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방법 논문

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

11.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/55913

⸱

2017년 7월 12일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 정제 된 배아 세포 집단을 얻는 방법의 표준화를 기술한다. Hoechst-33342 및 propidium iodide로 염색하는 기계적 고환 해리와 남성 생식 생물학의 비교 연구에서 폭넓게 응용할 수있는 FACS 분류법을 결합한 간단한 프로토콜입니다.

초록

Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 포유류 고환 세균 세포의 풍부한 개체군을 분리하는 방법 중 하나였습니다. 현재, 그것은 높은 수율과 순도로 9 마리의 쥐과세 세포 집단의 차별을 허용합니다. 이 차별화와 정화의 고해상도는 정자 형성을 통한 염색질 구조와 양의 독특한 변화로 인해 가능합니다. 이러한 패턴은 Hoechst-33342 (Hoechst)와 같은 형광 DNA 결합 염색 물로 염색 된 수컷 생식 세포의 유동 세포 계측법으로 포착 할 수 있습니다. 포유류 고환 세균 세포를 분리하기 위해 최근 개발 된 프로토콜에 대한 상세한 설명이 여기에있다. 간단히 말해, 단세포 현탁액은 기계적 해리에 의해 고환 조직으로부터 생성되고, 호 에스트 (Hoechst) 및 요오드화 프로피 듐 (PI)으로 이중 염색되고 유동 세포 계측법에 의해 처리된다. 상이한 DNA 함량 (Hoechst 강도)을 갖는 살아있는 세포 (PI 음성)의 선택을 포함한 일련의 게이팅 전략, 즉FACS 분류 과정에서 5 개의 배아 세포 유형을 구별하기 위해 사용됩니다. spermatogonia (66 %), primary (71 %) 및 secondary (85 %) spermatocytes 및 spermatids (90 %)를 포함하여 평균 순도 (현미경으로 평가) (87 %)의 하위 집단. 전체 워크 플로우를 실행하는 것은 간단하며 적절한 FACS 시스템으로 4 가지 세포 유형을 동시에 분리 할 수 ​​있으며 2 시간 이내에 수행 할 수 있습니다. 처리 시간 단축은 생체 내 생체 의 생리학을 보존하는 데 중요 하므로이 방법은 남성 생식 세포 생물학에 대한 하류 고 처리량 연구에 이상적입니다. 또한, 포유류 배아 세포의 다중 종 (multispecies) 정화를위한 표준화 된 프로토콜은 방법 론적 변수의 출처를 제거하고 상이한 동물 모델에 대해 단일 세트의 시약을 사용할 수있게한다.

서론

spermatogenesis progression을 나타내는 in vitro system이 부족하고 testis에 세포 이종성이 존재한다는 점을 감안할 때 수컷 생식 세포 생물학에 대한 연구에서는 특정 세포 유형의 농축 된 개체군을 단리하기위한 강력한 기술이 필요합니다. Fluorescence-activated cell sorting (FACS)은 높은 수율과 순도를 제공하고 식별 할 수있는 배양 세포 유형의 수에서 다른 단리 방법을 능가하므로이 목적을 위해 1 , 2 , 3 , 4 , 5 로 널리 사용되었습니다. 6 , 7 , 8을 선택하십시오. 유세포 분석의 원리는 단일 세포의 레이저 빔 여기 이후의 차동 빛 패턴의 검출에 기초합니다. 세포가 레이저를 통과함에 따라 빛을 반사 / 산란시킵니다.모든 각도에서 세포 크기 (전방 산란; FSC) 및 세포 내 복잡성 (측방 산란; SSC)에 비례한다. 유동 세포 계측법에 대한 자세한 내용은 Ormerod 9 를 참조하십시오.

남성 생식 세포는 정자 형성의 여러 단계에 걸쳐 DNA 함량, 염색질 구조, 크기 및 모양에 특별한 변형을합니다. 따라서 뚜렷한 세포 집단은 형광 염료 10 , 11로 빛의 산란과 DNA 염색을 결합하여 확인하고 분리 할 수 ​​있습니다. 몇몇 염료는 종종 10 지난 십 1, 2, 4 고환 세포의 유동 세포 계측법 분석에 사용 된 이러한 목적 등의 Hoechst-33342 (헥스)로서, (Geisinger 그리고 로드리게스-Casuriaga 3에서 검토)에 사용될 수있다 , 12 . 우포UV- 빛을 이용한 여기 Hoechst는 세포 DNA의 내용에 비례하여 청색 형광을 방출하는 반면, 원적외선 형광은 염색질 구조 및 압축 1 , 13 , 14의 가변성을 반영합니다. 그 결과, 분화의 다양한 단계에서 남성 생식 세포는 훽스트 염색 단일 세포 현탁액 FACS 동안 특정 패턴을 나타낸다 (호 FACS-1, 12). 흥미롭게도, 정자 단계에서만 활성화되는 색소 유출의 메커니즘으로 인해, Hoechst blue 형광의 강도는이 세포의 염색질 함량에 비례하지 않으며, Ho-FACS 15 동안 부작용으로 분류됩니다. 또한 Hoechst 염색을 비 침투성 염료 propidium iodide (PI)와 결합하면 사용자가 FACS 1 < 1 일 때 죽은 (PI 양성) 세포와 생체 (PI 음성)를 구별 할 수 있습니다.2 , 10 , 12 이다. 이전 유세포에서 사용되고 이러한 전략은 고환 생식 세포의 분석 및 감수 I 1, 2, 4, 16의 4 가지 단계의 세포를 포함 9 개 생식 세포 유형까지 판별 마우스에서 광범위하게 최적화. 이 작품의 목적을 위해, Hoechst 염색법은 세 가지 주요 장점이 있습니다. 먼저, Ho-FACS는 마우스 모델 1 , 2 , 12 및 기타 쥐 (rat 및 쥐 돼지 17 , 18 , 19) 의 남성 생식 세포의 분리에 성공적으로 적용되었습니다. 둘째, Hoechst는 세포 투과성 염료이며 막 투과성을 필요로하지 않으므로 보존제가됩니다ves cell integrity. 마지막으로 Hoechst가 poly (d [AT]) DNA 서열 1 , 20 에 우선적으로 결합하기 때문에 RNase 처리가 필요하지 않다. RNA가 보존되고 DNA와 단백질 이외에 세균의 추가 하류 분자 연구에 사용될 수 있음을 의미한다 세포 분화.

포유류 종의 유동 세포 계측법 분석 (Geisinger and Rodriguez-Casuriaga 3 에서 검토 됨)에서 관찰 된 DNA 배수성 및 / 또는 염색성의 유사성에도 불구하고, 유동 세포 계측법에 의한 수컷 배아 세포 분리에 대해 설명 된 프로토콜에는 상당한 다양성이있었습니다. 여러 연구에서 조직 해리에 대한 특정 프로토콜을 사용하고 주로 마우스, 쥐 및 기니피그 등 다양한 모델 유기체에서 별개의 DNA 결합 염료 (단독 또는 조합)와 FACS 게이팅 전략을 사용했습니다. 따라서 서로 다른 종에 대해 수집 된 자료를 직접 비교하는 것은 unacco의 영향을받을 수 있습니다방법론 사이의 다양성으로 인한 기술적 인 유물이 없습니다. 중요한 것은 포유류 정자 형성 (2N - 4N - 2N - 1N)에 걸쳐 염색질 동력학의 놀라운 보존은 표준화 된 프로토콜이 다양한 포유류 종에 횡 방향으로 적용될 수 있음을 시사합니다.

이 연구의 목표는 결합하고, 20 이전에 출판 기술 (2)를 적용하여, 다른 포유 동물 종에 적용 할 수있는 하나의 워크 플로우를 개발하는 것이 었습니다. 조직 처리하기위한 방법의 표준화는 효소 분해에 필요한 5 종 특이 조정에 대한 필요성을 해결하기 위해 기계적 분해를 수행함으로써 달성되었다. 설치류 고환 조직의 기계적 해리가 두 가지 방법으로 생성 된 단일 세포 현탁액의 효소 조직 소화 20 및 Ho-FACS보다 우수한 것으로 나타났습니다그것과 비교 가능한 결과 5 . 원칙 증명으로이 프로토콜은 최대 5 개의 생식 세포 집단을 분리하는데 사용 된 설정을 기술합니다 : spermatogonia (SPG); 1 차 (SPC I) 및 2 차 spermatocytes (SPC II) 및 spermatids (SPD) - 라운드 (rSPD) 및 연장 (eSPD). 중요한 것은 조직 해부 및 UV 레이저가 장착 된 셀 분류기에 대한 액세스 시스템이 주요 요구 사항 인 실험실에서 쉽게 구현할 수 있다는 것입니다. 이 작업 흐름 ( 그림 1 )은 빠르고 간단하며 2 시간 이내에 새로운 고환 조직에서 4 개의 배아 세포 집단을 동시에 격리 할 수 ​​있습니다. 감소 된 처리 시간은 추가 다운 스트림 절차를 위해 셀룰러 무결성을 유지하는 데 중요합니다. 더욱이 5 종의 다른 종에서의 성공적인 수행은 포유 동물의 clade 내에 광범위하게 적용될 수 있음을 시사하며 포유 동물의 남성 생식 기관의 비교 연구를 위해 생식 세포를 분리하는 이상적인 방법으로 만든다ogy.

이 프로토콜은 준비 단계를 제외하고 세 가지 주요 섹션으로 구성되어 있습니다 : (1) 고환 조직의 기계적 해리 및 (2) Hoechst 및 PI와의 고환 세포 염색, (3) 관련 정자 세포의 FACS 분류. 일단 포집되면, 다양한 포유류 고환 세균 세포의 이러한 풍부한 개체군은 광범위한 적용 분야에 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 많은 다른 포유 동물 종에서 남성의 배아 세포를 정화하는 "모든 크기에 맞는"해리 방법을 설명합니다. 격리 된 생식 세포로 수행하고자하는 연구 유형에 따라 다른 배지 또는 완충액을 사용할 수 있습니다. 다음 프로토콜 단계는 하나의 전체 쥐의 정소에서 단일 세포 현탁액을 생성하는 것입니다.

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프로토콜

아래에 설명 된 모든 절차는 세인트루이스의 워싱턴 대학 동물 실험위원회의 규정을 준수했습니다.

1. 기계적 해리 프로토콜 준비

  1. 전체 쥐의 고환의 해리를 위해 50 μm 일회용 티슈 분해 카트리지를 사전 습윤 처리하십시오.
    참고 :이 일회용 조직 분해 카트리지에는 조직 절단 용으로 설계된 마이크로 블레이드와 약 100 개의 육각 구멍이있는 움직일 수없는 철재가 들어 있습니다. 조직 분해 카트리지를위한 다양한 크기의 메쉬를 사용하여 종 및 원하는 세포 유형에 따라이 프로토콜을 적용 할 수 있습니다. 이 종이에서 언급 된 모든 포유류 종에는 50 μm 카트리지가 사용되었습니다.
    1. 50 μm 일회용 조직 분해 카트리지에 얼음 찬 페놀 레드 1x Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM) 1 mL를 넣으십시오.
      참고 : 페놀 빨강은 적색 형광 감지를 방해 할 수 있습니다FACS 기간 중.
    2. 주사기 포트에서 일회용 3 ML 바늘이없는 주사기와 조직 해체 카트리지에서 1x DMEM를 대기음.
  2. "ON"버튼을 눌러 조직 분리 시스템을 켭니다. 이 시스템은 "워밍업"시간을 필요로하지 않습니다.
  3. 얼음처럼 차가운 1 x DMEM이있는 3 개의 40 μm 일회용 필터를 사전 적시십시오. 50 ML 원뿔 튜브에 각 40 μm의 일회용 필터를 놓습니다. 1X DMEM 1 mL를 피펫으로 통과 시키십시오.
  4. 고환 조직 수집을 위해 100mm x 15mm 페트리 접시를 준비합니다. 배양 접시에 1x DMEM 500 μL를 피펫.

2. 기계적 해리 프로토콜을위한 고환 조직의 준비

  1. 외과 용 가위 및 집게로 신생 모든 고환 또는 고환 조각 (다른 포유류 종을 다루는 경우)을 조심스럽게 제거하기 위해 수컷 마우스를 해부합니다.
    참고 : 조직에 지방과 괴사가 없어야합니다. Fr esh 고환 조직은 냉동 조직보다 우수한 단일 세포 현탁액 품질을 생성합니다.
    1. 수집 한 고환 / 조각을 1x DMEM 500 μL가 들어있는 준비된 100 mm x 15 mm 페트리 접시에 옮긴다.
    2. 적혈구 (존재하는 경우)를 제거하기 위해 1x DMEM에서 조직을 부드럽게 헹구십시오.
  2. 조심스럽게 tunica albuginea를 제거하십시오. tunica albuginea의 두께는 다른 종에 따라 다릅니다.
    1. 포 셉스로 고환의 한쪽 끝을 잡으십시오.
    2. 이전 단계에서 포 셉를 가진 고환의 한쪽 끝을 여전히 잡고있는 동안 메스로 고환의 다른 끝을 찔러 라.
    3. 메스를 사용하여 정소의 한쪽 끝을 2.2.1 단계의 집게로 잡고 고환 세관을 긁습니다.
  3. 메스를 사용하여 고환 세뇨관을 ~ 2-3 mm 3의 조각으로 자르십시오.

3. 고환 조직의 기계적 해리에 의한 단일 세포 현탁액의 취득

ontent "> 참고 : 아래에 설명 된 해리 단계는 한 마리의 성숙한 마우스 고환에 대한 것이며, 어린 쥐 또는 비 쥐과 동물의 고환 조직의 양은 이에 따라 조정해야합니다. 정소 조직 구성은 번식기에 비 교배 계절과 비교하여 변화한다.

  1. 포셉을 사용하여 미리 젖은 50 μm의 조직 분해 카트리지에 작은 고환 tubule 조각을 전송하고 1x DMEM의 1 ML을 추가합니다.
  2. 조직 해체 카트리지를 조직 분해 시스템에로드하고 손잡이를 "대기"모드에서 "실행"모드로 돌린 후 5 분 동안 처리하십시오.
  3. 조직 분해 시스템에서 조직 분해 카트리지를 제거하고 주사기 포트에서 일회용 3 ML 바늘없는 주사기로 세포 현탁액을 대기음.
    1. 조직 분해 카트리지에서 모든 액체를 제거하기 위해 몇 번 대기음을하십시오. 아니모든 1 mL는 조직 분해 카트리지로부터 회수 될 수있다.
  4. 흡인 된 세포 현탁액을 2 개의 일회용 사전 습윤 40 μm 필터에 통과시킵니다. 모든 셀 집계를 제거하려면 두 번 필터링하십시오.
    1. 40 mL 필터를 50 mL 원추형 튜브에 넣으십시오. 직접 40μm 필터에 주사기에 흡인 세포를 추가합니다. 일회용 피펫으로 피펫 통과 단일 세포 현탁액.
    2. 사용 된 pre-wetted 40 μm 필터를 제거하고 50 μm 원추형 튜브에 또 다른 pre-wetted 40 μm 필터를 놓습니다. 깨끗한 40 μm의 필터에 수집 된 단일 세포 현탁액을 피펫.
    3. 깨끗한 일회용 피펫으로 여과 된 단일 세포 현탁액을 수집하십시오.
  5. 피펫은 50 μm 조직 분해 카트리지에 세포 현탁액을 걸러 내고 조직 분해 시스템에서 또 다른 5 분 동안 처리합니다.
  6. 조직 disaggregati에서 모든 액체를 복구카트리지에.

4. Hoechst 및 Propidium Iodide (PI)로 염색

  1. 회수 된 세포 현탁액을 50 μm 조직 분해 카트리지에서 깨끗한 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 약 1-1.5 mL의 단일 세포 현탁액이 회수됩니다.
  2. 회수 된 단일 세포 현탁액을 4 개의 1.5 mL 또는 5 mL 튜브로 나누십시오.
    1. 처음 세 개의 튜브의 경우, 단일 세포 현탁액 150 μL과 4 개의 튜브 (단일 세포 현탁액의 약 550 μL)의 마지막에 단일 세포 현탁액의 피펫 나머지를 피펫.
      참고 : 최종 튜브의 단일 세포 현탁액의 양은 단계 3.6에서 세포 현탁액의 회복 효율에 따라 달라질 수 있습니다.
  3. FACS 세션을위한 unstained 컨트롤로 네 튜브의 첫 번째 튜브를 설정합니다.
  4. 컨트롤로 단일 염료 스테인드 (PI 또는 Hoechst) 세포 현탁액을 준비합니다. 각 튜브에 2.5 ㎕의 Hoechst 또는 PI 1 μL를 넣으십시오 (두 번째와 third).
  5. 이중으로 염색 된 튜브를 준비하십시오. 이것은 배아 세포 집단을 모으는데 사용될 것입니다. Hoechst 2.5 μL와 PI 1 μL를 마지막 튜브에 첨가하십시오.
    참고 : Hoechst의 유통 기한은 2 ~ 3 개월입니다. 염료의 오래된 주식을 사용하면 FACS 세션 동안 상당한 변경이 발생할 것입니다.
  6. 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 품어 낸다. 튜브 회 전자에 시료를 넣거나 5 ~ 10 분 간격으로 1.5 mL 튜브를 뒤집습니다.
  7. 미리 젖은 40 μm의 여과기로 세포 현탁액을 여과하고 여과 된 용액을 얼음과 어둠 속에서 FACS 세션까지 보관하십시오.
    참고 : 여과 단계는 FACS의 세포 덩어리를 예방하는 데 필요합니다. 또한 DNase ( 그림 1 참조) 또는 2- Naphthol-6,8-disulfonic acid diotassium salt (NDA 20 )로 처리하면 세포 응집을 제한 할 수 있습니다. 연장 된 대기 기간은 FACS 동안 검출 된 형광 신호에 영향을 미치고 증가 된 세포 사멸을 초래할 수 있습니다.

5. 형광 활성화 세포 정렬 (FACS) 고환 세포의 설정 및 정화

  1. FACS 수집 튜브를 준비하십시오.
    1. 세포 수집을위한 FBS 400 μL와 5 ML 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브 또는 1.5 ML 튜브를 코트. 코팅 후 과량의 FBS를 따라 내십시오.
    2. 튜브에 FACS 수집 매체 (1x DMEM + 10 % 태아 소 혈청, FBS)를 튜브에 추가하십시오 : 5mL 튜브의 경우 1mL 또는 1.5mL 튜브의 경우 100μL.
  2. 셀 분류기 및 소프트웨어에서 적절한 정렬 조건을 설정하십시오.
    참고 : 아래에 설명 된 것과 유사한 설정 및 게이팅 전략을 사용하여 다른 셀 분류 기계 및 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 여기에 설명 된 조건은 Gaysinskaya와 Bortvin 2 , Geisinger와 Rodriguez-Casuriaga 3 , Getun, et al. 4
    1. 463/2로 자외선 레이저로드Hoechst blue를 검출하기위한 5 nm band pass filter와 Hoechst red를 검출하고 PI를 검출하기위한 680 nm LP band pass filter.
    2. 555DLP 이색 성 거울을 사용하여 청색과 빨간색 형광을 구별합니다.
    3. 70 μm 노즐을 사용하고 1000-2000 세포 / 초 속도로 세포를 분류하십시오.
      참고 : 정렬 효율은 유량에 의해 직접적으로 영향을받습니다. 높은 유속 (> 3500 events / s)은 분류의 속도를 증가 시키지만 인구의 오염을 초래합니다. 자세한 내용은 참조 12 를 참조하십시오.
  3. 대조 샘플을 사용하여 게이트를 설정하십시오.
    1. 염색되지 않은 샘플을로드하고 실행하십시오.
    2. FSC vs SSC 플롯 패턴에 따라 세포 파편을 제외합니다. 세포 잔해가 음모의 왼쪽 아래 사분면에 나타납니다. 사용자 또는 셀 분류기 기술자가 셀 파편에 대한 임계 값을 임의로 설정합니다.
    3. FSC 및 펄스 폭에 대한 임계 값을 조정하여 단일 셀의 게이트. 다른 세포 분류기는 서로 다른 방법으로 분배 할 수 있습니다.sing singles. 펄스 폭은 세포가 레이저를 가로 지르는 데 걸린 시간을 반영하기 때문에 단일 세포는 다세포 골재에 비해 더 낮은 값을 갖습니다. FSC 대 펄스 폭에 대한 플롯의 임계 값 조정은 싱글 렛을 선택하는 데 사용될 수 있습니다.
    4. 최적의 광전자 증 배관 (PMT) 전압을 설정하십시오.
    5. PI 또는 Hoechst 형광 신호의 임계 값을 확립하기 위해 염색되지 않은 염색 세포와 단일 염료 염색 세포를 사용하십시오.
      참고 : 각 염료에 적절한 형광 범위를 설정하려면 관심있는 세포에 대한 기본 PTM 전압을 최적화하는 것이 중요합니다. 이는 최적의 신호 탐지 및 민감성을 위해 중요합니다. 염색되지 않은 단일 염색 대조 세포는 PI 및 / 또는 Hoechst 염료를 사용하여 음성 및 양성 염색 세포의 범위를 확립하고 신호의 잡음을 최소화하는 데 사용됩니다. 제어 셀을 사용하여 PMT 전압을 최적화하는 방법에 대한 자세한 설명은 Gaysinskaya 및 Bortvin 2 를 참조하십시오.
    6. 살아있는 세포의 문PI 염색 (PI 음성) 및 FSC 플롯을 기반으로 하였다. 죽은 세포는 PI 형광에 대해 양성 반응을 보일 것입니다.
    7. Hoechst blue 형광에 근거한 세포 수의 막대 그래프를 플로팅하여 DNA 내용 게이트를 설정하십시오. haploid (1C), 2 배체 (2C) 및 4 배체 (4C) 세포를 나타내는 Hoechst blue 형광 농도가 증가하는 3 개의 피크가 나타납니다. 3 개의 게이트를 설정합니다 (각 피크 당 하나씩).
    8. 세균 세포 집단에 대한 게이팅을 진행하기 전에 적어도 50 만 건의 FSC 대 SSC 계획을 관찰하십시오.
  4. 게이트 다른 생식 세포 인구.
    1. Hoechst / PI 스테인드 시료를 넣습니다.
    2. 모든 모집단에 공통적 인 처음 3 개의 모기지 게이트를 설정하십시오.
      1. FSC vs SSC 플롯을 기준으로 세포 파편을 제외합니다. FSC와 펄스 폭 플롯을 기준으로 싱글 렛을 선택하십시오. PI 음성 세포를 게이팅하여 살아있는 세포를 선택하십시오.
    3. spermatogonia 게이트를 정의하십시오.
    4. Hoechst 청색 및 적색 형광에 근거한 PI 음성 세포강도. Spermatogonia는 부작용으로 나타납니다 ( 그림 1 참조).
    5. 나머지 생식 세포 집단에 대한 문을 정의하십시오. 참고 : 자세한 내용은 그림 1과 보조 그림 2를 참조하십시오.
    6. DNA 콘텐츠 게이트에 PI 부정적인 세포를 플롯하십시오.
      1. spermatids 들어 가장 낮은 Hoechst 형광 (1C)와 피크를 문.
      2. spermatocytes II 들어, 중간 Hoechst 형광 (2C)와 피크를 게이트.
      3. spermatocytes 들어, 가장 높은 Hoechst 형광 (4C)와 피크를 문.
    7. DNA 콘텐츠 게이트에서 spermatocytes 및 spermatids 집단을 정제하기 위해 Hoechst 청색 및 적색 형광 강도를 플롯합니다.
  5. 이전에 준비된 수집 튜브에 선택한 subpopulation 게이트를 수집합니다. 각 정소 각 모집단 약 0.5-6.0 × 106 세포를 수집하고, 1.5 시간에 45 분의 평균을 취한다.
    참고 : Hoechst mA에 장기간 세포 노출y는 시간이 지남에 따라 인구의 위치를 ​​약간 이동시킵니다. FACS의 20-30 분 후 설정을 새로 고칩니다. 각 하위 집단에 대한 최대 수율은 해리 단계의 효율성에 달려있다.

6. 정제 된 세포의 미세한 평가

  1. 4 ° C에서 10 분 동안 500-600 xg에서 세포를 스핀.
  2. 얼음 감기 1X 인산 버퍼 솔루션 (PBS) 또는 1X DMEM의 1 ML로 세포 펠렛을 다시 중단하십시오.
    참고 : 재현 현탁액은 분류 된 세포의 수와 원하는 최종 농도에 따라 조정할 수 있습니다.
  3. 깨끗한 유리 슬라이드에 세차 세포 40 μL 피펫과 coverslip을 놓으십시오.
  4. 4 % paraformaldehyde (PFA)로 남아있는 세포를 고정시키고 4 ℃에서 고정 된 세포를 저장하여 나중에 참조 할 수있게한다.
    1. 수집 튜브에 100 μL 4 % PFA를 직접 피펫에 넣습니다.
    2. 세포 현탁액의 잘 혼합되도록 튜브 또는 피펫을 간단히 와동시킨다.
  5. 준비된 슬라이드를 자외선 램프가 장착 된 현미경으로 시각화하여 63X 대물 렌즈에서 Hoechst 형광을 검출합니다. 특정 배아 세포 유형을 식별하는 방법에 대한 자세한 내용은 결과 섹션 - 분류 된 배아 세포 집단의 형태 학적 평가를 참조하십시오.

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결과

고환 조직의 기계적 해리로 인한 단일 세포 현탁액

도 2 는 상이한 조건 하에서 마우스 고환 조직의 기계적 해리에 의해 얻어진 단일 세포 현탁액을 비교한다. ( 그림 2A ) 또는 Hoechst ( 그림 2B )로 얼룩진 신선한 조직을 처리하여 얻은 샘플은 다양한 분화 단계에서 단일 세포의 존재를 보여 주며, 중요하게는 세포 구조가 정자의 편모를 포함하여 보존 된 것으로 보입니다. 해동 후 DNase를 첨가함으로써 감소 된 염색 된 샘플에서 약간의 응집 및 파편이 관찰되었지만 ( 도 2D ), 이러한 결과는 Hoechst 염색이 단일 세포 현탁액의 품질을...

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토론

포유 동물의 정자 형성 과정에서 고도로 보존 된 염색질 동역학을 고려할 때,이 연구의 목적은 다른 포유류 고환 조직과는 다른 분화 단계에서 남성 생식 세포를 분리하는 프로토콜을 개발하는 것이 었습니다 ( 그림 1 ). 다른 동물 모델에 단일 작업 흐름을 적용하는 데있어 주요 장애물 중 하나는 특히 조직 해리 프로토콜과 관련하여 종별 조정이 필요하다는 것입니다. 현재의 방법은 대부분 효소 조직 소화에 의존하며 프로토콜은 종내 에서조차 다양합니다 12 . 이 문제를 극복하기 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 포유류 종의 고환 샘플에서 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 기계적 조직 해리를 적용하는 방법을 보여줍니다. 결과는이 시스템과 함께 새로운 고환 조직의 기계적 해리가 잘 수행됨을 나타냅니다 ( 그림 2A -2B

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공개 사항

모든 저자는 경쟁적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

저자들은 개 고환에 대한 Hillside Animal 병원 (St. Louis, MO)에 감사드립니다. 제이슨 아 랜드 (Jason Arand)와 테드 시세로 (Ted Cicero) 박사는 워싱턴 대학 (세인트 루이스 워싱톤 대학)에서 쥐의 고환 및 Brianne Tabers에게 수집을 돕기위한 실험실을 제공했습니다. Jared Hartsock과 WashU의 Dr. Salt 's Lab (기니 피그 고환 검사); 소형 돼지 고환에 대한 WashU의 비교 의학 부문의 Michael Talcott 박사. 저자들은 또한 직원이 운영하는 세포 분류 서비스를 제공하는 Siteman Flow Cytometry Core의 사용을 위해 워싱턴 주립대 학교의 Alvin J. Siteman Cancer Center와 St. Louis의 Barnes-Jewish Hospital을 인정했다. Siteman Cancer Center는 부분적으로 NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842에서 지원됩니다.

이 연구는 미국 국립 보건원 (R01HD078641 및 R01MH101810 ~ D)의 보조금으로 FCT 박사 과정 (SFRH / BD / 51695 / 2011 to ACL)FC] 및 FCT 연구 계약서 [IF / 01262 / 2014 to AML]가 포함됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4% 파라포름알데히드VWR#157104% PFA, 분류된 세포 고정용
MedimachineBD Biosciences#340588;고환 해리 시스템
1X Dulbecco modified Eagle mediumLife Technologies#31053DMEM, 고환 해리용
MediconBD Biosciences#340591고환 해리용 분해 카트리지
소 태아 혈청Thermo Scientific#10082139FBS, FACS 수집용
Hoechst 33342Invitrogen#H3570Hoecsht, FACS 염색용
40 & 마이크로; m 세포 여과기GREINER BIO-ONE#89508-342고환 해리용
100x 15mm 페트리 접시Falcon#351029고환 박리용
5mL 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브Falcon#352063FACS 컬렉션용
1.5mL Eppendorf 튜브VWR#20170-650FACS 컬렉션용
3mL 불필요한 주사기BD Biosciences#309657고환 해리
50 mL 원뿔형 튜브MIDSCI고환 해리 용 
프로피듐 요오드화물Invitrogen#L7011PI, FACS 염색용
MoFlo Legacy 세포 분류기Beckman Coulter#ML99030FACS
Summit 세포 분류 소프트웨어Beckman Coulter#ML99030FACS
인산염 완충 식염수Thermo Scientific#AM9625PBS, 현미경 검사용
현미경 유리 슬라이드Fisher Scientific#12-544-4현미경용
Glass coverslipFisher Scientific#12-548-87현미경용
일회용 전사 피펫(3mL)Samco Scientific#225고환 해리용
DNase IRoche#10104159001고환 해리용
탄소강 수술용 블레이드Miltex#4-111고환 박리용
Countess 자동 세포 계수기Invitrogen#C10227자동 세포 계수용
트리판 블루 용액(0.4%)Sigma#T8154생존율 염색용
#C50R 용 용

참고문헌

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