여기는 두 항 체 기반 단백질-단백질 상호 작용 연구 기법 제시: 면역 형광 및 immunoprecipitation. 이 기술은 물리적 상호작용 단백질 세포질 신호 통로의 소설 구성 요소의 발견 및 이해 단백질 역학 공부 위해 적당 하다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 단백질 상호 작용 이해 셀룰러 신호 폭포 및 식별 소설 통로 구성 요소 단백질 역학 중요 하다. 세포 활동의 대부분 필요 단백질 사이 육체적 인 상호 작용. 분석 하 고 이러한 상호 작용 지도, 다양 한 실험적인 기술 뿐만 아니라 생물 정보학 도구 개발 되었다. Autophagy는 영양 부족, 화학 물질 및 산소를 포함 하 여 다른 스트레스에 대처 하기 위해 셀 수 있도록 메커니즘을 재활용 휴대. Autophagy 관련 신호 이벤트를 더 잘 이해 하 고 단백질 복합물에서 autophagy 조절 하는 새로운 요소를 발견, 우리는 단백질 단백질 상호 작용 화면을 수행. 이러한 심사 결과의 유효성 검사에는 면역 형광 및 immunoprecipitation 기술을 사용을 해야합니다. 이 시스템에서 우리가 발견 특정 autophagy 관련 된 단백질-단백질 상호 작용은 Neuro2A에서 테스트 되었습니다 (N2A) 및 HEK293T 세포 라인. 이 시각된 실험 종이에 사용 되는 기술 절차의 세부 사항 설명 합니다.
서론
Macroautophagy (autophagy, 여기) 대량 세포질, 단백질과 autophagic vesicles 라는 이중 막 소포에서 세포의 격리에 의해 특징입니다 세포 스트레스 메커니즘입니다. 이중 막의 외부 층의 융합을 통해 autophagic 소포 및 그들의 화물 리소좀에 배달 되 고 거기에1저하. Autophagy 모든 세포 유형 및 단백질 저하 등 (예, 미토 콘 드리 아) 세포 기관이 회전율 homeostatic 기능을 수행 하는 모든 유기 체에 낮은 기저 수준에서 발생 합니다. 기아, 같은 세포질 긴장에 지도 하는 조건 하에서 autophagy 빠르게 upregulated 이며 기본 대사1,2,3에너지 레벨을 유지 하기 위해 셀 수 있습니다.
누 룩에서 복제 되어 약 30 autophagy 유전자와 단백질 제품 autophagic 과정, 소포 nucleation, 확장, 늦은 endosome/리소좀, 및 화물 저하 기 퓨전 등의 다양 한 단계에서 역할을 표시 했다 4 , 5.이 유전자의 대다수의 Orthologs 확인 되었습니다 및 그들의 세포질 기능6의 보존을 확인 하는 다양 한 유기 체에 연구. 지난 10 년간에서 연구 보여주었다 여러 autophagy 관련 단백질 복합물 및 단백질-단백질 상호 작용 및 그들은 복잡 하 고 제어 방식 autophagy 통로 지배. 교차로, 백업, 피드백, 피드 포워드 메커니즘 존재, 그리고 다른 관련된 이벤트 (예: 기공을 분 비, 리소좀 속, endosomal 정렬 및 전송7, 등)와 autophagy 조정 셀 수 미끼로 autophagy 단백질 ATG5를 사용 하 여 편견된 효 모 2 잡종 스크린에서 (ATG5는 기아에서 LC3 lipidation 중재 e 2와 같은 conjugating 시스템에 관련 된 주요 autophagy 단백질 유도 autophagy), 수용 체 활성화 확인 했습니다 C-키 1 (RACK1; GNB2L1) 강한 interactor 및 소설 autophagy 구성 요소8. 중요 한 것은, 화면이 보였다 ATG5 RACK1 상호 작용 autophagy 클래식 inducers (즉, 기아와 mTOR 억제)에 의해 autophagy 유도 불가결 이었다.
면역 형광 검사 기반 방법 일반적으로 단백질 단백질 상호 작용을 모니터링 하는 데 사용 됩니다. 이 기술은 주로 항 체 기반 하 고 상호 작용을 시각화 하 고 세포질 지 방화를 확인 하는 데 도움이. 이 기술에서는, 형광 태그 활용 된 항 체 관련 된 관심사의 단백질은 일반적으로 특정 얼룩에 사용 됩니다. 각 단백질 다른 형광 성 염료를 결합 하는 항 체와 함께 표시 될 수 있습니다. 단백질-특정 항 체를 사용 하 여 이미지 병합 되 면 신호에 겹치는 confocal 현미경 검사 법에서 단백질의 공동 지역화를 나타냅니다. 기술은 셀 이나 심지어 조직에 적용 됩니다. 면역 형광 검사 기술을 상호 역학에 대 한 단서를 제공 하 고 크기와 다른 조건9에서 세포 형태학에 있는 일반적인 변화를 추적 하는 동안 단백질 복합물의 분포를 식별 하는 데 도움이. Immunoprecipitation는 다른 일반적으로 사용 되 항 체 기반 기술 상호 작용의 분석에 대 한 수 사이 주어진 단백질10. 이 기술을 사용 하 여, 관심사의 단백질 격리 된 셀에서 또는 조직 추출 단백질 복잡 한 또는 관심사의 단백질 접촉의 강 수의 결과로 특정 항 체를 사용 하 여. 공동-immunoprecipitation, 단백질 및 그것의 공동 interactor는 검색 뿐만 아니라 두 개의 단백질 사이 상호 작용을 보여 하지만 다른 상황11에서 상호 작용의 그것의 힘을 측정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 확인 하 고 특성을 ATG5-RACK1 및 RACK1 LC3 상호 작용 하는 데 사용 된 세부 핵심 기술에 설명 합니다. 초점은 중요 한 단계 및 함정 autophagy 연구로 해결의 강조와 함께 면역 형광 및 immunoprecipitation 기술에 있습니다.
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프로토콜
1. 면역 형광
DMEM 높은 포도 당 매체,- 유지 HEK293T 인간 미 발달 신장 세포 및 N2A 마우스 neuroblast 셀 DMEM 낮은 포도 당 중간, 5% CO 2-37 ° c.에 습도 인큐베이터 10% 태아 소 열 비활성화 (FBS) 혈 청, 문화 미디어 보충 (50 U/mL 페니실린, 50 µ g/mL 스), 항생제 및 L-글루타민 (2mm).
- 는 0.25 %trypsin 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 먼저 세포 배양의 미디어 제거 다음 셀 10 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 되는 염 (PBS)을 세척 하 고, 트립 신 2 mL DMEM 매체를 추가 하 여 5 분 비활성화 트립 신에 대 한 37 ° C에서의 1 mL와 함께 품 어.
- Pipetting에 의해 잘 접시를 세척. 셀 솔루션의 10 µ L을 제거 하 고 10 µ L trypan 파랑의 혼합. hemocytometer를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하. 그러나
- 모두 HEK293T와 N2A 부착 세포,, HEK293T 셀 쉽게 접시에서 분리. 따라서, 작동 HEK293T 셀 라인, 코트와 살 균 coverslides 필터링 0.01% 폴 리-L-리 신 셀을 뿌리기 전에.
- 10 cm 배양 접시에에서 장소 살 균 coverslides
- . 각 coverslide에 폴 리-L-리 신 솔루션의 적절 한 금액을 추가 합니다. 10 분에 대 한 폴 리-L-리 신 솔루션 coverslides를 품 어
- 폴 리-L-리 신 솔루션 제거.
참고: 폴 리-L-리 신은 재사용 가능한; 그것은 수집 하 여 추가 실험을 위해 재사용 옵션입니다. 폴 리-L-리 신 독성 때문에, 모두는 coverslides에 솔루션의 완전히 증발 될 때까지 기다립니다 그리고 폴 리-L-리 신 다음 복구. - 세척 살 균 PBS 가진 coverslides.
- 폴 리-L-리 신 솔루션 제거.
- 1 mL DMEM 12-잘 접시의 각 음에 추가. 각 잘에서 한 coverslide 장소.
- 씨앗 20000 셀/글쎄, 드롭 들러는 coverslides 셀의 균일 분포에 대 한 동시에 접시를 떨고 있는 동안. 셀에에서 계속 CO 2 인큐베이터 37 ° C에서 고 약을 추가 총 보육 시간 48 h를 초과 하지 않는, 즉, 3 h Torin 치료에 대 한 추가 약 45 h 게시물 시드에.
- RACK1-LC3
- 상호 작용 연구, Torin 1, rapamycin, 그리고 기아 autophagy inducers로 사용 되었다. 셀은 알을 품 Torin 1 3 h (250 nM 최종 농도 겠어요); rapamycin 16 h (200 nM 최종 농도 겠어요);에 대 한와 함께 그리고 얼 ' s 균형 소금 솔루션 (EBSS) 세포를 굶 어 하려면 2 h.
참고: 10 %FBS 제어 조건으로 사용 된 DMEM 부 화.
- 상호 작용 연구, Torin 1, rapamycin, 그리고 기아 autophagy inducers로 사용 되었다. 셀은 알을 품 Torin 1 3 h (250 nM 최종 농도 겠어요); rapamycin 16 h (200 nM 최종 농도 겠어요);에 대 한와 함께 그리고 얼 ' s 균형 소금 솔루션 (EBSS) 세포를 굶 어 하려면 2 h.
- 총 보육 시간의 48 h 후에 coverslides 미디어를 제거 하 고 1 mL PBS와 함께 그들을 씻어.
- 셀을 해결 하기 위해 품 어 1 mL 얼음 차가운 살 균 필터링 된 4 %paraformaldehyde (PFA) 어떤 동요 없이 실 온에서 20 분의 1 x PBS (pH 7.4)에 있는 셀.
PFA 빛에 민감한 때문에, 계속 (중요 한) 접시 어둠 속에서 부 화 기간; 알루미늄 호 일 접시를 덮고 도울 수 있습니다. 또한, PFA 독성, 따라서, 증기 두건에서 셀을 수정 하는 동안 작업.
참고: 고정 단계 면역 형광 실험에서 유의 최적화 해야 합니다, 특정 항 체는 최고의 조건과 다른 고정 에이전트를 사용 하 여 작업 수 있습니다. - PFA 부 화 후 20 분 먼저는 coverslides에 PFA 솔루션을 제거 하 고 각 샘플 3 번 1 mL 균 필터링 된 PBS로 세척. At이이 단계, (중요 한) 세척을 말리 우물 하나. 이후 후속 반응 셀의 방해 하 고 세포 형태를 변경, 일반적인 신호를 증가 것입니다 그것을 건조 하지 마십시오.
- 세척이 완료 되 면 계속 1 ml PBS 얼음에 샘플
- 차단 솔루션 준비: 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 0.1% 사포닌과 PBS.
- 는 파라핀 영화 6 잘 플레이트 커버. 플레이트 하단 파라핀 영화 취재 후 부드러운 인지 확인 합니다. 6 잘 플레이트 라벨.
- 핀셋을 사용 하 여, 전송은 coverslides 12-잘 접시 6 잘 플레이트에 파라핀 필름으로 커버.
- 는 Coverslides에 PBS를 삭제 하 고 차단 하는 permeabilization에 대 한 각 coverslide에 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 30 분에 대 한 얼음에 샘플을 품 어
- 는 솔루션을 차단에 1 차적인 항 체를 준비 합니다. 실험을 하기 전에 얼룩에 대 한 최상의 작업 농도 정의 하기 위해 항 체 희석 최적화.
참고: 예를 들어 LC3 항 체 솔루션을 차단에 1: 100 희석에 사용 됩니다. - 30 분 부 화 후 차단 솔루션을 삭제 하 고 부드럽게 1 mL의 PBS로 샘플을 한 번 씻어.
- 추가 100 µ L 각 coverslide에 대 한 1 차적인 항 체 해결책의. 대 한 통에 1 시간 실 온에서 샘플을 품 어.
참고: 1 차적인 항 체 외피 시간 최적화 되어야 합니다. 항 체에 따라 4 ° C에서 하룻밤 인큐베이션 바람직 있을 수 있습니다. 통에 품 어 부드럽게 하는 것이 좋습니다 (100 회전/분)는 coverslides에 항 체를 똑같이 배포. - 1 차적인 항 체를 가진 외피 후 샘플 개별적으로, 3 회로 씻어 1 mL PBS.
- 준비 1: 500 이차 항 체 (이차 항 체의 희석의 최적화 필요할 수 있습니다) 솔루션을 차단에. 여기, 안티-토끼 IgG 알 렉 사 Fluor 568 보조 안티 토끼 항 체로 사용 되었다.
- 샘플 통에 실 온에서 1 h를 위한 이차 항 체 해결책의 100 µ L 품 어. 이후 fluorophore 표시 된 이차 항 체는 빛에 민감한, (중요 한) 어둠 속에서 솔루션을 계속. 이차 항 체 외피 전후 동안 어둠 속에서 샘플을 배치.
- 이차 항 체 부 화 후 3 회 PBS 가진 접시 세척.
참고: 사용 경험에 따라, 일부 항 체는 PBS에 의해 제거 될 수 없는 높은 배경 신호 세척. 같은 항 체, 단계 1.21, 후 처리 하는 경우 6 h 4 ° C에서 PBS에 샘플을 유지 도울 수 있습니다.- 필요한 경우 얼룩 Hoechst, 핵 표시 같은 DNA 바인딩 염료와 셀.
- 더 이상의 단백질 얼룩, 적용 단계 1.16 두 번째 단백질에서에서 시작 하는 동일한 절차.
- 확인
- 하나 이상의 항 체 (예, 사용 마우스와 토끼 항 체)로 얼룩을 수행할 때 항 체 사이 아무 종 반응이 다는 것.
참고: 여기에서, RACK1은 스테인드 두 번째 단백질으로 안티-RACK1 주 항 체와 반대로 마우스 IgG 알 렉 사 Fluor 488 이차 항 체 위에서 언급 한 같은 농도 사용 하 여 사용 하 여.
- 하나 이상의 항 체 (예, 사용 마우스와 토끼 항 체)로 얼룩을 수행할 때 항 체 사이 아무 종 반응이 다는 것.
- 장착 솔루션 준비: 50% 글리세롤 1 x PBS에. 22 µ m 필터를 통해 필터.
- 에탄올 보풀 지우기를 사용 하 여 슬라이드를 닦 고 10 µ L 장착 솔루션 각 슬라이드에 추가. 트위터를 사용 하 여 셀으로 측면 장착 매체와 직접 접촉에 있는 각 dropso에는 coverslides를 놓습니다. 부드럽게 보풀 물티슈를 사용 하 여 초과 장착 솔루션 삭제.
- 인감 투명 매니큐어와 coverslides. 먼저,는 coverslides 4 가장자리에 매니큐어의 방울을 추가 하 여 안정과 다음 완전히 그들을 봉인.
- 형광 신호 수 있습니다 몇 시간 후 표 백제 이후 가능한 한 빨리 형광 또는 confocal 현미경 샘플을 분석.
- 분리 및 수로 셀 1.2와 1.3 단계에서 설명한.
- 는 HEK293T 셀을 사용 하는 경우 15 cm 배양 접시에서 각 조건에 대 한 4 백만 셀 씨. N2A 세포를 사용 하는 경우 15 cm 배양 접시에 5 백만 셀 씨. 37 ° C에서 CO 2 배양 기에서 세포 실험의 끝까지 품 어.
- 치료 관련 약물 또는 정의 된 기간에 대 한 조건 셀을 셀의 총 보육 시간 48 h.를 초과 하지 않는
참고:이 연구에서 immunoprecipitation 테스트에 대 한 세포 치료 Torin 1 3 h (250 nM), rapamycin 16 h (200 nM), 및 EBSS 가진 2 h. 10 %FBS 컨트롤로 셀에 추가 된 DMEM. - 후 48 h 총 보육 시간, 미디어를 제거 하 고 세포를 수확. HEK293T 셀 접시에서 쉽게 분리, 이후 얼음 접시 세척 차가운 PBS 수 있습니다 수확에 적합. 그러나, N2A 셀은 더 강한 분리; 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 수확 하는 데 도움이.
- Microcentrifuge 튜브에 있는 모든 셀을 수집.
- 4 ° C. 삭제는 상쾌한 세척 다시 pipetting으로 일시 중단 하 여 1 mL PBS 가진 펠 릿에서 15 분 동안 16000 x g에서 원심 분리기 샘플.
- 원심 분리기 단계를 반복 하지만 15 분에 4 ° C에서 높은 원심 분리기 속도에 상쾌한 삭제.
- 실험을 시작 하기 전에 준비 라디오 면역-강 수 분석 결과 (RIPA) 버퍼.
참고: RIPA 버퍼;의 3 종류가 있습니다. (아래 수식 참조) 하는 것을 조사 되 고 단백질의 상호 작용 강도 따라 선택 합니다.- 강한 단백질-단백질 상호 작용은, 정규 RIPA 버퍼를 선택 하십시오.
- 상호 작용은 약한 경우 가벼운 RIPA 또는 온화한 RIPA 선택.
참고: 이러한 버퍼 조리법 다음 단계에 있습니다. Immunoprecipitation 테스트에 사용 되는 모든 버퍼 protease 억제제와 함께 보충 해야 합니다.- 50 mM Tris pH 8에에서 1 %NP-40, 150 mM NaCl, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 및 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염을 사용 하 여 일반 RIPA 버퍼 준비.
- 50 mM Tris pH 7.5에에서 1 %NP-40, 150 mM NaCl, 및 0.25% 나트륨 deoxycholate를 사용 하 여 가벼운 RIPA 버퍼 준비.
- 50 mM Tris pH 7.4에에서 1% 트리톤 X 100, 137 mM NaCl, 1% 글리세롤과 1mm 나트륨 orthovanadate를 사용 하 여 온화한 RIPA 버퍼 준비.
- 적절 한 RIPA 버퍼를 선택한 후 보충 protease 억제제 (RIPA +)와 버퍼. 다음, RIPA + 셀 펠 릿의 볼륨 x 3 세포를 lyse.
- 소용돌이 15에 대 한 서 스 펜 션 5 분 소용돌이 장식 5 번 반복 하 고 다음 15 분 동안 16000 x g에서 샘플 4 원심 s. 얼음에 그것을 계속 ° c.
- 깨끗 한 microcentrifuge 튜브와 나머지 세포 파편을 제거 하는 원심 분리기에는 상쾌한 전송. 깨끗 한 튜브에 상쾌한 전송.
- 단백질 lysates 1시 50분을 희석 하 고 빈와 표준 96 잘 접시를 준비 합니다. 샘플 희석.
20:
- 브래드와 혼합 샘플 솔루션 1. 어둠 속에서 15 분 동안 품 어.
- 595 nm 파장에서 광학 밀도 측정합니다. 각 샘플에 대 한 흡 광도 값을 사용 하 여 단백질 농도 계산.
- 셀, 수확 전에 하루는 관심사의 단백질에 항 체와 단백질 A 플러스 구슬 커플.
- 커트가 위를 사용 하 여 200 µ L 팁의 가장자리 및 비드 슬러리에서 25 µ L를 사용 하 여 각 조건에 대 한.
- 1 mL PBS와 함께 한 번, 한 번 1 mL RIPA 버퍼와 함께 한 번 1 mL RIPA + 구슬 세척. 3300 x g, 1 분에 4 ° C에 세척 단계 수행
- 마지막 세척 후 구슬에 RIPA + 300 µ L을 추가 하 고 1.5 µ g 항 체에 내려 오게 될 단백질에 관련 된 추가.
- 품 어 회전 (20 회전/분)에 4 ° C에서 하룻밤 튜브.
참고: 여기에서, ATG5는 특정 안티-ATG5 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitated.
- 항 체와 구슬의 하룻밤 배양 후 씻어 PBS와 한 번, 한 번 RIPA와 함께 한 번 RIPA + 구슬 2.12.2 단계에서 설명한 대로.
- 추가 2 mg 단백질 각 구슬에 lysate의 조건 하 고 총 볼륨 RIPA + 버퍼/튜브와 300 µ L. 4에는 회전자에 하룻밤 튜브를 품 어 ° c.
- 는 부 화 후 앞에서 설명한 구슬 (단계 2.12.2) 세척.
- 마지막 세척 후 사용 하 여 작은 피펫으로 팁 구슬 건드리지 않고 모든 상쾌한 제거.
- 염료 로드 x 3의 추가 10 µ L: 6 %SDS, 30% 글리세롤, 16% β-Mercaptoethanol, 및 1 M Tris HCl pH 6.8에서에서 0.1 %Bromophenol 블루.
- 각 조건에 대해 적어도 100 µ g 단백질 lysate를 사용 하 여 입력된 컨트롤을 준비. 물을 사용 하 여 샘플 볼륨을 균일화 하 고 염료를 로드 x 3의 적절 한 볼륨 추가.
- 10 분 동안 95 ° C에서 종 샘플
참고: 일반적으로 샘플을 끓는 때 튜브의 캡 수 저절로 열고 샘플 손실 됩니다. 특정 모자 차단제와 모자를 눌러이 문제를 방지. - 스핀 샘플 및 표준 프로토콜을 사용 하 여 그들의 크기에 따라 단백질을 SDS 페이지 젤에 부하.
참고:이 연구에서 RACK1 및 ATG5에, 샘플 12 %polyacrylamide 젤 80 V 30 분 그리고 약 90 분 동안 120 V에서 통해 실행 했다. 그러나, LC3 같은 작은 단백질에 대 한 15 %polyacrylamide 젤을 사용 하 여 더 적당 하다. - 젤 실행 완료 한 후 니트로 또는 PVDF 막 중 습식 또는 세미 드라이 전송 방법을 사용 하 여 단백질을 전송 합니다. 그런 다음 0.05%와 PBS에서 5% 비-지방 우유에 외피에 의해 세포 막 차단 트윈 20 (PBST) 1 h. 세척 세포 막에 대 한 실 온에서 3 시간 5 분에 대 한 PBST와
- 실 온에서 1 h에 대 한 작동 농도에서 1 차 항 체를 막 품 어. 1 차적인 항 체 희석에 대 한 사용 빨간 솔루션을 포함 하는 BSA (5% BSA Cohn V 분수, PBST, pH 7.5;에 0.02% 나트륨 아 지 드 페 놀 레드 산도 표식으로 추가 추가) 항 체의 재사용을 허용 하도록.
참고: 예를 들어 빨간색 솔루션에서 ATG5 항 체 2000 x 희석.- 보육 시간의 끝에, PBST와 3 번 막 세척.
- HRP 활용 된 이차 항 체 5% 비-지방 우유 솔루션에서 준비 했다와 막 품 어 (여기, 안티-토끼 IgG 1:10.000에서 사용 되었다). 다음 씻어 막 3 5 분에 대 한 PBST x
- 만들 ECL 솔루션: 25mm luminol, 9 mM coumaric 산, 70 mM Tris HCl pH 8.8에에서 3 x 10 -4% H 2 O 2. 각 실험에 대 한 신선한 H 2 O 2를 사용 하 여.
참고: 반응 시작 후 H 2 < /sub > O 2 추가 하 고 그것은 약 20 분 동안 계속.- 멤브레인을 품 어 고 ECL에 20 분에 대 한 영화를 x-선. 개발 하 고 어두운 방에 수정.
- 닫기 또는 중복 분자 무게 단백질의 co immunoprecipitation를 확인, 그것은 막 벗기는 버퍼에서 30 분 동안 60 ° C에서 배양 하 여 세포 막에서 항 체를 제거 해야 할 수 있습니다: (25mm Tris HCl pH 2와 1 %SDS).
- 반복 단계 2.20 2.23 공동-immunoprecipitation 다른 항 체를 사용 하 여 확인. 예를 들어 다음 ATG5 검출과 세포 막의 스트립, RACK1 단백질 안티-RACK1 1 차 항 체 (1:1, 000) 및 2 차 항 체 (1:10, 000)을 사용 하 여 동일한 막에 시험 되었다. Β-말라 로드 제어;로 사용 IgG 신호 immunoprecipitated 샘플 로드 제어로 사용 되었다.
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결과
그림 1 공동 지역화의 예제에서에서이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과 표시 됩니다. 우리의 최근 종이에서 그림8을표시 됩니다. 여기, 내 생 RACK1 단백질은 녹색, 스테인드 생 LC3 빨간색으로 얼룩진 했다 하는 동안. 병합 된 사진에서 관찰 되는 노란색 점 녹색과 적색 신호 사이 오버랩의 사이트를 나타냅니다. 따라서 노란색 점 들이 두 가지 단백질의 부분 공동 지역화를 나타냅니다.
그림 1 : 대표적인 면역 형광 검사 결과. HEK293T 셀 coverslides에 교양 있었다. 세포 치...
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토론
Immunoprecipitation 및 면역 형광 기법 단백질 단백질 상호 작용의 연구에 대 한 중요 한 있습니다. 이러한 두 가지 기술을 일반적으로 사용 되 고 잘 설립, 비록 몇 가지 기준은 이러한 기법을 사용 하는 동안 실험의 품질을 정의 하 고려 되어야 한다.
이 테스트에서 사용 되는 첫 번째, 1 차 항 체는 관심사의 단백질에 특정 해야 합니다. 을 보장 하기 위해이 테스트에 항 체의 특이성을 shRNA knockdowns 또는 녹아웃 셀을 사용 합니다. 또한, 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 또는 관심사의 단백질의 알려진된 유도 된 세포 치료. 항 체의 일괄 처리를 일괄 처리도 존재 합니다. 또한, 일부 polyclonal 항 체 또는 세라 높은 배경 및 일반적인 밴드 할 수도 있습니다. 이러한 밴드 중 일부는 관심사의 단백질의 다른 형태의 수 있습니다, 하지만 그들은 polyclonal 항 체 관련 된 단백질의 분에서 발생 하는 일반적 또는 그들은 일반적인 인터 있을 ...
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
감사의 글
이 작품은 과학 및 터키 과학 기술 연구 위원회 (TUBITAK) 1001 그랜트 107T153, Sabanci 대학교에 의해 지원 되었다. 세 브와 NMK 박사 연구 TUBITAK BIDEB 2211 장학금에 의해 지원 됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Trypsin EDTA 솔루션 A | 생물학 산업 | BI03-050-1A | |
| PBS | GE 헬스케어 | SH-30256.01 | |
| DMEM (고포도당) | 시그마 | 5671 | |
| DMEM (저혈당) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| 혈구계 | Sigma | Z359629-1EA | |
| 커버슬라이드 | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| 슬라이드 | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | 시그마 | VWRSAD2650 | |
| EBSS | 생물학 산업 | BI02-010-1A | |
| 파라포름알데히드 (PFA) | 시그마 | 15812-7 | |
| BSA | 시그마 | A4503 | |
| 사포닌 | 시그마 | 84510 | |
| LC3 항체 | 시그마 | L7543 | |
| 안티-래빗 IgG 알렉사 플루어 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 항체 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| 안티-마우스 IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| 염화나트륨 | Applichem | A9242.5000 | |
| 소듐 데옥시콜레이트 | 시그마 | 30970 | |
| 소듐 도데실 설페이트 (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| 트리즈마 베이스 | 시그마 | T1503 | |
| 트리톤-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 항체 | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| 브로모페놀 블루 | Applichem | A3640.0005 | |
| 비지방 우유 | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| 항토끼 IgG, HRP 결합 | Jackson Immuno. | ||
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| 과산화수소 | Merck | K35522500604 | |
| 안티 마우스 IgG, HRP 활용 | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin 항체 | Sigma | A5441 | |
| 일반 토끼 혈청 | 산타 크루즈 생명 공학 | sc-2027 | |
| 라파 마이신 | 시그마 | R0395 | |
| 단백질 A-아가로스 비즈 | 산타크루즈 바이오테크 | 러지 sc-2001 | |
| 태아 소 혈청 | Biowest | S1810-500 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 솔루션 | 생물학 산업 | 03-031-1B | |
| L-글루타민 | 생물학 산업 | BI03-020-1B | |
| 브래드포드 솔루션 | 시그마 | 6916 | |
| 니토셀룰로오스 멤브레인 | GE 헬스케어 | A10083108 | |
| X선 필름 | 후지필름 | 47410 19289 | |
| 프로테아제 억제제 | 시그마 | P8340 |
참고문헌
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556(2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
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