이 연구는 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 정제 된 배아 세포 집단을 얻는 방법의 표준화를 기술한다. Hoechst-33342 및 propidium iodide로 염색하는 기계적 고환 해리와 남성 생식 생물학의 비교 연구에서 폭넓게 응용할 수있는 FACS 분류법을 결합한 간단한 프로토콜입니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 포유류 고환 세균 세포의 풍부한 개체군을 분리하는 방법 중 하나였습니다. 현재, 그것은 높은 수율과 순도로 9 마리의 쥐과세 세포 집단의 차별을 허용합니다. 이 차별화와 정화의 고해상도는 정자 형성을 통한 염색질 구조와 양의 독특한 변화로 인해 가능합니다. 이러한 패턴은 Hoechst-33342 (Hoechst)와 같은 형광 DNA 결합 염색 물로 염색 된 수컷 생식 세포의 유동 세포 계측법으로 포착 할 수 있습니다. 포유류 고환 세균 세포를 분리하기 위해 최근 개발 된 프로토콜에 대한 상세한 설명이 여기에있다. 간단히 말해, 단세포 현탁액은 기계적 해리에 의해 고환 조직으로부터 생성되고, 호 에스트 (Hoechst) 및 요오드화 프로피 듐 (PI)으로 이중 염색되고 유동 세포 계측법에 의해 처리된다. 상이한 DNA 함량 (Hoechst 강도)을 갖는 살아있는 세포 (PI 음성)의 선택을 포함한 일련의 게이팅 전략, 즉FACS 분류 과정에서 5 개의 배아 세포 유형을 구별하기 위해 사용됩니다. spermatogonia (66 %), primary (71 %) 및 secondary (85 %) spermatocytes 및 spermatids (90 %)를 포함하여 평균 순도 (현미경으로 평가) (87 %)의 하위 집단. 전체 워크 플로우를 실행하는 것은 간단하며 적절한 FACS 시스템으로 4 가지 세포 유형을 동시에 분리 할 수 있으며 2 시간 이내에 수행 할 수 있습니다. 처리 시간 단축은 생체 내 생체 의 생리학을 보존하는 데 중요 하므로이 방법은 남성 생식 세포 생물학에 대한 하류 고 처리량 연구에 이상적입니다. 또한, 포유류 배아 세포의 다중 종 (multispecies) 정화를위한 표준화 된 프로토콜은 방법 론적 변수의 출처를 제거하고 상이한 동물 모델에 대해 단일 세트의 시약을 사용할 수있게한다.
서론
spermatogenesis progression을 나타내는 in vitro system이 부족하고 testis에 세포 이종성이 존재한다는 점을 감안할 때 수컷 생식 세포 생물학에 대한 연구에서는 특정 세포 유형의 농축 된 개체군을 단리하기위한 강력한 기술이 필요합니다. Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 높은 수율과 순도를 제공하고 식별 할 수있는 배양 세포 유형의 수에서 다른 단리 방법을 능가하므로이 목적을 위해 1 , 2 , 3 , 4 , 5 로 널리 사용되었습니다. 6 , 7 , 8을 선택하십시오. 유세포 분석의 원리는 단일 세포의 레이저 빔 여기 이후의 차동 빛 패턴의 검출에 기초합니다. 세포가 레이저를 통과함에 따라 빛을 반사 / 산란시킵니다.모든 각도에서 세포 크기 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
아래에 설명 된 모든 절차는 세인트루이스의 워싱턴 대학 동물 실험위원회의 규정을 준수했습니다.
1. 기계적 해리 프로토콜 준비
- 전체 쥐의 고환의 해리를 위해 50 μm 일회용 티슈 분해 카트리지를 사전 습윤 처리하십시오.
참고 :이 일회용 조직 분해 카트리지에는 조직 절단 용으로 설계된 마이크로 블레이드와 약 100 개의 육각 구멍이있는 움직일 수없는 철재가 들어 있습니다. 조직 분해 카트리지를위한 다양한 크기의 메쉬를 사용하여 종 및 원하는 세포 유형에 따라이 프로토콜을 적용 할 수 있습니다. 이 종이에서 언급 된 모든 포유류 종에는 50 μm 카트리지가 사용되었습니다.- 50 μm 일회용 조직 분해 카트리지에 얼음 찬 페놀 레드 1x Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM) 1 mL를 넣으십시오.
참고 : 페놀 빨강은 적색 형광 감지를 방해 할 수 있습니다FACS 기간 중. - 주사기 포트에서 일회용 3 ML 바늘이없는 주사기와 조직 해체 카트리지에서 1x DMEM를 대기음.
- 50 μm 일회용 조직 분해 카트리지에 얼음 찬 페놀 레드 1x Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM) 1 mL를 넣으십시오.
- "ON"버튼을 눌러 조직 분리 시스템을 켭니다. 이 시스템은 "워밍업"시간을 필요로하....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
고환 조직의 기계적 해리로 인한 단일 세포 현탁액
도 2 는 상이한 조건 하에서 마우스 고환 조직의 기계적 해리에 의해 얻어진 단일 세포 현탁액을 비교한다. ( 그림 2A ) 또는 Hoechst ( 그림 2B )로 얼룩진 신선한 조직을 처리하여 얻은 샘플은 다양한 분화 단계에서 단일 세포의 존재를 보여 주며, 중요하게는 세포 구조가 정자의 편모를 포함하여 보존 된 것으로 보입니다. 해동 후 DNase를 첨가함으로써 감소 된 염색 된 샘플에서 약간의 응집 및 파편이 관찰되었지만 ( 도 2D ), 이러한 결과는 Hoechst 염색이 단일 세포 현탁액의 품질을.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
포유 동물의 정자 형성 과정에서 고도로 보존 된 염색질 동역학을 고려할 때,이 연구의 목적은 다른 포유류 고환 조직과는 다른 분화 단계에서 남성 생식 세포를 분리하는 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다 ( 그림 1 ). 다른 동물 모델에 단일 작업 흐름을 적용하는 데있어 주요 장애물 중 하나는 특히 조직 해리 프로토콜과 관련하여 종별 조정이 필요하다는 것입니다. 현재의 방법은 대부분 효소 조직 소화에 의존하며 프로토콜은 종내 에서조차 다양합니다 12 . 이 문제를 극복하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 포유류 종의 고환 샘플에서 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 기계적 조직 해리를 적용하는 방법을 보여줍니다. 결과는이 시스템과 함께 새로운 고환 조직의 기계적 해리가 잘 수행됨을 나타냅니다 ( 그림 2A -2B
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
모든 저자는 경쟁적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자들은 개 고환에 대한 Hillside Animal 병원 (St. Louis, MO)에 감사드립니다. 제이슨 아 랜드 (Jason Arand)와 테드 시세로 (Ted Cicero) 박사는 워싱턴 대학 (세인트 루이스 워싱톤 대학)에서 쥐의 고환 및 Brianne Tabers에게 수집을 돕기위한 실험실을 제공했습니다. Jared Hartsock과 WashU의 Dr. Salt 's Lab (기니 피그 고환 검사); 소형 돼지 고환에 대한 WashU의 비교 의학 부문의 Michael Talcott 박사. 저자들은 또한 직원이 운영하는 세포 분류 서비스를 제공하는 Siteman Flow Cytometry Core의 사용을 위해 워싱턴 주립대 학교의 Alvin J. Siteman Cancer Center와 St. Louis의 Barnes-Jewish Hospital을 인정했다. Siteman Cancer Center는 부분적으로 NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842에서 지원됩니다.
이 연구는 미국 국립 보건원 (R01HD078641 및 R01MH101810 ~ D)의 보조금으로 FCT 박사 과정 (SFRH / BD / 51695 / 2011 to ACL)FC] 및 FCT 연구 계약서 [IF / ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4% 파라포름알데히드 | VWR | #15710 | 4% PFA, 분류된 세포 고정용 |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | 고환 해리 시스템 |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, 고환 해리용 |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | 고환 해리용 분해 카트리지 |
| 소 태아 혈청 | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, FACS 수집용 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, FACS 염색용 |
| 40 & 마이크로; m 세포 여과기 | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | 고환 해리용 |
| 100x 15mm 페트리 접시 | Falcon | #351029 | 고환 박리용 |
| 5mL 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브 | Falcon | #352063 | FACS 컬렉션용 |
| 1.5mL Eppendorf 튜브 | VWR | #20170-650 | FACS 컬렉션용 |
| 3mL 불필요한 주사기 | BD Biosciences | #309657 | 고환 해리 |
| 50 mL 원뿔형 튜브 | MIDSCI | 고환 해리 용 | |
| 프로피듐 요오드화물 | Invitrogen | #L7011 | PI, FACS 염색용 |
| MoFlo Legacy 세포 분류기 | Beckman Coulter | #ML99030 | FACS |
| Summit 세포 분류 소프트웨어 | Beckman Coulter | #ML99030 | FACS |
| 인산염 완충 식염수 | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, 현미경 검사용 |
| 현미경 유리 슬라이드 | Fisher Scientific | #12-544-4 | 현미경용 |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | 현미경용 |
| 일회용 전사 피펫(3mL) | Samco Scientific | #225 | 고환 해리용 |
| DNase I | Roche | #10104159001 | 고환 해리용 |
| 탄소강 수술용 블레이드 | Miltex | #4-111 | 고환 박리용 |
| Countess 자동 세포 계수기 | Invitrogen | #C10227 | 자동 세포 계수용 |
| 트리판 블루 용액(0.4%) | Sigma | #T8154 | 생존율 염색용 |
참고문헌
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
