여기는 두 항 체 기반 단백질-단백질 상호 작용 연구 기법 제시: 면역 형광 및 immunoprecipitation. 이 기술은 물리적 상호작용 단백질 세포질 신호 통로의 소설 구성 요소의 발견 및 이해 단백질 역학 공부 위해 적당 하다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 단백질 상호 작용 이해 셀룰러 신호 폭포 및 식별 소설 통로 구성 요소 단백질 역학 중요 하다. 세포 활동의 대부분 필요 단백질 사이 육체적 인 상호 작용. 분석 하 고 이러한 상호 작용 지도, 다양 한 실험적인 기술 뿐만 아니라 생물 정보학 도구 개발 되었다. Autophagy는 영양 부족, 화학 물질 및 산소를 포함 하 여 다른 스트레스에 대처 하기 위해 셀 수 있도록 메커니즘을 재활용 휴대. Autophagy 관련 신호 이벤트를 더 잘 이해 하 고 단백질 복합물에서 autophagy 조절 하는 새로운 요소를 발견, 우리는 단백질 단백질 상호 작용 화면을 수행. 이러한 심사 결과의 유효성 검사에는 면역 형광 및 immunoprecipitation 기술을 사용을 해야합니다. 이 시스템에서 우리가 발견 특정 autophagy 관련 된 단백질-단백질 상호 작용은 Neuro2A에서 테스트 되었습니다 (N2A) 및 HEK293T 세포 라인. 이 시각된 실험 종이에 사용 되는 기술 절차의 세부 사항 설명 합니다.
서론
Macroautophagy (autophagy, 여기) 대량 세포질, 단백질과 autophagic vesicles 라는 이중 막 소포에서 세포의 격리에 의해 특징입니다 세포 스트레스 메커니즘입니다. 이중 막의 외부 층의 융합을 통해 autophagic 소포 및 그들의 화물 리소좀에 배달 되 고 거기에1저하. Autophagy 모든 세포 유형 및 단백질 저하 등 (예, 미토 콘 드리 아) 세포 기관이 회전율 homeostatic 기능을 수행 하는 모든 유기 체에 낮은 기저 수준에서 발생 합니다. 기아, 같은 세포질 긴장에 지도 하는 조건 하에서 autophagy 빠르게 upregulated 이며 기본 대사1,2,3에너지 레벨을 유지 하기 위해 셀 수 있습니다.
누 룩에서 복제 되어 약 30 autophagy 유전자와 단백질 제품 autophagic 과정, 소포 nucleation, 확장, 늦은 endosome/리소좀, 및 화물 저하 기 퓨전 등의 다양 한 단계에서 역할을 표시 했다 4
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프로토콜
1. 면역 형광
DMEM 높은 포도 당 매체,- 유지 HEK293T 인간 미 발달 신장 세포 및 N2A 마우스 neuroblast 셀 DMEM 낮은 포도 당 중간, 5% CO 2-37 ° c.에 습도 인큐베이터 10% 태아 소 열 비활성화 (FBS) 혈 청, 문화 미디어 보충 (50 U/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스), 항생제 및 L-글루타민 (2mm).
- 는 0.25 %trypsin 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 먼저 세포 배양의 미디어 제거 다음 셀 10 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 되는 염 (PBS)을 세척 하 고, 트립 신 2 mL DMEM 매체를 추가 하 여 5 분 비활성화 트립 신에 대 한 37 ° C에서의 1 mL와 함께 품 어.
- Pipetting에 의해 잘 접시를 세척. 셀 솔루션의 10 µ L을 제거 하 고 10 µ L trypan 파랑의 혼합. hemocytometer를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하. 그러나
- 모두 HEK293T와 N2A 부착 세포,, HEK293T 셀 쉽게 접시에서 분리. 따라서, 작동 HEK293T 셀 라인, 코트와 살 균 coverslides 필터링 0.01% 폴 리-L-리 신 셀을 뿌리기 전에.
- 10 cm ....
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결과
그림 1 공동 지역화의 예제에서에서이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과 표시 됩니다. 우리의 최근 종이에서 그림8을표시 됩니다. 여기, 내 생 RACK1 단백질은 녹색, 스테인드 생 LC3 빨간색으로 얼룩진 했다 하는 동안. 병합 된 사진에서 관찰 되는 노란색 점 녹색과 적색 신호 사이 오버랩의 사이트를 나타냅니다. 따라서 노란색 점 들이 두 가지 단백질의 부분 공동 지역화를 나타냅니다.
그림 1 : 대표적인 면역 형광 검사 결과. HEK293T 셀 coverslides에 교양 있었다. 세포 치.......
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토론
Immunoprecipitation 및 면역 형광 기법 단백질 단백질 상호 작용의 연구에 대 한 중요 한 있습니다. 이러한 두 가지 기술을 일반적으로 사용 되 고 잘 설립, 비록 몇 가지 기준은 이러한 기법을 사용 하는 동안 실험의 품질을 정의 하 고려 되어야 한다.
이 테스트에서 사용 되는 첫 번째, 1 차 항 체는 관심사의 단백질에 특정 해야 합니다. 을 보장 하기 위해이 테스트에 항 체의 특이성을 shRNA knockdowns 또는 녹아웃 셀을 사용 합니다. 또한, 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 또는 관심사의 단백질의 알려진된 유도 된 세포 치료. 항 체의 일괄 처리를 일괄 처리도 존재 합니다. 또한, 일부 polyclonal 항 체 또는 세라 높은 배경 및 일반적인 밴드 할 수도 있습니다. 이러한 밴드 중 일부는 관심사의 단백질의 다른 형태의 수 있습니다, 하지만 그들은 polyclonal 항 체 관련 된 단백질의 분에서 발생 하는 일반적 또는 그들은 일반적인 인터 있을 .......
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
이 작품은 과학 및 터키 과학 기술 연구 위원회 (TUBITAK) 1001 그랜트 107T153, Sabanci 대학교에 의해 지원 되었다. 세 브와 NMK 박사 연구 TUBITAK BIDEB 2211 장학금에 의해 지원 됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Trypsin EDTA 솔루션 A | 생물학 산업 | BI03-050-1A | |
| PBS | GE 헬스케어 | SH-30256.01 | |
| DMEM (고포도당) | 시그마 | 5671 | |
| DMEM (저혈당) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| 혈구계 | Sigma | Z359629-1EA | |
| 커버슬라이드 | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| 슬라이드 | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | 시그마 | VWRSAD2650 | |
| EBSS | 생물학 산업 | BI02-010-1A | |
| 파라포름알데히드 (PFA) | 시그마 | 15812-7 | |
| BSA | 시그마 | A4503 | |
| 사포닌 | 시그마 | 84510 | |
| LC3 항체 | 시그마 | L7543 | |
| 안티-래빗 IgG 알렉사 플루어 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 항체 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| 안티-마우스 IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| 염화나트륨 | Applichem | A9242.5000 | |
| 소듐 데옥시콜레이트 | 시그마 | 30970 | |
| 소듐 도데실 설페이트 (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| 트리즈마 베이스 | 시그마 | T1503 | |
| 트리톤-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 항체 | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| 브로모페놀 블루 | Applichem | A3640.0005 | |
| 비지방 우유 | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| 항토끼 IgG, HRP 결합 | Jackson Immuno. | ||
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| 과산화수소 | Merck | K35522500604 | |
| 안티 마우스 IgG, HRP 활용 | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin 항체 | Sigma | A5441 | |
| 일반 토끼 혈청 | 산타 크루즈 생명 공학 | sc-2027 | |
| 라파 마이신 | 시그마 | R0395 | |
| 단백질 A-아가로스 비즈 | 산타크루즈 바이오테크 | 러지 sc-2001 | |
| 태아 소 혈청 | Biowest | S1810-500 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 솔루션 | 생물학 산업 | 03-031-1B | |
| L-글루타민 | 생물학 산업 | BI03-020-1B | |
| 브래드포드 솔루션 | 시그마 | 6916 | |
| 니토셀룰로오스 멤브레인 | GE 헬스케어 | A10083108 | |
| X선 필름 | 후지필름 | 47410 19289 | |
| 프로테아제 억제제 | 시그마 | P8340 |
참고문헌
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D.
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