헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS

요약

현재 메서드 여러 기판의 UHPLC MS 분석에 의해 HeLa 세포에서 히스톤 deacetylases (HDAC)의 isoform 특정 억제제를 식별 하는 역할. 이것은 생활에서 HDAC1 및 HDAC6 활동을 반영 하기 위해 개발 된 항 체 없는 메서드를 단일 isoform 셀 무료 분석 달리 셀 환경.

초록

새로운 히스톤 deacetylase (HDAC) 억제제에 대 한 검색 증가 약물 발견에 대 한 관심입니다. Isoform 선택 romidepsin, 클래스의 승인부터 스포트 라이트에서 되었습니다 내가 HDAC 억제제 암 치료, 그리고 여러 발성에 대 한 HDAC6 전용 억제제의 임상 조사에 대 한. 현재 메서드는 HDAC1 및 HDAC6 셀에 테스트의 금지 활동을 결정 하는 데 사용 됩니다. Isoform 활동 초 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (MS UHPLC) 분석의 특정 기판 처리와 치료 HeLa 세포와 알을 품을 사용 하 여 측정 됩니다. 메서드는 환경 내에서 셀 셀 무료 생 화 확 적인 분석 실험 격리 isoforms에 달리 생 HDAC 활동 반영의 이점이 있다. 또한, 합성 기판의 정량화에 기반 하기 때문에 메서드는 생 acetylated 단백질의 항 체 인식이 필요 하지 않습니다. 그것은 쉽게 여러 셀 라인 및 자동화 된 프로세스에 적응입니다. 메서드는 이미 neuroblasts에서 HDAC6-선택적 화합물을 찾는 유용한 증명 했다. 대표 결과 표준 HDAC 억제제 trichostatin는 (일반적인), MS275 이전으로 여기에 표시 됩니다 (HDAC1 전용), 및 tubastatin (HDAC6-특정) 헬러 세포를 사용 하 여.

서론

HDACs 효소 chromatin 구조 내에서 히스톤 deacetylate 수의 가족에 속한다. 그들은 또한 다른 단백질 기판은 cytosol에서 있고 다양 한 셀 구획에 있습니다. 18 HDAC isoforms의 총 세포 신호 뿐만 아니라 녹음 방송 요인 유전자 발현의 규칙을 포함 하 여 몇 가지 셀 메커니즘에 관련 된 고^{1,2,3,,45,,67}수송 지금까지 확인 된. HDAC 촉매 억제제는 암 치료에 대 한 잠재적인 치료 약물으로 떠오르고 있다. 현재 FDA에 의해 승인 대부분 HDAC 억제제 T-세포 림프 종 및 다 발성의 치료에 대 한 되며 vorinostat (사), belinostat, panobinostat^,89등 일반적인 HDAC 저 해제. 그러나, 부작용의 시리....

프로토콜

1. 세포 배양

참고: 다음 단계는 표준 조직 문화 후드에서 수행 됩니다. 메 마른 기술 친숙으로 예상 된다.

1. 헬러 세포 10% 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린 G 보충 MEM에 T75 셀 문화 플라스 크에서 80 %confluency 문화 (100 U/mL), 고 스 (100mg/mL).
   참고: 셀 문화, 치료, 그리고 세포 단계 층 류, 5% CO₂ 메 마른 조건 하에서 습도 분위기에서 수행 하는 37 ° C에서 셀 인큐베이션 단계에서 수행 됩니다.
2. DPBS의 5 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 발음 DPBS, 세포 분리 시 약의 1 mL을 추가. 셀을 분리 하려면 5 분 동안 37 ° C에서 품 어.
3. MEM 문화 매체의 9 mL를 추가, 철저 하 게 셀 서 스 펜 션, resuspend 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.
4. 6 x 10⁴ 셀/ml MEM에 세포 현 탁 액의 밀도 조정 합니다.
5. 100 µ L 셀 서 스 펜 션의 컨트롤을 추가 하 고 (그림 1A) 살 균, 평면-바닥, 조직 문화 취급 96 잘 접시의 우물을 테스트.

결과

HDAC1에 대 한 비 선택 및 선택적 억제제를 식별 하는 방법의 응용 프로그램을 (종류 I)와 HDAC6 (클래스 IIb), HeLa 세포는 알려진된 표준 화합물으로 치료 했다: trichostatin A (비-선택적 HDAC1와 HDAC6 사이)¹⁸, MS275 (HDAC1-선택적 억제제)¹⁹및 tubastatin (HDAC6-선택적 억제제)²⁰. 현재 방법 (그림 1)를 사용 하 여 IC₅₀ 값 수 수 직접 정한 살아있는 세포에 (봐서 MOCPAC deacetylation) HDAC1 및 HDAC6 (BATCP deacetylation 보고) (그림 2). Trichostatin A HDAC1와 HDAC6 강력한 .......

토론

HDAC 저해 약물 발견, 암 치료²¹HDAC6-선택적 억제제에 현재 초점에서 뜨거운 주제입니다. HDAC 선택도 일반적으로 개별 HDAC isoforms²¹으로 억제 효능을 결정 하는 높은 처리량, 셀 무료 분석 실험의 시리즈에 의해 평가 됩니다. 그러나, 억제제의 선택도 확인 되어야 합니다 또한 살아있는 세포에서 히스톤과 같은 내 생 단백질 기판의 acetylation 상태를 평가 하 여 (에 대 한 클래스 I HDACs) 및 tubulin (HDAC6)에 대 한. 따라서, 세포 항 체 인식 (예를 들어, immunostaining, 서쪽 오 점, cytometry, 고 애 란)를 포함 분석 실험은 일반적으로 필요한 isoform의 양적 또는 반 양적 평가 달성 하기 위해 생활에 주어진된 화합물의 힘²¹세포. 그것은 드문 셀 무료 효소 분석 결과에서 선택적 되었다 화합물 비-선택적 .......

재료

₂

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BATCP	시그마-알드리치	B4061
MAL	시그마-알드리치	SCP0168	동의어: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPAC	시그마-알드리치	M2195
MS275 시	그마-알드리치	EPS002
트리코스타틴 A	시그마-알드리치	T8552
투바스타틴 A	시그마-알드리치	SML0044
아세토니트릴, HPLC 등급	Fisher Scientific	10660131
포름산, LC/MS 등급	Fisher Scientific	10596814
H2O,	Milli-Q 정제 시스템을 통해 여과된 HPLC 등급
	ATCC	ATCC CRM-CCL-2
세포 해리 시약 TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013
DMSO, 세포 배양 등급	Applichem	146463
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190144
소 태아 혈청	Biowest	S1810
MEM	ThermoFisher Scientific	22561021
페니실린-스트렙토마이신	Bioconcept	4-01F00-H
10x RIPA 완충액	Abcam	ab156034
SigmaFast 프로테아제 억제제 정제	Sigma-Aldrich	S8820
96웰 플레이트, 멸균, 평면 바닥, 조직 배양 처리 Corning	VWR	29442-058
96웰 플레이트, 비멸균, V-바닥 Corning	VWR	29442-404	심분리 단계에서 사용
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