생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

Summary

이 방법에서는, 우리 photopolymerization를 사용 하 고 제공 하는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels의 표면에 단백질 또는 펩 티 드 패턴을 만들 수 클릭 화학 기법 움직일 생리 신호 vitro에 세포질 응답의 연구에 대 한 .

Abstract

많은 생물학 자극 셀 동작 및 줄기 세포 분화에 영향을 미칠 수 있다. 일반 셀 문화 접근 제어 셀 동작에 매체 내의 수용 성 요소에 의존합니다. 그러나, 녹는 추가 특정 매트릭스 바인딩된 성장 인자와 같은 모티프, 신호, 셀 셀 신호, 및 일반적인 영향 세포에는 공간 생 화 확 적인 신호를 모방 수 없습니다. 또한, 기판 강성 같은 매트릭스의 생물 속성 하지 쉽게 조작 되 기존의 셀 경작 관행을 사용 하 여 셀 운명에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이 방법에서는, 우리는 합성 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels 광화학을 사용 하 여에 꽃무늬 생리 활성 단백질을 제공 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 플랫폼 기판 강성 및 공간 생 화 확 적인 신호는 독립적으로 제어할 수 있습니다. 이러한 hydrogels 순수 관련 강성 값의 큰 범위를 얻을 수 있습니다. 또한, 이러한 hydrogels 표면 생리 활성 펩 티 드와 photopatterned 또는 단백질 thiol ene 통해 클릭 화학 반응. 이러한 메서드는 표면 동원 정지 후 단백질 기능을 유지 하기 위해 최적화 되었습니다. 이 어떤 단백질 또는 펩 티 드의 다양 한 패턴을 만들에 적용할 수 있는 다양 한 프로토콜입니다. 마지막으로, 이러한 생리 hydrogels의 표면에 시드 셀 그들은 공간 특정 신호에 응답 시간이 지남에 모니터링할 수 있습니다.

Introduction

셀 동작에 영향을 주는 많은 자극을 확인 하 고 있습니다. 일반적으로, 일반적인 셀 자란 기법; 세포질 응답 유도 용 해 요소에 의존 그러나,이 접근 방식에는 한계가 있다. 이러한 메서드는 일반적으로 모든 신호 모티브를 정확 하 게 표시 수 없습니다 vivo에서. 이러한 신호 메커니즘 등 분리 된 성장 인자, 세포-세포 신호, 공간 특정 생 화 확 적인 신호입니다. 또한, 기판 강성 셀 동작 및 줄기 세포 분화에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 하 고 일반적인 셀 자란 사례^1,2를 사용 하 여 쉽게 조작 하지는. 소재 접근 이러한 신호 메커니즘을 탐험을 시작 하는 새로운 플랫폼을 제공 합니다. 특히, hydrogels 기판 강성^3,4, immobilizing 단백질 및 펩 티 드^5,6, 튜닝 하 고 공간적으로 특정 패턴^7, 을 만들기 위한 우수한 후보자는 ⁸.

Hydrogels 건설 기계 조직 공학 세포 외 기질 (ECM)^9,10그들의 생물 및 생 화 확 적인 공통점 때문에 일반적으로 사용 됩니다. 천연 고분자 생체 고 신체의 많은 조직에서 발견 되는 건설 기계에 대 한 일반적인 선택입니다. 천연 고분자를 사용 하 여 기판으로의 한계는 그들은 bioconjugation에 대 한 쉽게 조작된 화학 moieties 부족 이다. 다른 한편으로, 합성 hydrogels 같은 말뚝,으로 우수한 플랫폼 대상된 화학^11,12. 또한, 말뚝 hydrogels 세포질 응답을 유도 하지 않습니다 하 고 따라서 생리 건설 기계를 만들기 위한 불활성 등뼈로 사용 됩니다.

만들려면 생리 hydrogels, photopolymerization 그리고 thiol ene 클릭 화학 반응 고용 됩니다. 이 photoreactions는 photoinitiator와 UV 광원을 필요로합니다. Photoinitiators는 UV 빛을 소개 하 고, 채권 양식 기를 휴식. 논문 래 디 칼 개시 반응에 필요 하지만 단백질 bioactivity^12,13에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, photoinitiator 및 단백질 bioactivity를 유지 하기 위해 자외선 노출 시간을 최적화 하기 위해 결정적 이다.

이 방법에서는, hydrogels 아크릴-아크릴 체인 성장 photopolymerization 통해 합성 됩니다. 못-빛 (PEGDA) 단위체 분기 폴리머 네트워크는 하이드로 겔의 구조에 대 한 책임을 형성 하기 위하여 서로 함께 반응. 솔루션 내에 젤 선구자 PEGDA 단위체의 농도 기판 강성을 제어 합니다. 때문에 작은 크기는 하이드로 겔의 기 공, fibronectin 같은 ECM 단백질 셀 첨부 파일을 위해 하이드로 겔 내에서 쉽게 통합 될 수 있다. 마지막으로, 이러한 hydrogels 생리 활성 펩 티 드 표면 패턴 또는 단백질 thiol ene 통해 클릭 화학 반응. 여기, 하이드로 겔 시스템 내에서 unreacted 무료 아크릴레이트 단백질 또는 펩 티 드 UV 빛에 노출 되 면에 있는 무료 thiols와 반응 합니다. 단백질 또는 펩 티 드 히드로 표면에 움직일 수 있다, 후는 히드로 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 동안 bioactivity의 손실 없이. 이 편의성, 유연한 실험 계획 및 연구소 간의 협력에 대 한 가능성을 제공 합니다. 전반적으로,이 플랫폼 biomechanical 및 공간 생 화 확 적인 제어, 서로 독립적으로, 세포질 행동에 영향을 기회에 대 한 수 있습니다.

Protocol

1. 하이드로 겔 합성에 대 한 자료 준비

PEGDA, 리튬 페 닐-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (무릎), 그리고 fibronectin 무 균 조건 하에서

1. 준비 재고 솔루션 기반 계산 (표 1A).
   1. 밖으로 무게와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 화합물을 디졸브. 일반적으로, PEGDA 솔루션 농도 사이 50 및 200mg/mL (5-20% 무게/볼륨) 작업을 유지 관리 합니다. 살 균을 위한 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 PEGDA 솔루션 플라스틱.
      참고: PEGDA 솔루션 호 일 빛에서 그들을 보호 하기 위해 배치로 덮여 유지. (권장) 각 실험에 대 한 PEGDA의 신선한 솔루션 준비.
   2. Reconstitute fibronectin 단백질 분말 제조 업체에 따라 ' s 추천. 1 mg/mL, aliquot에서 fibronectin 재고 솔루션을 유지 60 ~ 100 µ L aliquots에 그것을 사용까지-20 ° C에서 그들을 저장 하 고. 몇 시간 동안 4 ° C에서 aliquots를 녹 이십시오 또는 하룻밤 전에 사용. 단백질 주식 살 균 조건에 이미 제공 하지 않으면, 0.22 μ m 주사기 필터를 사용 하 여 살 균에 대 한.
      참고: Fibronectin 셀 첨부 파일에 사용 됩니다. 다른 ECM 단백질 대용 될 수 있다.
   3. 무릎 밖으로 무게를 재고 솔루션에 대 한 PBS에 녹; 전형적인 재고 농도 25 mg/mL 이다. 용 해와 어떤 문제가 sonicate. 살 균을 위한 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다. 호 일 포장으로 무릎을 커버 하 고 몇 개월까지 4 ° C에서 그것을 유지.
      참고: 무릎은 photoinitiator는 광화학에 대 한 사용.
2. 하이드로 겔 형성에 대 한 살 균 유리 슬라이드 금형을 준비.
   1. 오토 클레이 브는 폴리에스터 시트; 각 젤 형을 위해 필요할. 적어도 2 시간에 대 한 70% 에탄올에서 두 개의 유리 슬라이드와 각 젤 형에 대 한 3 명의 플라스틱 스페이서 (두께 0.5 m m)를 적시십시오 하지만 일반적으로 하룻밤 담가 수 있도록. 사용 하기 10 분 전에 대 한 70% 에탄올에 각 젤 형에 대 한 5 개의 바인더 클립을 담근 다.
   2. 장소 유리 슬라이드, 스페이서, 및 작은 압력가 시트에 바인더 클립 있도록 공기 건조 몇 시간 동안 세포 문화 후드에서.
   3. 유리 슬라이드의 가장자리 주위에 플라스틱 스페이서를 배치 하 여 준비 히드로 금형. 두 번째 유리 슬라이드를 위에 놓습니다. 바인더 클립 위에 긴 양쪽에 2 개 나란히 단단히 스페이서 보안.
      참고: 경우이 제대로 조립 하지는 젤 솔루션 것입니다 밖으로 누출.
   4. 표면 소독 셀 문화 형 후드 사용 하기 30 분 전에 대 한 자외선. 중간을 통해, 플립 두 표면 노출 형.

2. 무료 Thiol 단백질 수정

1. 아민 단백질 (표 1A)에 thiol로 변환 하기 위한 스프레드시트에서 계산을 사용 하 여 재고 솔루션 준비.
   반응 버퍼 수 있도록
   1. pH 8에 PBS를 조정 하 고 5 mM EDTA를 추가. 피 펫 멸 균에 대 한 0.22 μ m 주사기 필터에 반응 버퍼.
      참고: EDTA은 중요 하다, 그것은 이황화 결합 형성에서 thiols를 보호. Thiol 그룹 반응 발생에 대 한 그들의 감소 된 모양에서 유지 되어야 합니다.
   2. 2 iminothiolane 밖으로 무게 (Traut ' s 시 약) 2 mg/mL (14mm)의 재고 솔루션 농도 대 한 반응 버퍼에 그것을 분해 하 고. 살 균을 위한 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다. 몇 개월까지 4 ° C에서 재고 솔루션 저장.
      참고: 2-iminothiolane는 분자 단백질에 솔벤트 노출 무료 아민과 반응 하 고 무료 thiols로 그들을 변환 합니다.
   3. Reconstitute 0.1와 1 mg/mL 농도에서 반응 버퍼에 단백질. 하지 않는 한 이전 살 균, 살 균에 대 한 0.22 μ m 주사기 필터를 통해이 솔루션을 플라스틱.
      참고:이 단백질은 하이드로 겔 표면에 무늬 생 화 확 적인 신호 이다. 또한, 단백질 농도 다를 수 있습니다, 높은 농도 이상적 강한 단백질 패턴.
2. 2 iminothiolane와 단백질 둘 다 재고 솔루션을 함께 혼합 하 여 반응; 표 1B를 사용 하 여 올바른 볼륨 비율. 일반적으로 단백질을 8:1 2 iminothiolane의 어 금 니 비율을 사용 하 여.
   참고: 큰 단백질 이상 농도 희석, 2-iminothiolane의 높은 어 금 니 비율을 사용 합니다. 제조 업체를 참조 ' s 프로토콜 ¹⁵.
3. 품 실 온에서 1 h에 대 한 반응. 제조 업체에 따라 나머지 반응에서 thiolated 단백질 제품을 제거 하려면 염 스핀 마이크로-열을 사용 하 여 ' s 프로토콜 ¹⁶.
   참고:이 수 지의 배제 한계는 5 KDa.
4. 사용 덮어 ' 단백질 당 무료 thiols의 수 양적 측정 분석 결과 s. 제조 업체에 따라 ' s 프로토콜 분석 결과 ¹⁷.

3. 하이드로 겔 형성

1. 만들기 젤 전조 솔루션 값에 따라 표 1 c에서 계산. 믹스 함께 PEGDA, fibronectin, 및 무릎 볼륨. 균질 성 해결책을 보장 하지만 거품을 만들지를 적극적으로 솔루션 플라스틱 솔루션은 빛 으로부터 보호 유지.
2. 플라스틱 젤 전조 솔루션 젤 형의 두 유리 슬라이드 사이 신중 하 게. 일반적으로, 금형에 800 그리고 1000 µ L 사이 볼륨을 추가 합니다. 노출 형 UV 빛을에 젤 솔루션 (파장: 365 nm, 전원: 3-4 mW/cm ²) 1-2 분은 하이드로 겔 형성.
   참고: 그것은 기능을 패턴화 표면 단백질 제한으로 장기간된 자외선에 하이드로 겔을 노출 하지 마십시오.
3. 바인더 클립 제거 하 고 부드럽게 두 측면 스페이서에 압력 반대 위치에 적용 하 여 최고의 유리 슬라이드를 제거.
4. 적절 한 크기의 생 검 펀치를 사용 하 여 하이드로 겔 샘플을 잘라. 복제 역할 및 샘플 제어 젤 사각형에서 여러 hydrogels 퇴근.

4. 하이드로 겔 강성 측정

8mm 병렬 플레이트 고분자에 대 한

1. 펀치 hydrogels는 8 개 m m 직경 생 검 펀치. 고분자에 한 하이드로 겔 샘플을 로드 (재료의 표 참조).
2. 낮은 병렬 플레이트 형상 만들기까지 직경에서 8 m m 즉 젤의 표면 접촉. 0.5 m m 두꺼운 하이드로 겔 샘플 0.5 m m의 간격 거리를 유지.
3. 0.1% 변형, 0.1 Hz 주파수, 및 37에 5 분에 대 한 수행 시간 스윕 ° C. 평균 G ' 각 시간 청소 값. 각 구성의 복제에 대 한 독립적인 hydrogels 실행.
   참고: G ' 값 한다 안정적일 시간 포인트; 그들은, % 변형 및 주파수 스윕 적절 한 선택 하려면 수행 해야 하는 경우 값 ¹⁴.

5. 단백질 패턴

1. 준비 컴퓨터 원조 설계 (CAD) 프로그램을 사용 하 여 포토 마스크에 대 한 원하는 패턴. 고해상도 프린터를 사용 하 여 투명 시트에는 포토 마스크를 인쇄 합니다. 사용 하기 10 분 전에 대 한 70% 에탄올에는 포토 마스크를 담근 다. 사용 하기 전에 셀 문화 후드에 건조 공기를 포토 마스크 허용.
2. 표면 패턴화 된 하이드로 겔의 표면에 2 단계에서 준비 하는 thiolated 단백질 해결책을 추가 합니다. 플라스틱 thiolated 각 컷 아웃 젤의 표면에 단백질 해결책의 1-2 µ L/c m ².
   참고: 그것은 단백질 볼륨;을 최소화 하는 것이 중요 균등 하 게 하이드로 겔 샘플의 전체 표면을 커버 하기에 충분 한 추가.
3. 신중 하 게는 히드로의 표면에는 포토 마스크를 놓습니다. 포토 마스크 및 하이드로 겔 표면 사이 공기 방울을 허용 하지 않습니다. 부드럽게 눌러 모든 거품을 제거 하는 마스크에 그 형태.
4. 노출 UV 빛의 두 번째 라운드에 하이드로 겔 (파장: 365 nm, 전원: 3-4 mW/cm ²) 30-60 미에 대 한
   참고: 패턴을 만들는 강력한 단백질 기능의 상실을 유발 하지 않고 충분 한 UV 빛에 노출 패턴에 중요 하다.
5. Hydrogels 제거 하 unreacted 종 고 잘 배지 내의 각 히드로 PBS로 세척. 각 잘;에 젤을 배치할 때 조심 패턴화 된 표면 위로 얼굴 인지 다는 것을 확인 하십시오. 4 ° C에서 PBS에는 젤을 씻어 젤은 4에 적어도 2 주 동안 안정적인 ° c.

6. 셀 시드 Hydrogels 준비

1. 뿌리기 전에 37 ° C에서 5-10 분에 대 한 기저 매체에 젤을 품 어. 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs), 성장 인자 없이 EGM 2 매체 사용 하 여. 각 추가 매체의 볼륨을 최소화 히드로 부동 방지 하기 위해 잘. 48-잘 접시 사용 매체의 250 µ L 볼륨.
2. 스핀 300 x에 접시 내려 g는 hydrogels 우물의 하단에 위치 하 고 부유 하지 3 분. 셀 뿌리기 직전 이렇게.

7. Hydrogels에 시드 셀

셀 시드를 위한

1. 사용 표준 살 균 포유류 세포 문화 절차 및 실험 절차. 표준 세포 분리 프로토콜을 사용 하 여 조직 배양 플라스 크에서 HUVECs를 제거 합니다. 살 균 PBS 가진 조직 문화 접시를 세척 하 고 37에서 3-5 분에 대 한 트립 신으로 품 어 ° c.
2. 초과 셀 매체 또는 트립 신 중 화제 솔루션 trypsinized 세포 현 탁 액을 끄다.
3. 5 분 신중 하 게는 상쾌한을 제거 하 고 계속 셀 펠 릿 세포 현 탁 액 300 x g에서 원심 분리기에 아래로 회전.
4. 없는 성장 요인으로 기저 EGM-2에서 셀 펠 릿을 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀 카운팅을 위한.
5. 추가 75000 셀/cm ² 각 하이드로 겔을 천천히 잘을 방해는 젤 각 센터에 pipetting으로 표면. 위치에서 37 ° c. 셀 문화 인큐베이터에 잘 플레이트 대 한 일, 주기적으로 관찰을 위한 접시 제거.

8. Bioactivity의 평가

1. 하룻밤에 37 ° C와 200 rpm에서 궤도 정지에서 파운드 국물에서 문화 E. 콜라이. 대장균 문화 아래로 회전 시키십시오, 가만히 따르다, 그리고 PBS의 최소 볼륨에서 셀 펠 릿을 다시 구성 하기. lysozyme 밖으로 무게 및 재고 솔루션 1 mg/mL에서 reconstitute.
2. 는 Microcentrifuge 튜브 lysozyme 재고 솔루션의 작은 양 (25 µ L) 플라스틱. 무릎 photoinitiator (0-12 m m)의 다양 한 레벨을 추가 하 고 UV 빛의 1 분 샘플을 노출. 별도 그룹에서 lysozyme 솔루션 랩 (2 mM)의 동일한 금액을 추가 하 고 다양 한 UV 빛 시간 샘플을 노출 (0-4 분). 각 치료에 대 한 복제를 포함.
3. 추가 동등한 양의 집중된 대장균 0.5 mg/mL의 최종 lysozyme 단백질 농도 대 한 각 lysozyme 샘플 솔루션. 실 온에서 4 h 혼합된 솔루션을 품 어.
   참고:이 시간 기능 lysozyme lyse 세균성 세포 벽 및 솔루션으로 단백질을 풀어 수 있습니다.
4. 치료 lysozyme 긍정적인 통제에 대 한 대장균과 인 큐베이 팅을 사용 하 여이 100% 생리 활성 측정을 고려. PBS 부정적인 제어로 혼자와 incubated lysozyme 솔루션을 사용 하 여.
5. 세포 파편을 제거 하 고 상쾌한을 유지 샘플 아래로 회전 합니다. 척도 lysate 박테리아의 양을 측정 하는 상쾌한 내 단백질의 총 농도를 Bradford 분석 실험을 실행.
6. 실행 제조 업체에 따라 Bradford 분석 실험 ' s 프로토콜 ¹⁸. 배 부정적인 제어에 비해 단백질 농도 변경 계산.

Results

못 hydrogels의 표면에 생리 패턴을 만들 수 프로토콜은 그림 1에 나와 있습니다. 스프레드시트 볼륨 및 각 재고 솔루션 (테이블 1A)에 대 한 농도 계산 하기 위해 개발 되었다. 단백질은 하이드로 겔의 표면에 움직일 수는 2-iminothiolane (그림 1B)로 수정 됩니다. 이 반응은 표 1B에서 볼륨을 사용 하 여 수행 됩니다. 선구자 히드로 솔루션 10% 무게/볼륨 랩 (그림 1A)와 PEGDA의 준비가 되어 있습니다. 다양 한 전조 PEGDA 농도 원하는 기판 강성 (그림 2A)를 사용할 수...

Discussion

이 프로토콜에는 생물 학적 응용에 대 한 생리 활성 단백질 패턴을 만들기 위한 방법을 제공 한다. 다른 실험을 위해이 프로토콜에 맞게 만들 수 있는 몇 가지 수정이 있다. 첫째, 셀 첨부 파일 요구 사항을 다른 세포 유형에 대 한 달라질 수 있습니다. 가난한 셀 첨부 파일은 젤을 처음 관찰 된 경우 솔루션 내에 전조 ECM 단백질의 농도 증가 시키는 것이 좋습니다. 다른 ECM 단백질 fibronectin, 콜라겐, laminin, 또는 조합을의 다른 종류를 포함 하 여 대신 사용할 수 있습니다. 각 유형에 새로운 셀, 셀 첨부 히드로 패턴화 이전 최적화 되어야 합니다. 이 프로토콜은 또한 사용자 설계 포토에 대 한 수 있습니다. 원하는 응용 프로그램에 따라, 포토 생산할 수와 함께 다양 한 크기, 모양, 및 전반적인 패턴 기능. 균일 한 동원 정지는 포토 마스크의 부재에서 얻을 수 있습니다.

이 프로토콜에는 특정 제한이 있습니다. 대표 결과에 강조...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEG-diacrylate (PEGDA)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-3400	합성하거나 다른 벤더를 통해 구매할 수도 있습니다. 다른 분자량을 사용할 수 있습니다.
리튬 페닐 -2,4,6- 트리메틸 벤조일 포스피 네이트 (LAP)			실험실에서 합성
피브로넥틴	코닝	356008
포토 마스크	파인 라인 이미징	n / a	고해상도 DPI의 투명 시트에 맞춤 인쇄
바인더 클립	다양한 공급 업체
소형 UV 광원 (365nm)	UVP	UVP-21	다른 UV 광원을 사용할 수 있으며 전력 보정이 필요합니다.
2-이미노티올란(피어스 트라우트) s 시약)	Thermo Sci.	26101
엘먼 s 시약: DTNB; 5,5-디티오-비스(2-니트로벤조산)	Thermo Sci.	22582
인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)	Lonza		통로 번호 6-10
EGM-2 Media	Lonza	CC31-56, CC-3162	EGM-2 성장 인자가없는 실험을 사용하였다. 세포 유지를 위해 전체 EGM-2 매체를 사용했습니다:
0.25% Trypsin EDTA	Life Tech	25200-056
Trypsin Neutralizer,	Life Tech	R-002-100
Centrifuge	, Various Venders
Hemocytometer	Hausser, Sci. Bright-line
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E6758
0.22&마이크로; m 필터	셀 트리트	229743
1mL 주사기
유리 현미경 슬라이드	Fisher Sci.	12-550C
플라스틱 스페이서	다양한 벤더		0.5mm 두께
70% 에탄올	BICCA	2546.70-1
바이오-쉴	바이오-쉴	19-150-0010
브래드포드 시약	BIO-RAD
탈염 수지 - Sephadex G-25	GE Healthcare	95016-754
Microspin Columns	Thermo Sci.
AR-G2 rehometer	TA 기기