포화 calomel 참조 전극 건설 이전으로 보고 됩니다. 36 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 3: 분노에 입금 하 고 버퍼 리하이드레이션 된 카본 블랙 Hyd1 수정 입자의 흡 광도 스펙트럼. 내가 밴드 아 미드, 아 미드 II 밴드, 그리고 Hyd1 액티브 사이트 지역의 위치 C-H 스트레칭 진동 및 용 매 물 추가 기능이 표시 됩니다. 삽입 표시 vCO 와 vCN 밴드와 액티브 사이트 영역의 확대 보기를 표시 합니다. '로 준비 된 ' 입자 산화, 비활성 Ni-B 상태에 주로 Hyd1 포함 되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 4 : −0.8 V vs SCE 감소 - 산화 차이 스펙트럼으로 H2 대기권의 밑에 Hyd1의 활성화. 산화 낮은 잠재적인 활성화, 비활성 Ni-B (및 Ni-네의 작은 농도)는 더 감소, 활성 상태 Ni-C, Ni-R 및 Ni-L. 참고 Hyd1 Ni-L과 Ni-r.의 두 가지 하위 상태는 변환 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 5 : Spectroelectrochemical 셀에 기록 된 촉매 순환 voltammograms의 형상에 솔루션 유량의 영향. Voltammograms H2의 흐름 속도 증가에 기록 되었다-표시 된 버퍼를 포화. 20 mL/min (레드)의 흐름 속도 voltammogram 앞으로 스캔 0 V vs 그녀 위에 중요 한 비활성화를 보여줍니다. 이상 52 mL/min 흐름 속도로 비활성화의 정도 훨씬 낮은 이며 현재 모든 잠재력에 유량의 독립. 다른 매개 변수: H2를 10 mV/s 스캔 속도 바 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 6 : 기준선 0 V vs SCE에서 산화, 비활성 Ni-B 상태 활성 사이트 ν공동 지역에서 IR 스펙트럼 수정. 활성 사이트 강도의 측정 손실 연속 PFIRE 측정의 48 h 동안 이며 따라서 Hyd1 튼튼하게 카본 블랙의 입자에 흡착 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 7: 데이터 처리에 사용할 기준선 보정 절차의 세부 사항. 초기 앵커 포인트는 어떤 ν ν와공동 CN 봉우리 두 번째 파생 상품 분석 (b)에서 식별을 방지 하도록 활성 사이트 (한), 지역에서 절대 흡 광도 스펙트럼에 배치 됩니다. 결과 기준 수정된 스펙트럼 (c)에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 8: -매출 (아칸소)와 회전율 (H2) 조건에서 Hyd1에 PFIRE 측정. spectroelectrochemical 셀 아칸소 포화 (회색) 및 H2에 Hyd1의 (는) 현재 시간 흔적-포화 (검정) 버퍼; (b), (c) PFIRE 스펙트럼 보여주는 Ar (b) 및 H2 (c) 각 잠재력에 ν공동 지역. 잠재력 V vs 그녀 인용. 히 달고 외 허가 재현 35 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 9: Ni-B Ni-시에서의 형성을 통해 Hyd1의 혐 기성 비활성화. (는) 현재 시간 추적 +0.356 V에 안정적인 electrocatalytic −0.074 V와 느린 혐 기성 비활성화 (단조 감소 전류에서) 현재를 보여주는 H2 분위기에서 대 그녀. (b) 스펙트럼 기록에 표시 된 회색 음영된 지역 중 (a). 스펙트럼 b나 −0.074 V 잠재적인 단계 시작 부분에 기록 된 기준 수정된 스펙트럼 이다. 스펙트럼 bii, −0.074 V 단계에서 나중에 기록 된 b나 상대적인 차이 스펙트럼으로 보고 되 고 −0.074 V에 잠재력의 안정성과 일관 된 활성 사이트의 분포에 변화가 발생을 보여줍니다. 스펙 트 라 b세 , biv b나 상대적인 차이 스펙트럼으로 보고 또한 및 +0.356 V에 혐 기성 비활성화 중 Ni-b Ni-네의 점진적 변환 표시 vs 그녀. 히 달고 외 허가 재현 35 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 10 : 스펙트럼 솔루션 pH의 범위에서 기록 된 Hyd1 촉매 주기 동안 단계 양성자 전송에 통찰력을 주지. (한) IR 스펙트럼을 보여주는 Hyd1, ν공동 지역 pH 3.0 (-54 mV vs 그녀)와 pH 9.0 (-334 mV vs 그녀)에서 기록. (b) Spectroelectrochemical titrations는 Ni C와 Ni L 농도 솔루션 pH 값의 범위에서 최대 잠재력을 결정 하기 위해 실시 했다. Ni C와 Ni L 농도만 Hyd1 참조 히 달고 외 의 전체 spectroelectrochemical 적정에 대 한 이해를 돕기 위해 표시 됩니다. Ni C 및 Ni-L, 일련의 (b)에 표시 된 같은 실험에서 결정의 상대 농도의 36 (c) pH 의존성 스펙트럼은 20 ° c.에서 기록 했다 머피 외 허가 적응 42 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

PFIRE 산화 환 원 전극 움직일 단백질을 해결 하기 위한 광범위 하 게 적용 가능한 IR 분 광 기술입니다. 특히, 산화 환 원 효소의 electrocatalytic 반응 빠른 회전율 조건 하에서 조사 될 수 있습니다. PFIRE 메서드는 PFE 없습니다 직접 구조 정보를 제공 하 고 탄소 전극에 IR 분광학을 커플의 기술에 의해 제공 하는 직접 전기 컨트롤 작성 합니다. PFIRE 접근 따라서 혼자 전기 화학에서 사용할 수 있는 정보에 화학 통찰력을 추가 하 고 공부에 매우 적합 한 산화 단백질 및 효소의 분자 바인딩 및 활성화에 관여. 또한, PFIRE 촉매 회전율의 부재에 있는 단백질에 잠재력 종속 구조 변화에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 비-매출 전자 전송 이벤트 들은 PFE의 '표준' 응용 프로그램을 사용 하 여 감지 하기 어려운 푸리에 변환 AC voltammetry PFE의 확장 큰 성공을. 와 함께 사용 되었습니다. 45 , 46

PFIRE 메서드는, 원칙적으로, PFE를 사용 하 여 공부 될 수 있다 산화 환 원 단백질 든 지의 연구에 적합. 따라서, PFE와 마찬가지로 단백질 흡착 성공적인 PFIRE 실험에 대 한 중요 한 단계입니다. 이 프로토콜에서 우리는 PFIRE 기술 사례 연구로 대장균 Hyd1를 사용 하 여 응용 프로그램을 설명 합니다. 36 , 그러나 43 , 우리는 또한 적용 PFIRE 기술을 R. eutropha,44 에서 세포질 규제 hydrogenase 플 라빈 mononucleotide 카본 블랙에 흡착 하 고. 40 이 모든 경우에 수정 되지 않은 높은 표면적 카본 블랙 (로이 프로토콜에서 설명)을 간단한 물리적 흡착 높은 신호 대 잡음 비율 기록 좋은 품질 적외선 스펙트럼을 충분히 높은 단백질의 표면 적용을 제공 합니다. 흡착의 이러한 높은 레벨을 얻을 수 없는 경우에 그것은 전극 표면에 단백질의 공유 첨부 파일을 허용 하도록 예, 탄소 입자의 표면 수정 해야 합니다. 60 , 61 , 62 PFIRE 측정 한 글러브를 사용 하 여 때만 필요한 공부 샘플을 anaerobically를 처리 해야 합니다. 그러나 매우 일정 한 연습 및 글러브 분위기에서 제공 하는 수증기의 낮은 (< 80 ° C 이슬점) 수준에서 아주 작은 absorbances의 추출 수 있는 높은 신호-잡음 레벨을 제공 합니다. 44 많은 경우에는 혐 기성 환경, 글러브에서 제공 하는 또한 전기 화학 측정 (PFIRE 기술에 통합)에 대 한 바람직한 작업 전극에 O2 감소 때문에 현재를 피하기 위하여.

대량, 실험적인 버퍼에 샘플 흡착은 탄소 입자 IR absorbances 모든 실험 스펙트럼에 크게 기여할 고의 밴드를 겹칠 수 있는 관심, 특히는 아 미드에에서 I, II 및 III의 지역에서 스펙트럼입니다. 63 아 미드 지역에는 또한 flavins 또는 니코틴 cofactors로 기판 및 많은 산화와 감소 반응의 제품 유기 종에서 정보가 들어 있습니다. NiFe hydrogenases의 경우 활성 사이트의 ν ν와공동 CN 밴드 스펙트럼의 상대적으로 명확한 지역에 빠지게 하 고 그래서 PFIRE 기술을 아주 잘이 효소의 연구에 적합 하다. 그러나 다른 경우에, 차이 스펙트럼 동위 원소 라벨 접근 함께 필요할 수 있습니다 변경 고정된 단백질 인 분리. 비슷한 접근 식별, 예를 들어 protonation 변경, 구조상 재배열 하 고 Michaelis Menten 단지 적외선 분광학을 사용 하 여 공부에 사용 되었습니다. 64 , 65 , 66 PFIRE는, 그러므로, hydrogenases의 연구 하지만 모든 산화 단백질 포함 된 (또는 누구의 기판, 제품 또는 억제제 포함)에 적용할 수 있는 그룹 진단 IR 액티브 진동; 일산화 탄소 dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40 및 편대 dehydrogenases, 예를 들면.

관련된 기술, 세이 라, 아주 잘 biomimetic 환경에서 막 관련 단백질의 연구에 적합 하다. 32 세이 라 IR 분광학을 또한 ATR IR 구성을 사용 하 여 ATR 프리즘 (분노)의 표면에 분자 내에 있는 가까운 (몇 nm)의 IR 흡 광도 증폭 하는 표면 강화 효과의 사용의 적응 이다. 세이 라 절 묘하게 용 매에서 경쟁 신호에서 상대적으로 자유롭다 흡착된 단백질 및 막 아키텍처 내에서 발생 하는 스펙트럼 변화에 민감한 따라서 이며 기판/억제제 솔루션에서 제시. 이것은 분노의 표면 위에 상당히 큰 침투 깊이에 의존 하는 여기에 설명 된 PFIRE 기술은 달리 약간 (~ 1 μ m), PFIRE는 기판에 더 민감한 의미, 제품 또는 억제제 솔루션에서 제시. 이 증가 감도 '대량' 용 매를 유리할 수 있다; 기판 또는 제품 적외선에 의해 직접 관찰 될 수 있다, PFIRE 스펙트럼 긴 활성 종 및 electrocatalysis 중 관련된 제품 형성의 두 안정 상태 활동에 보고 합니다. 69 기질과 제품의 정상 상태 농도 관찰 하는 능력 (는 CO에 CO2, 강한 적외선 흡수의 가역 산화 catalyzes) 일산화 탄소 효소 등 효소에 대 한 특히 도움이 될 것입니다 또는 (는 CO2편대의 가역 산화 catalyzes) 편대 효소

현재, PFIRE 데이터 수집 및 ATR IR 형상에 대 한 분노의 표면에 효소를 '집중' 하는 데 사용 하는 거시적인 탄소 전극 인 효소 electrocatalysis의 정상 상태 운동 연구로 제한 됩니다. 이 점에서 NiFe hydrogenases의 PFIRE 학문은 빛 트리거 과도 흡수 적외선 분광학을 사용 하 여 하위 매출 달성 속도 론 연구49,50 다이어와 동료 들의 작품을 보완. 작업은 진행 spectroelectrochemical 셀,40 을 소형화 하 고 microelectrodes의 사용으로 달성 해야 마이크로초 순서 시간 분해능. 이 ca 까지 회전율 주파수와 효소에 대 한 하위 매출 달성 속도 론 연구-1100-500의 하면 그리고 감소 그리고 산화 과정의 연구를 수 있게 된다.

전반적으로, PFIRE 정상 상태 조건 하에서 산화 환 원 효소의 electrocatalytic 반응의 화학 특성을 허용 하는 광 기술입니다. PFIRE 접근 여러 화학 및 전기 화학 titrations를 단백질의 강력한 흡착을 제공 하는 높은 표면적 전극 사용으로 ATR IR 형상 허용 손쉬운 솔루션 exchange 같은 효소 샘플에 실행 될 수 있습니다. 효소 기능 중 같은 구조 정보를 현장에서 수집 하는 더 넓은 bioelectrochemistry 지역 사회에 대 한 귀중 한 도구입니다.

공개 사항

저자는 경쟁 금융 관심을 선언합니다.

감사의 글

K.A.V.와 P.A.A.의 작품 유럽 연구 위원회 (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), 공학 및 물리 과학 연구 위원회 IB 촉매 상 EP/N013514/1, 그리고 생명 공학 및 생물 과학 연구에 의해 지원 되었다 위원회 (BB/L009722/1 및 BB/N006321/1). 상대습도 정부의 데 많은 y Tecnologìa, 코스타리카 대학, 링컨 대학, 옥스포드에 의해 지원 되었다. 저자 찰리 존스 씨, 씨 찰리 Evans 및 기계 워크숍 (화학과)의 설계 및이 작업에 사용 하는 spectroelectrochemical 세포의 제조에 도움에 대 한 인정 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
분광계Agilent680-IR(외부 MCT 검출기 포함
ATR 액세서리Pike TechnologiesGladiATR5-반사 Si IRE
Glovebox GloveBox Technology Ltd.N/A혐기성 시료 취급 및 측정을 위해 맞춤형으로 설계된 '습식' 및 '건식' 상자
KBr 창CrystranCustom글로브박스와 FTIR 분광계의 외부 빔을 결합할 수 있도록
광학 장치AgilentN/APM-IRRAS 액세서리의 구성
요소 Silicon IRECrystal GmbHCustom사다리꼴: 8.4mm x 5mm(큰 면), 1mm 두께, ca 39도 면각도
전위차MetrohmAutolab PGSTAT 128N
Nova 10.1위차 펌프 제어를 위한Metrohm
Williamson Manufacturing Company LtdQL-1000-024-300
Pt 와이어Surepure Chemetals327299.95% 순수 백금 와이어, 0.014 inch 직경
카본 로드WH Smith307292090.7 mm HB 연필심
카본 블랙Cabot CorporationBlack Pearls 2000
초음파 수조UltrawaveU10035 W
원심 필터Merck MilliporeUFC5050BKAmicon Ultra, 50 KDa MW 컷오프
마이크로 원심분리기Eppendorf5452000018미니스핀
NaCl시그마71376
H2SO4피셔S/9240/PB17
HNO3피셔N/2300/PB17
실리콘 실란트암소 코닝 Toray Co., Ltd.SE 4486
카본지TorayTGP-H-030
H2 가스BOC
N2 가스BOC
OriginPro 2015OriginLab데이터 분석/그래프 소프트웨어
Resolutions Pro 4.0FTIR 분광계 제어용Varian
) 와 함께 사용하도록 맞춤 제작됨추가 전 소프트웨어 소프트웨어

참고문헌

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