Method Article

라만 이미징과 다변량 분석을 결합하여 식물 세포벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 시각화합니다.

DOI:

10.3791/55910

⸱

June 10th, 2017

 ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry, Beijing Forestry University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 라만 이미징 및 다 변수 분석을 사용하여 식물 세포 벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로오스를 시각화하는 일반적인 방법을 제시합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식물체 바이오 매스에 라만 이미징을 적용하는 것은 수용액에 대한 공간적 및 조성 정보를 제공 할 수 있기 때문에 증가하고 있습니다. 분석은 일반적으로 광범위한 샘플 준비가 필요하지 않습니다. 라벨을 붙이지 않고도 구조적 및 화학적 정보를 얻을 수 있습니다. 그러나 각 라만 이미지에는 수천 개의 스펙트럼이 포함되어 있습니다. 이것은 숨겨진 정보를 추출 할 때 어려움을 낳습니다. 특히 비슷한 화학 구조를 가진 구성 요소의 경우. 이 연구는이 문제를 해결하기 위해 다변량 분석을 도입합니다. 이 프로토콜은 식물 세포벽 내에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 비롯한 주성분을 시각화하는 일반적인 방법을 수립합니다. 이 프로토콜에서는 시료 준비, 스펙트럼 획득 및 데이터 처리 절차가 설명됩니다. 이는 시료 준비 및 데이터 분석시 운영자의 기술에 크게 의존합니다. 이 접근법을 사용함으로써 비전문 사용자가 라만 조사를 수행하여 high 품질 데이터 및 식물 세포벽 분석에 대한 의미있는 결과.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식물 바이오매스는 지구상에서 가장 풍부한 재생 가능한 자원이며; 주로 리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스로 구성되며; 바이오 에너지와 바이오 기반 화학물질의 매력적인 공급원으로 여겨지고 있습니다.1. 불행히도, 그것은 분해에 저항하고 식물 세포벽에 가수분해 안정성 또는 구조적 견고성을 부여할 수 있습니다. 이러한 저항성은 접근 가능한 표면적, 바이오매스 입자 크기, 중합 정도, 셀룰로오스 결정도 및 보호 리그닌2에 기인합니다. 따라서 식물 세포벽의 구조적, 화학적 특성에 대한 포괄적인 이해는 식물 생물학 및 화학의 관점뿐만 아니라 상업적 활용의 관점에서도 중요합니다. 크로마토그래피, 질량 분석법 및 핵 자기 공명 분광법과 같이 일반적으로 사용되는 습식 화학 분석은 측정된 샘플의 평균 조성 데이터만 제공합니다. 또한 이러한 방법은 침습적이며 식물 조직의 원래 구조를 파괴합니다3.

라만 이미징 기술은 공간적으로 분해된 화학 정보를 비파괴적으로 시각화하기 위한 강력한 도구입니다4. 레이저 광을 사용하여 광자와 함께 비탄성 산란을 일으키고 분자 진동에서 발생하는 편광의 변화에 의존합니다. 이 경우 물은 약한 라만 산란을 일으키므로 이 접근 방식은 생물학적 샘플의 현장 조사에 적합합니다5. 식물 세포벽에 라만 이미징 기술을 적용하면 단일 세포와 세포벽 층의 규모에 대한 해상도로 원래 상태의 식물 세포벽의 구조와 구성을 설명할 수 있습니다6. 식물 세포벽의 일반적인 라만 이미징 분석은 일반적으로 1) 시료 준비, 2) 스펙트럼 획득 및 3) 데이터 처리의 세 단계로 구성됩니다.

라만 이미징의 주요 장점 중 하나는 최소한의 시료 준비로 무표지 및 비파괴 스펙트럼을 얻을 수 있다는 점이지만, 관심 표면을 노출시키기 위해서는 여전히 물리적 시료 절편화가 필요합니다. 이 기술은 광학 focus7 유지에 의존하기 때문에 이 프로세스는 평평한 표면을 얻기 위해 신중하게 수행해야 합니다. 스펙트럼 획득에는 이미지 품질과 광범위한 획득 시간 간의 균형이 필요합니다8. 데이터 처리는 특히 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스와 같은 유사한 화학 구조를 가진 구성 요소에 대한 이미지 데이터에서 화학 정보를 효과적으로 추출하는 것을 목표로 합니다. 강한 스펙트럼 중복으로 인해 정확한 스펙트럼을 식별하기가 어렵습니다. 이 경우 다변량 분석은 숨겨진 구조 및 화학 정보를 효과적으로 발견할 수 있는 간단한 접근 방식입니다9. 이 연구는 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스를 포함한 식물 세포벽의 주요 구성 요소를 시각화하기 위해 라만 이미징을 사용하는 방법을 설명하는 일반적인 프로토콜을 제시합니다.

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Protocol

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1. 샘플 준비

  1. 식물 샘플 ( 예 : 포플러 줄기)에서 작은 조직 블록 (약 3mm x 3mm x 5mm)을 자릅니다.
  2. 조직을 끓는 탈 이온수에 30 분간 담근다. 즉시 실온 (RT)에서 30 분 동안 탈 이온수로 옮긴다. 티슈가 용기 바닥에 가라 앉을 때까지이 단계를 반복하여 조직의 공기가 제거되었고 조직이 부드럽게되었다는 것을 나타냅니다.
    참고 :이 단계 이전에 바닥에 가라 앉은 샘플의 경우 일반적으로이주기를 3-5 번 반복하십시오.
  3. 순수한 PEG뿐만 아니라 탈 이온수에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 20, 50, 70, 90 % (v / v) 분취 량을 준비하고 65 ° C에서 용액을 유지하십시오.
  4. 수분을 치환하고 PEG가 침투하도록 일련의 등급이 매겨진 PEG 조에 조직을 배양합니다.
    참고 : 일반적으로 분자량 2,000 (PEG2000) 인 PEG가 삽입에 사용됩니다.
    1. 조직을 g로 처리하십시오.(a) 1 시간 동안 20 % PEG, (b) 1.5 시간 동안 50 % PEG, (c) 2 시간 동안 70 % PEG, (d) 2 시간 동안 90 % PEG, 및 (e) 10 시간 동안 100 % PEG.
  5. 카세트를 오븐에서 65 ° C로 예열하십시오. 블록이 들어있는 PEG를 카세트에 넣은 다음 예열 된 핀셋 또는 바늘을 사용하여 조직 블록을 원하는 위치에 놓습니다.
  6. 천천히 카세트를 식히고 사용할 때까지 실온에 티슈를 보관하십시오.
  7. 날카로운 면도날을 사용하여 작은 블록 (약 1cm x 1cm x 2cm)에 표적 조직이 들어있는 PEG 블록을 해부하고 그것을 마이크로톰에 올려 놓습니다.
  8. PEG 블록 (일반적으로 3-10 μm)에서 얇은 절편을 잘라냅니다.
  9. 시계에서 10 번 탈 이온수로 섹션을 씻어 조직에서 PEG를 제거합니다.
  10. 추출물을 제거하기 위해 6 시간 동안 톨루엔 / 에탄올 (2 : 1, v / v)로 섹션을 담그십시오. 탈 이온수 65 mL, 아세트산 0.5 mL 및 나트륨 클로라이드 0.6 g을 혼합하여 반응 액을 조제한다.비커에 의식. 5 mL 바이알에 한 개의 섹션과 3 mL의 반응 액을 첨가한다. 유리 병의 상단에 나사를 조이십시오.
  11. 유리 병을 75oC에서 2 시간 가열하여 조직의 리그닌을 제거한다. 시계 유리에있는 탈 이온수로 섹션을 10 번 헹굽니다.
  12. 미처리 / 탈 리그닌 부분을 유리 현미경 슬라이드로 옮긴다. 브러시 또는 바늘을 사용하여 조심스럽게 섹션을 펼칩니다. 티슈 페이퍼로 여분의 탈 이온수를 제거하십시오.
  13. 섹션을 D 2 O에 담그십시오. 샘플을 유리 커버 슬립으로 덮으십시오. D 2 O의 증발을 막기 위해 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오.

2. 스펙트럼 획득

  1. 공 촛점 라만 현미경의 장비 운영 소프트웨어를 엽니 다. 레이저 (파장 = 532 nm)를 켜고 100 배 현미경 대물 렌즈를 사용하여 결정 실리콘 표면에 초점을 맞추고 보정 버튼을 클릭하여 장비를 보정합니다.
  2. 계기 스위치광학 현미경 모드로 설정하고 현미경 램프를 켭니다. 커버 슬립이 목표를 향하도록 스테이지에 현미경 슬라이드를 장착하십시오.
  3. 20X 현미경 대물 렌즈로 샘플을보고 관심 영역을 찾습니다. 커버 슬립에 침지 오일을 바르고 액침 현미경 대물 렌즈 (60X, 개구 수 NA = 1.35)로 전환합니다. 샘플 표면에 초점을 맞 춥니 다.
  4. 장비를 라만 테스트 모드로 전환하고 현미경 램프를 끕니다.
  5. 직사각형 도구를 사용하여 매핑 영역을 선택하십시오. 단계 크기를 변경하여 얻은 스펙트럼의 수를 결정합니다.
    주 : 스텝 크기 (일반적으로 대물 렌즈의 개구 수에 의해 계산 된 스폿 직경보다 큰, 이론적으로는 1.22λ / NA)보다 유의하십시오. 이 크기보다 작은 경우 오버 샘플링이 발생합니다.
  6. 최적의 스펙트럼 파라미터를 설정하여 적절한 획득 시간 (일반적으로 8 시간 미만)에서 최적의 신호 대 잡음비 (SNR) 및 스펙트럼 품질을 얻고,샘플 적합성에 관한 정보. 일반적으로 레이저 (532 nm), 필터 (100 %), 구멍 (300), 슬릿 (100), 분광계 (1,840 cm -1 ), 홈 (1200 t), 대물 렌즈 60X 오일) 및 수집 시간 (2 초).
  7. 데이터 처리 전에 스펙트럼 데이터를 저장하고 범용 형식 ( 예 : TXT 파일)으로 변환하십시오.

3. 데이터 분석

  1. 스펙트럼 데이터 (TXT 파일)를 데이터 분석 소프트웨어 ( 예 : Matlab)에로드하십시오. 데이터 세트에 노이즈 감소 기술을 적용하여 SNR을 향상시킵니다 ( 예 : Savitzsky-Golay 알고리즘 또는 웨이블릿 알고리즘)
  2. 미처리 샘플을 사용하여 리그닌과 다당류의 이미지를 생성하십시오. 리그닌 영상의 경우, 방향족 링 대칭 스트레칭 진동 때문에 1,600 cm -1 부근의 스펙트럼 피크를 고려하십시오. 다당류 이미징 (셀룰로오스 및 헤미 셀룰로오스 포함)의 경우 스펙트럼 피크 aCH와 CH 2 뻗기 때문에 2,889 cm -1 라운드.
  3. delignified 샘플을 사용하여 셀룰로오스와 헤미 셀룰로스의 이미지를 생성합니다. 획득 된 스펙트럼에서 자기 모델링 곡선 분해능 (SMCR)을 수행하여 셀룰로오스와 헤미 셀룰로스의 스펙트럼을 구별하고 그 분포를 영상화하십시오.
  4. 획득 한 데이터에 대해 주성분 분석 (PCA) 및 클러스터링 분석을 수행하여 다른 셀 벽 레이어의 라만 스펙트럼을 구별합니다.

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Results

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그림 1 은 식물 세포벽의 라만 이미징을위한 전형적인 마이크로 라만 시스템의 개요를 나타냅니다. 예를 들어, 포플라 ( Populus nigra L.)의 원래 라만 스펙트럼은 상당한 기준선 드리프트와 스파이크를 가지고 있습니다 ( 그림 2a ). 라만 이미징 데이터 세트 (APRI)에 대한 자동 사전 처리 방법을 수행 한 후,이 두 스펙트럼 오염 물질이 성공적으로 제거됩니다 ( 그림 2b ). 포플러의 전형적인 라만 스펙트럼은 그림 3 에 표시되어 있으며 밴드 할당은 표 1 에 나와 있습니다. 리그닌의 라만 이미지는 방향족 고리 구조 ( 그림 4a )에 기인하...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

식물 세포 벽은 세포 모서리 (CC), 2 차벽 (S1, S2 및 S3 층을 갖는 SW) 및 복합 중간 엽 줄기 (CML, 중층 및 인접한 주 엽산)를 포함하는 여러 층으로 조직화 된 복합체이다. 벽), 이는 샘플 준비 동안 평평한 표면을 얻는 것을 어렵게 만듭니다. 따라서 나무보다 복잡한 구조를 가진 식물 샘플, 특히 잔디는 미세 절단을 위해 응고 될 필요가 있습니다. PEG는 물에 녹기 때문에 절단 및 라만 조사를위한 이상적인 하드 매트릭스입니다. 탈 이온수로 헹구면 쉽게 제거 할 수 있습니다. 임베딩에 사용 된 PEG는 1,000-20,000의 다양한 분자량을 가지고 있습니다. PEG의 분자량이 높을수록 침투력은 낮아진다. D 2 O는 리그닌의 형광을 감소시키는 데 도움이되며 2,490 cm -1 에서 현저한 피크를 갖지만 형광 간섭을 제거하지는 못합니다. 두1) 표본 및 배경 형광뿐만 아니라 CCD의 열적 변동은 기준선 드리프트를 초래할 수 있고 2) 우주선은 민감한 감지기에 현저...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 재정 지원을 위해 중국 과학 기술부 (2016YDF0600803)에 감사드립니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MicrotomeThermo ScientificMicrom HM430
컨포칼 라만 현미경Horiba Jobin YvonXplora
오븐상하이 ZHICHENGZXFD-A5040

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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