전통적인 슬랩 젤 전기 영동 (SGE) 실험은 복잡한 장치와 높은 화학 물질 소비가 필요합니다. 이 연구는 단시간 내에 DNA 단편을 분리하는 저비용 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
슬래브 겔 전기 영동 (SGE)은 DNA 단편을 분리하는 가장 일반적인 방법입니다. 따라서 그것은 생물학 및 다른 분야에 광범위하게 적용됩니다. 그러나 전통적인 SGE 프로토콜은 매우 지루하고 실험에 많은 시간이 걸립니다. 또한, SGE 실험에서 화학 물질 소비가 매우 높습니다. 이 연구는 SGE 칩을 기반으로 DNA 조각을 분리하는 간단한 방법을 제안한다. 이 칩은 조각 기계로 만든다. 두 개의 플라스틱 시트가 광 신호의 여기 및 방출 파장에 사용됩니다. DNA 밴드의 형광 신호는 스마트 폰으로 수집됩니다. 이 방법을 확인하기 위해 50, 100 및 1,000 bp DNA 사다리를 분리했습니다. 결과는 5,000 bp보다 작은 DNA 사다리가이 방법을 사용할 때 12 분 이내에 고해상도로 분석 할 수 있음을 보여 주며 전통적인 SGE 방법에 대한 이상적인 대체품임을 나타냅니다.
서론
슬랩 겔 전기 영동 (SGE)은 DNA 단편 분리 1 , 2 , 3 , 4 , 5 에 가장 효과적인 방법이며 따라서 생화학 및 생물학적 분석에서 다용도 도구로 간주됩니다 6 , 7 , 8 . 그러나 많은 실험에서 SGE가 다음 네 가지 문제에 의해 제한된다는 것을 나타냅니다. (1) 분리에는 수 시간이 걸리고 심지어 며칠이 걸립니다. (2) 화학 물질 소비가 매우 높다. (3) 복잡한 장치 ( 예 : 2D 전기 영동 세포, 전기 영동 전원 및 겔 이미징 시스템)가 필요합니다. (4) 겔 영상 시스템은 실험이 끝났을 때 분리 된 DNA 조각만을 관찰 할 수있다. 또한, SGE 9 에서 일반적으로 사용되는 ethidium bromide (EtBr)10 = 돌연변이 유발 및 암 유발 11,12 . 따라서 EtBr이 들어있는 젤을 나눠 줄 때는 항상 장갑을 착용해야합니다.
모세관 전기 영동 (CE)은 자동 작동, 짧은 분리 시간, 낮은 소비 등과 같은 SGE에 비해 13 , 14 , 15 , 16 , 17의 다양한 장점을 가지고 있습니다. 그러나 CE 장비는 꽤 비쌉니다. 따라서 이러한 한계를 극복하기 위해 DNA 분리를위한 시스템이 개발되었습니다 ( 그림 1 ). 이러한 시스템은 화학 물질 소비를 크게 줄이고 SGE 실험 시간 (8 분 미만)을 절약 할 수있을뿐만 아니라 스마트 폰을 통해 아가로 오스 겔에서 DNA 분리 과정을 실시간으로 추적 할 수도 있습니다. 이 프로토콜에 설명 된 절차를 따르면, 학생들은SGE 칩을 설계 및 제작하고, 칩에서 아가 로스 겔을 준비하고, 스마트 폰으로 간단한 SGE 시스템을 설치하고 아가로 오스 겔에서 DNA 이동 과정을 기록 할 수 있어야한다.
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프로토콜
1. SGE 칩의 기본 설계
- 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 또는 폴리 카보네이트와 같은 투명 플라스틱을 사용하십시오.
참고 : SGE 칩은 그림 1B 에 나와 있습니다. SGE 칩은 TBE 버퍼 용 원통형 구멍, DNA 분리 용 채널 및 전극 용 구멍을 따라 삽입 된 2 개의 차선으로 구성됩니다. - 레이저 조각기를 사용하여 PMMA 블록에서 SGE 채널 어레이를 제작하십시오.
참고 : 칩의 기하학적 매개 변수는 분리 할 DNA의 크기에 따라 다릅니다. 예를 들어, DNA 조각이 1,000bp보다 작 으면 SGE 칩의 최적 채널 매개 변수는 2.5mm x 4.0mm x 90mm (폭 x 깊이 x 길이)입니다. - SGE 디자인을 기반으로 DNA 샘플을로드하기 위해 칩에 우물을 만들기 위해 빗을 제작하십시오.
2. 아가로 오스 겔의 제조
- 10 × TBE (1 × TBE =89 mM 트리스, 89 mM 붕산 및 2 mM EDTA; pH 8.4) 및 증류수를 1:19 비율로 혼합 하였다.
- 100-bp DNA 사다리를 분리하기위한 1.0 % 아가 로즈 겔을 준비한다.
참고 : 0.5x TBE 버퍼에서 아가로 오스의 농도는 분리 할 DNA 단편의 크기에 따라 다릅니다. - 플라스크에 0.1 g의 아가로 오스를 넣고 0.5 x TBE 완충액 10 mL를 넣는다.
참고 : 준비된 용액의 부피는 플라스크 용량의 1/3보다 적어야합니다. - 플라스크를 방부제 필름으로 밀봉 한 다음 전자 레인지 (중간, 1.0 분)에서 아가로 오스 / 버퍼 혼합물을 가열하십시오. 플라스크를 전자 렌지에 넣기 전에 방폭이 될 경우 방수 필름에 구멍을 뚫습니다.
- SGE 칩의 4 채널에 녹인 아가로 오스 솔루션 2.7 ML을 부어. 우물을 만들기 위해 빗을 아가로 오스 용액에 넣으십시오.
참고 : 녹은 아가로 오스 솔루션은 실온에서 3 분 후 겔 상태로 냉각됩니다. - g에서 빗을 꺼냅니다.겔을 덮고 0.5x TBE 완충액 0.9 mL를 넣어 젤을 덮는다.
3. SGE 칩에서 전기 영동 실행하기
- LED 광원을 켜고 광원 위에 425 ~ 505 nm 밴드 패스 필터를 놓습니다.
- 100 bp DNA 사다리 14.4 μL와 SYBR Green 1.6 μL를 볼텍스를 사용하여 섞는다.
- SGE 칩 ( 그림 2 )에서 아가로 오스 겔의 각 우물에 혼합물 4 μL를 적재하십시오.
- SGE 칩의 두 차선에 전극을 놓습니다.
- SGE 칩 위에 550 ~ 700 nm 밴드 패스 필터를 배치하십시오.
- 전원을 켜십시오. 전기 전압을 180V (20V / cm)로 설정하십시오. 스마트 폰을 켜서 DNA 단편 분리 과정을 기록하십시오 ( 그림 3 ).
- 10 분 후에 전기 영동이 끝나면 전원과 LED 표시등을 끕니다.
- SGE 칩을 청소하십시오.
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결과
그림 4 , 그림 5 및 그림 6 은 50, 100 및 1,000 bp DNA 사다리의 겔 전기 영동 후 일반적인 결과를 나타냅니다. 실험 후, DNA 조각은 잘 분리되었다. 또한 동일한 샘플을 SGE 칩의 4 개 채널에서 분리하여 동일한 크기의 DNA 조각이 각 실험에서 동일한 거리로 이동 함을 보여줍니다.
DNA 사다리의 분리 성능은 이동 거리와 DNA 크기의 대수 관계를 분석하여 평가할 수 있습니다. 따라서, SGE는 미지의 DNA 단편의 크기를 계산하는데 적용될 수있다. 그림 3 에서 이동 거리는 DNA 크기가 700bp보다 작 으면 선형 적으로 DNA 크기의 로그와 관련이 있음을 알 수 있습니다.
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토론
아가 로스 겔 전기 영동은 DNA, RNA 및 단백질 분리에 널리 사용됩니다. 이 연구는 전통적인 겔 전기 영동 프로토콜을 대체 할 새로운 방법을 제안합니다. 결과는 50, 100 및 1,000 bp DNA 사다리가 작은 조립 장치에서 잘 분리 될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 거의 화학 물질을 소비하지 않고 핵산을 분리 할 수있을뿐만 아니라 분리 과정을 기록 할 수 있다는 것입니다. 그림 2 에서 DNA 단편이 넓게 보였지만 결과는 SGE 칩의 매개 변수와 아가 로스 겔의 농도를 최적화하여 향상시킬 수 있습니다. 또한 프리 캐스트 젤을 칩에 사용하는 경우 전체 SGE 프로세스는 10 분 이상 걸리지 않습니다.
칩의 채널 폭이 변경되면 DNA 사다리의 분리 성능이 크게 달라집니다. 예를 들어 1,000-bp DNA 사다리가 분리되면 DNA 밴드가채널 너비가 작습니다. 이것은 아마 아가로 오스 젤의 주울 ...
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공개 사항
이해 충돌이 선언되지 않습니다.
감사의 글
우리는 중국 국립 자연 과학 재단 (No 21205078)과 중국 고등 교육 박사 과정 프로그램 (No.20123120110002)의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 중국의 국가 핵심 연구 및 개발 프로그램 (2016YFB1102303), 중국의 국가 기본 연구 프로그램 (973 프로그램 2015CB352001) 및 중국 자연 과학 재단 (61378060)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10&번; TBE | 베이징 솔라바이오 사이언스 & 공급자:Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA 사다리 | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100bp DNA 사다리 | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1kbp DNA 사다리 | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | 타카라 바이오 Inc. | 5760A | |
| 아가로스 | 시그마-알드리치 기업 | V900510 |
참고문헌
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
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