인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

요약

이 원고는 타우 hyperphosphorylation, 타우에 바인딩 microtubules, 및 약물 치료에 따라 세포내의 지역화를 측정을 측정 하기 위한 표준 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 약물 또는 다른 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩 대상 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다.

초록

Microtubule 관련 단백질 타우 주로 축 삭에서 localizes 신경 단백질 이다. 일반적으로 타우 그것은 microtubule 어셈블리 및 안정화에 관여 하기 때문에 정상적인 신경 기능을 위해 필수적 이다.입니다. 뉴런, 게다가 타우 인간 유 방, 전립선, 위, 대 장, 췌 장의 암 거의 비슷한 구조를 보여줍니다 하 고 신경 타우로 유사한 기능을 발휘 하는 있는으로 표현 된다. 타우와의 인 산화의 금액 microtubules, 안정제로 서의 기능을 변경 하 고 다른 신경 퇴행 성 질환, 알 츠 하이 머 병 등에서 쌍을 이루는 나선형 필 라 멘 트의 발전으로 이어질 수 있습니다. 타우와 microtubule 바인딩 특성의 인 산화 상태를 결정 하는 것이 중요 합니다. 또한, 검사의 세포내 지역화 다른 질병에서 중요 하다. 이 원고 내용 표준 프로토콜 타우 인 산화 및 대 장 암 세포 또는 curcumin와 LiCl 치료 없이 microtubules 타우 바인딩을 측정. 이러한 치료는 암 세포 증식 및 개발을 중지 사용할 수 있습니다. 세포내 지역화의 낮은 양의 항 체를 사용 하는 동안 immunohistochemistry 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 검사 합니다. 이 분석 실험 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩에 영향을 주는 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다. 다른 tauopathies에 대 한 새로운 치료제 사용 또는 관련된 항 암 에이전트 나타낼 수 있다 잠재적으로 이러한 프로토콜을 사용 하 여.

서론

타우 원래 공동 tubulin¹순화 했다 열 안정 microtubule 관련 단백질으로 확인 되었다. 타우는 높은 진핵생물^2,,34에 독점적으로 표현 된다. 주요 기능 microtubule 어셈블리^1,,56을 제어 하는 것입니다. 그것은 또한 합 microtubules⁷, axonal 전송⁸, axonal 직경⁹에 변화, 싱 경종 극성과 neurodegeneration¹⁰의 형성에 기여 한다. 타우는 또한 일부 신호 경로 제어 하는 단백질 비 계 역할을 합니다. 쥐 뇌 연구 제안 그 타우는 신경 및 그것은 주로 축 삭¹¹에서 localizes. 타우 중앙 신경; axonal 개발에 중요 한 역할을 가상 했다 타우 microtubule 중 합 및 신경 발달에 필수적 이므로, 이 가설이 나중에 이었다 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험에 의해 확인. 신경, 외에도 타우 다른 비 신경 세포, 간, 신장 및 근육 세포^12,13를 포함 하 여 표현 됩니다. 타우는 표현 또한 인간의 유 방, 전립선, 대 장, 위, 및 췌장암 세포 라인 조직^{14,15,16,17,18, 19}. 타우 또한 포함 시체²⁰꼬인된 tubulofilaments로 포함-몸 근육에서 발견.

타우는 몇 가지 포스트 번역 상 수정을 있습니다. 모든 포스트 번역 상 수정의 인 산화는 가장 일반적입니다. 증가 타우 인 산화 microtubules, 마지막으로 골격을 불안정에 대 한 선호도 감소 합니다. 85 인 산화 사이트 타우 단백질 Alzheimer의 질병이 인간의 뇌 조직에서 분리에 설명 했습니다. 이 사이트의 53% 구성 떠들고, 41% 트레오닌, 유일한 6% 티로신 잔류물^21,,2223입니다. 타우 인 산화의 현지화, 기능, 바인딩, 가용성, 및 다른 포스트 번역 상 수정에의 민감성에 영향을 줍니다. 정상 범위 보다도 타우 인 산화 (또는 인산 염 그룹으로 채도가) 알 츠 하이 머 병²⁴의 구조 및 기능적인 특성을 복제 하는 hyperphosphorylation로 알려져 있다. 타우 axonal microtubules의 적절 한 작동 하 고 생리 적 조건 하에서 정상적인 신경 기능을 보장 합니다. 그러나, hyperphosphorylated 타우 microtubule 해체 때문에 신경 손실의 원인이 조직적된 microtubule 바인딩을 유지 하기 위해 실패 합니다. 타우 인 산화의 정상 수준 기능, 적절 한 타우 필요 하지만 타우의 특성 인 산화 수준을 변경 하는 경우 및 경우 hyperphosphorylated²⁵정상적으로 작동 하는 데 실패. Alzheimer의 질병 그리고 다른 나이 관련 된 신경 장애, 타우 hyperphosphorylated 되 고 형성 하는 대응된 나선형 필 라 멘 트 및 neurofibrillary tangles^26,27. 따라서, 타우 인 산화 및 microtubule 바인딩 결정 하는 방법 중요 하다.

대 장 암, 암, 노화 관련 된 세 번째는 가장 자주 암과 세 번째 눈에 띄는 죽음을 일으키는 남성, 여성 모두²⁸암 진단 이다. 대 장 암 서방 세계²⁹주요 사망 원인 암 중 하나입니다. 대 장 암과 Alzheimer의 질병 노화와 관련 된 둘 다 사람들이 비슷한 식습관을 즐길 있는 선진국에서 주로 발생 하기 때문에, 두 질병 어떻게든 상관 될 수 있습니다. 또한, 타우 양수와 음수가 타우 암 세포는 화학요법 대리인, 예를 들면, paclitaxel¹⁶에 다르게 응답.

Curcumin은 longa 되더라도, 인도 향미료 심 황³⁰의 주요 파생 상품 중 하나입니다. 수세기 동안, 남쪽 아시아 인구는 매일 그들의 규정식에 있는 심 황을 소모 하 고. Curcumin는 대 장 암, Alzheimer의 질병, 당뇨병, 낭 성 섬유 증, 염증 성 장 질환, 관절염, 혈, 동맥 경화 증 및 허 혈 성 심장 질환^31, 등 다른 질병을 치료 하는 데 사용 됩니다. ^{32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38}. 리튬 또한 대 장 암 세포를 죽 일 수 있다 또는³⁹그들의 확산 방지. Alzheimer의 질병⁴⁰ 타우 집계를 감소 하 고 유전자 변형 마우스 모델^{41,,4243에 관측 된 그것의 hyperphosphorylation를 방지 치료를 위한 리튬을 사용하실 수 있습니다. 44}.

이 원고를 목표로: 1) 총 타우 및 치료 세포; 인 타우 식 레벨 측정 2) 측정 전체 타우 인 산화; 인산 가수분해 효소 분석 결과 설명 3) 검사의; microtubule 바인딩 그리고 4) 타우 confocal 현미경 검사 법 대 장 암 세포 라인 curcumin와 LiCl 치료 하 여 지역화. 결과 curcumin와 세포 치료, 대 장 암에 대 한 일 걸 요 좋은 화학요법 에이전트 그리고 LiCl 치료 두 총의 식을 줄일 수 있으며, 대 장 암 세포 라인에 타우 phosphorylated 공개. 이러한 치료의 핵 전 좌를 발생할 수 있습니다. 그러나, 예기치 않게, curcumin microtubules에의 바인딩 개선 실패 합니다.

프로토콜

1. 시 약의 준비

프로 테아 제 억제 물 칵테일 솔루션,

1. 추가 10 µ L (1 mM) phenylmethylsulfonyl 불 소 솔루션, 10의 µ L (1 x 100 x 사진에서)와 인산 가수분해 효소의 10 µ L (1 x 100 x 사진에서) 완전 한 RIPA 세포의 용 해 버퍼 준비 1 x radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼의 1 mL에 억제 물 칵테일 솔루션.
2. 준비 10 일반 tubulin 버퍼 (PEM) 버퍼 x.
   1. 추가 800 mM (6.0474 g) piperazine-N-N '-두번째-2-ethanesulfonic 산, 10 m m (95.1 mg) 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic 산, 10 m m (51 mg) MgCl ₂ 및 50 mL 튜브에 1.25 M (10 M 3 mL) NaOH 15 mL 증 류 물으로 혼합 하 고 소용돌이 사용 하 여 해산. PH (6.9 이어야 한다)을 확인 합니다. 만약 pH > 6.9, 버퍼를 삭제 하 고 신선한 많은 리 메이크.
      참고: NaOH를 pH 6.9 오버 슈트 하지 않습니다 보장 하기 위해 1.25 M 미만 이어야 합니다. HCl을 사용 하 여 pH를 조정 하는 권고 하지 않습니다 > 6.9.
   2. 추가 NaOH pH 6.9까지에 dropwise입니다. 증류수 10 X PEM 버퍼의 최대 25 mL을 추가 합니다. 마지막으로, 주사기와 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 필터링 합니다. 1.5 mL 튜브에 aliquots로이 버퍼를 분할 하 고 저장 4 ° c.
3. 준비 5 환 원제와 염료 샘플 버퍼 x. 1의
   1. 믹스 300 µ L (60 밀리미터) M Tris-HCl (pH 6.8), 50% 글리세롤, 10% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 및 1.2 mL 증 류 물 1 mL (2%)의 2.5 mL (25%) SDS 샘플 버퍼 x 5의 5 mL을 만들기 위해. 에 저장 − 20 ° c.
      참고: 글리세롤 점성 때문에 1.25 mL 측정 글리세롤이 어렵습니다. 100% 글리세롤의 1 mL 1.26 g 무게. 따라서, 100% 글리세롤의 1.575 g의 무게 (는 100%의 1.25 mL 같음 또는 50% 글리세롤의 2.5 mL) 15 mL 튜브. 다른 구성 요소와 잘 혼합.

2. 세포 문화, Curcumin와 치료 또는 LiCl 치료 및 검사의 단백질 표정

1. 추가 1 ~ 10 ⁶ HCT 116 셀 x 100 m m로 조직 문화 요리는 최소 필수 미디어 (MEM) 10% 태아 소 보충 혈 청 (FBS) 그리고 1% 페니실린-스. 경작의 어느 날, 후 셀 60-70%의 합류를 도달할 것 이다.
   참고: 필요한 격판덮개의 수는 아래에서 설명 하는 치료의 수에 따라 다릅니다.
2. 셀 ~ 65% 합류 (현미경 검사 법을 사용 하 여 접근)에 도달, MEM 보완 매체를 제거 하 고 혈 청 무료 메모리와 5 µ M, 10 µ M, 그리고 30 µ M curcumin 또는 25 m m, 50mm, 100mm LiCl 추가 하는 때. 포함 된 5% CO ₂ 습도 분위기에서 24 h 동안 37 ° C에서 품 어.
3. 치료 후 24 h 1 mL 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 셀 세척 하 고 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 다쳤어요. 1.5 mL로 긁힌 것된 셀 튜브 원심과 1800 x g 세포 알갱이를 4 ° C에서 4 분 동안 원심 전송.
4. 는 정기적으로 튜브를 도청 하는 동안 20 분에 4 ° C에서 완전 한 RIPA 버퍼의 100 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 여 세포를 lyse. 간단히 샘플을 sonicate.
5. 4 시 20 분에 대 한 22,570 x g에서 벤치탑 원심 분리기에 셀 homogenates 원심 ° c.를 피 펫을 사용 하 여 다른 레이블된 튜브는 supernatants 전송.
6. 상업 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여 Bradford 분석 결과 ⁴⁵는 supernatants의 단백질 농도 측정.
7. 4 세포 lysates의 동일한 단백질 농도 (10 µ g 단백질/13 µ L 샘플)의 준비 샘플 X SDS 겔-로딩 버퍼입니다. 4 x 400 m m dithiothreitol (DTT) 포함 된 신선한 SDS 겔-로딩 버퍼 준비.
   참고:이 단계에서 샘플에 저장 될 수 − 필요한 경우 20 ° C.
8. 품 5 분 100 ° C에서 열 블록에 샘플 소용돌이 사용 하 여 샘플을 혼합 하 고 10 ~ 15에 대 한 그들을 기다리는 분
9. 어셈블 전기 시스템입니다.
   1. 부하 10 µ g 단백질 (13 µ L 샘플) 10% SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 대 한에 잘 당. 로드 한 차선에 젤에 분자 무게 사다리.
      참고: 전기 시작, 단백질 사다리의 명백한 분자 무게 단백질 밴드에 해결 됩니다. 이 밴드를 사용 하 여 알 수 없는 단백질 밴드의 분자 무게를 예측할.
   2. 샘플을 로드 한 후 일정 한 전압을 유지 하기 위해 전원에 전기 시스템의 긍정 및 부정적인 전극 연결. 처음, 해결 젤으로 겹쳐 쌓이는 젤에서 단백질 견본 이동 70 V 20 분에 시작 합니다. 그런 다음, 샘플 및 단백질 사다리 젤의 끝에 도달할 때까지 약 70-120 분 125 V로 전압을 증가.
   3. 젖은 electroblotting 시스템을 사용 하 여 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 젤 전기 이동 법의 완성 후 전송. 전송 블록 대 100 ~ 100 분 약 25의 상 온에서 90 분 동안 4% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 블로킹 버퍼에 막 ° c.
10. 분자 무게 사다리 옆에 그것을 절단 하 여 오 점 표시. 투명 한 플라스틱 시트와 날카로운 커터를 사용 하 여 절단 오 점. (1:5, 000에서 안티 타우, 안티-인-타우 1:4, 000에서) 1 차 항 체 솔루션을 준비 하 고 하룻밤 4 ° C에서이 솔루션에 오를 품 어.
11. 하룻밤 부 화 후 7 분 오 점 4 번에에서 씻어 인산 염 버퍼 식 염 수-트윈-20 (PBST) 솔루션.
12. 관련 2 차 항 체 솔루션 (염소 안티 토끼 또는 반대로 마우스 IgG 1:5, 000에서), 준비 하 고 4 시간, 7 분 PBST에 약 25 ° C. 세척의 실 온에서 90 분 동안이 솔루션에서 얼룩을 품 어.
13. 개발 제조 업체에 따르면 화학 키트를 사용 하 여 오 ' s 권고. 투명 한 비닐 포장을 사용 하 여 얼룩을 커버. 이미징 시스템 관련 소프트웨어와 화학을 위한 화학에 의해 이미지를 수집.

3. 인산 가수분해 효소 분석 결과

1. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼에 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 (2.5 단계)에서 세포 lysates 치료.
   1. 모두 제어 및 치료 샘플, 준비 20 µ L 포함 20 µ g 총 단백질을 샘플링 합니다. 20 µ g 총 단백질, 2 µ L 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼 및 10 µ L 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 포함 하는 세포 lysates의 볼륨을 추가 합니다. 증류수 20 µ L을 만들기 위해 추가.
2. 1 h. 50 m m의 최종 농도에 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 추가 하 여 또는 10 m m의 최종 농도에 나트륨 orthovanadate (나 ₃ VO ₄) 추가 하 여 반응을 중지에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어. 반응 5 분에 75 ° C에 난방에 의해 중지 됩니다 수
3. 인산 가수분해 효소와 부 화 완료, 전에 인산 가수분해 효소 처리 샘플 비교에 대 한 인산 가수분해 효소를 추가 하지 않고 같은 농도의 샘플을 준비.
4. 추가 갓된 4 X SDS 겔-로딩 버퍼 400mm DTT를 포함.
5. 는 소용돌이 사용 하 여 샘플 5 분 믹스 100 ° C에서 열 블록에 샘플을 품 어. 멋진 대 한 실 온에서 ~ 10-15 분
6. SDS 페이지 10 %polyacrylamide 젤을 실행 하기 위한 전기 영동 시스템 조립.
   1. 10 %polyacry 잘 당 부하 10 µ g 단백질 (13 µ L 샘플)lamide 젤입니다. 분자 무게 사다리 로드.
   2. 샘플을 로드 한 후 일정 한 전압을 유지 하기 위해 전원에 전기 시스템의 긍정 및 부정적인 전극 연결. 처음, 해결 젤으로 겹쳐 쌓이는 젤에서 단백질 견본 이동 70 V 20 분에 시작 합니다. 그런 다음 125 V로 전압을 증가 하 고 약 70-120 분 젤 샘플 및 단백질 사다리 젤의 끝에 도달할 때까지 실행.
   3. 전송 젖은 electroblotting 시스템을 사용 하 여 PVDF 막에 젤 전기 이동 법의 완성 후. 대 100 ~ 100 분에 대 한 전송
   4. 분자 무게 사다리에 잘라 작은 함으로써 오 점을 표시 합니다. 투명 한 플라스틱 시트와 날카로운 커터를 사용 하 여 오 점 절단.
7. 실 온에서 90 분 동안 4 %BSA 블로킹 버퍼에 막 차단.
8. 하룻밤 4 ° C에서 1 차 항 체 용액 (1:5, 000에서 안티 타우)에 오를 품 어. 7 분 PBST에 오 점 4 번 씻어.
9. 관련 2 차 항 체 솔루션 (염소 반대로 마우스 IgG 1:5, 000에서), 준비 하 고 실 온에서 90 분 동안 오를 품 어. PBST에 4 시간, 7 분 세척.
10. 개발 제조 업체에 따르면 화학 키트를 사용 하 여 오 ' s 권고. 투명 한 플라스틱 포장 내 오 점 커버. 이미징 시스템 관련 소프트웨어와 화학을 위한 화학에 의해 이미지를 수집.

4. Microtubule 바인딩 분석 결과

1. microtubule 바인딩 분석 결과 대 한 단계를 반복 2.1 2.6.
2. 준비 1 (2 mL) PEM 10 X PEM 버퍼에서 버퍼 X 4 ° C에서 20 µ M (40 µ L) paclitaxel 1 m m (20 µ L) GTP를 추가 하 여 저장. 박을 microtubule (MT)에서 − 80 ° C 냉동 고에서 대장균 타우 작업 재고 − 20 ° C 냉장고.
3. 표 1에 의하여 샘플 준비.
4. 100000 x g에서 60 분 동안 25 ° C에서 30 분 Ultracentrifuge에 대 한 37 ° C에서 품 어.
5. 전송 120 µ L 포함 supernatants의 언바운드 타우, 청소 하 고 튜브.
6. 5 X의 추가 120 µ L (상쾌한와 동일한 볼륨) 버퍼를 포함 하는 바인딩된 타우 펠 릿을 시음 하 고 철저 하 게 혼합. 레이블이 지정 된 튜브를 청소 하 여 철저 하 게 혼합 솔루션 전송.
7. 단백질 농도 측정 (단계 2.6 참조).
   참고: 샘플을 준비 하는 동안 사용 하 여 솔루션 (단계 4.6)의 볼륨 펠 릿과 상쾌한 샘플 준비.
8. 해당 단백질 농도의 샘플을 준비 하 고 갓된 4 SDS 겔-로딩 버퍼 DTT (400mm)를 포함 된 배 추가.
   참고: 샘플에 저장 될 수 있다 −이 단계에서 20 ° C.
9. 3.5-3.10 단계 반복.

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샘플	이름		Microtubule 필요		주요 단백질 필요		PEM-GTP-PTX
1	HCT 116-제어 (6.21 μ g/μ)		2 μ		9.66 μ (60 μ g)		108.34 μ
2	HCT 116-Curcumin 10 μ M (4.81 μ g/μ)		2 μ		16.63 μ (80 μ g)		101.37 μ
3	HCT 116-Curcumin 20 μ M (3.28 μ g/μ)		2 μ		30.49 μ (100 μ g)		87.51 μ
4	HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μ g/μ)		2 μ		18.42 μ (100 μ g)		99.58 μ
5	대장균 타우		2 μ		1 μ 타우-352		117 μ
6	MT만		2 μ		X		118 μ
					120 μ

표 1: 샘플 microtubule 바인딩 분석 결과 대 한 준비.

5. 지역화 및 Curcumin와 세포 치료 후 타우 식

1. coverslip 70% 에탄올을 사용 하 여 깨끗 하 고 건조 한 실험실 티슈를 사용 하 여. 단일 coverslip 레이블이 6 잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 삽입 합니다. 접시에 생물 안전 캐비닛 놓고 적어도 3 h. 위해 자외선에 전환
2. Subculture 셀 10 ⁵ 셀/잘 권장된 문화 매체에서 x 2.5에서 씨앗 6 잘 플레이트의 관련 웰 스도 하는 고.
3. ~ 24 h 후 세포질 형태학 변화에 대 한 확인을 10 배 및 40 X 목표를 사용 하 여 거꾸로 현미경을 사용 하 여 셀을 검사. 필요한 경우 사진 기록.
4. 는 PBS를 사용 하 여 두 번 셀 린스. 어둠 속에서 37 ° C 배양 기에서 3.7% 포름알데히드에 셀 수정.
   참고: 실 온에서 포 름 알 데히드에 의해 고정 잘 작동, 너무 합니다. 포 름 알 데히드를 처리할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용.
5. 씻어 PBS에 셀. 셀에 얼음 처럼 차가운 메탄올에 수정 − 15 분 동안 20 ° C는 세포를 Permeabilize 0.1%와 3 %BSA 그들을 배양 하 여 10 분에 대 한 얼음에 PBS에 Triton X-100 PBS로 세포 세척.
6. 블로킹 버퍼에 셀을 품 어 (0.1%와 3% BSA PBS 솔루션에서 트윈-20) 실 온에서 1 h.
   참고: 4 ° C에서 2 시간에 대 한 보육 작용도.
7. 3 %BSA 0.1%에서 1 차 항 체 (1: 200에서 안티 타우) 솔루션 준비 PBS (예를 들어, 0.4 mL 버퍼에서 2 µ L 타우-13 항 체)에 트윈 20.
8. 는 PVDF의 작은 조각을 잘라 막 조각; 6 잘 플레이트의 각 잘 제대로 맞게 되도록 물에 담가 5 분 장소에 대 한 각 잘에서 컷 PVDF.
9. 추가 60 µ L 컷을 1 차적인 항 체 솔루션의 PVDF 조각에 각 잘. 장소는 coverslips 셀 주 항 체 솔루션을 만질 수 있는 그런. 어두운, 습 한 챔버에 4 ° C에서 밤새 품 어. PBS에서 4 번 씻어.
10. 준비 3 %BSA 0.1%에서 이차 항 체 솔루션 (fluorescein 활용 594 반대로 마우스 IgG 1:400에) PBS에 트윈 20.
11. 조각과 6 잘 플레이트의 각 음을 제대로 맞게 각 잘에서 컷 PVDF 5 분 장소에 대 한 물에 담가 있도록 PVDF 막의 작은 조각을 잘라.
12. 6 잘 플레이트에 PVDF 조각의 각 이차 항 체 솔루션의 추가 80 µ L. 장소는 coverslip 셀 2 차 항 체 솔루션을 만질 수 있는 그런. 4 번 2 h. PBS로 세척에 대 한 실 온에서 어두운, 습 한 챔버에 품 어.
13. 샘플 4 장착 매체에 마운트 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 고 수정 유리 슬라이드에 coverslips. 유리 슬라이드에 DAPI와 장착 매체의
    1. 하나 추가 드롭. 각 우물에서는 coverslips를 제거 하 고 DAPI와 설치 매체를 포함 하는 유리 슬라이드에 그들을 배치. 얼룩진된 셀을 포함 하는 각 coverslip의 표면에서 모은 접촉 확인해당 유리 슬라이드에 팅 매체.
    2. 적용 폴란드어 밀봉 하 고 그들을 수정 각 coverslip 주위 밀폐 유리 슬라이드에 손톱. 필요한 경우이 단계를 두 번 수행.
14. 어두운 약 실에 있는 실내 온도에 1.5 h에 대 한 품.
15. 검사 confocal 현미경을 사용 하 여 어두운 방에 coverslip에 침수 석유를 사용 하 여 슬라이드.

결과

식 총 타우와 인 타우의 curcumin 또는 LiCl (그림 1)의 다른 농도와 세포 치료 후 시험 되었다. Curcumin의 3 개의 다른 농도와 세포의 치료 감소 타우 식 수준; 그러나, 인 타우 식 치료 curcumin의 낮은 농도 따라 증가 하지만 높은 curcumin 농도와 세포 치료 시 감소. 안티-인-타우 (Ser396) 인 타우의 탐지를 위해 사용 되었다. 총 타우와 인 타우 LiCl (그림 1)의 세 가지 다른 농도와 세포의 치료 시 감소합니다. 이전 연구는 타우 식 수준 다 다른 암 종류에와 같은 암 종류의 서로 다른 사이트에 표시 했다. 대 장 암에 이전 데이터는 타우 두 셀 라인 (HCT 116와 SW480) 대 장 암 또한 phosphorylated¹⁹했다 표현 했다 보여주었다. 5 µ M curc...

토론

이 원고 총 타우 감지에 대 한 서로 다른 절차 조건 고 대 장 암 세포 치료 curcumin와 LiCl 타우 phosphorylated. 단백질 견본에서의 전반적인 인 산화 상태를 평가 하기 위해 인산 가수분해 효소 분석 결과 설명 했다. 이 분석 결과 잠재적으로 어떤 단백질의 인 산화 상태 검사를 사용할 수 있습니다.

이 분석 결과 phosphorylated 단백질 이동 비 phosphorylated 상태로 보다 원칙을 기반으로 합니다. 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼는이 프로토콜에 사용 됩니다. 세포 lysates를 분석 결과 구성 요소를 추가한 후 샘플 특정 온도에서 특정 최적의 기간 동안 incubated 한다. 부 화, 후 샘플 반응을 중지 SDS 샘플 버퍼에 비등 한다. 이전에 다른 실험 프로토콜 microtubules에 타우의 바인딩을 평가 하기 위해 사용 되었습니다 수 있습니다. 여기에 제시 된 microtubule 바인딩 분석...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HCT 116 세포	ATCC	CCL-247
MEM (EBSS)	Hyclone	SH30024.01
소 태아 혈청 (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	-20 °에서 저장; C
페니실린-스트렙토마이신	하이클론	SV30010
트립신-EDTA 용액	WelGene	LS 015-01
100mm 접시	Corning	430161
6 웰 플레이트	Corning	Coster 3516
Anti-Tau 13 항체	abcam	ab19030
Dithiothreitol (DTT)	Roche	10 708 984 001	저장 온도 2– 8 > C
마이크로리터 원심분리기	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T1912	저장 온도 2– 8 > C
Curcumin	Sigma-Aldrich (Fluka)	78246	저장 온도 2– 8 > C
미세소관 (MT)	세포골격	MT001	4 °에 저장; C (건조)
Vector Laboratories	H-1200	을 사용한 장착 매체	4 °C에 저장; 어둠 속의 C
수산화나트륨	시그마	72068
염화마그네슘	시그마-알드리치	M2670
GTP	시그마-알드리치	G8877	-20 °에 저장; C
DPBS	WelGene	LB 001-02
Sonic Dismembrator	Fisher Scientific	Model 500
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
PIPES	Sigma	P1851
소 혈청 알부민(BSA)	Sigma	A7906
분자 이미저	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	4 °에 저장; C
단백질 분석 염료 시약	Bio-Rad	500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb	Cell signalling	2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb	Cell signalling	2118
Anti-Tau (phospho S396) 항체	abcam	ab109390
EGTA	Sigma	E3889	실온
에서 보관FastAP Thermo Sensitive Alkaline Phosphatase	Thermo Scientific	EF0651	-20°C에서 보관; C
PMSF	Sigma	P7626	실온에서 보관
인산가수분해효소 억제제 칵테일	세포 신호 전달	5870	4°C에서 보관; C
프로테아제 억제제 칵테일	세포 신호	5871	4 °에 저장; C
RIPA 버퍼	시그마	R 0278	저장 온도 2– 8 > C
Tau-352 인간	시그마	T 9950	-20 °에 저장; C
트리톤 X-100	시그마-알드리치	X - 100	약 25°C에 저장; C
PVDF 멤브레인	Bio-Rad	162-0177
염소 안티 마우스 IgG 2차 항체	ThermoFisher	A-11005	4°C에 저장; C 어둠 속에서
컨포칼 현미경 라이	카 마이크로 시스템	라이카 TCS SP5
나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)	Affymetrix	75819
단백질 분석	Bio-Rad	500-0006	4 °에 저장; 씨