방법 논문

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

DOI:

10.3791/55936

⸱

2018년 1월 1일

 ,  ,  , 
1The Institutes of Brain Science, the State Key Laboratory of Medical Neurobiology, the Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜 산소 수준 재활용된 버퍼의 작은 볼륨과 침수 급성 hippocampal 조각 활동 종속 시 냅 스가 소성 녹음의 방법 론 적 측면에서의 안정화를 설명 합니다.

초록

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비록 뇌 조각에 실험 1951 년부터 사용 되었습니다, 문제는 필드 잠재적인 또는 세포내 녹음을 수행할 때 시 냅 시스 전송의 조음의 안정적이 고 성공적인 분석을 달성의 가능성을 감소 시키는 남아 있다. 이 원고는 상용 침수 챔버에 필드 흥분 성의 postsynaptic 잠재력 기록에 대 한 급성 뇌 조각의 유지 보수에 대 한 실험 조건 개선에 도움이 될 수 있는 방법론 기능을 설명 합니다. 와 유출 carbogenation 단위. 유출 carbogenation 약물 실험의 비용 효율성을 향상 시키기 위해 작은 버퍼 저수지의 재활용에 의존 하는 실험에서 산소 수준 안정화에 도움이 됩니다. 또한, 원고는 시 냅 시스 전송의 활동-종속 시 냅 스가 소성에 다른 carbogenation 모드와 자극 패러다임의 효과 검사 하는 대표적인 실험을 선물 한다.

서론

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1951 년에 처음 보고 급성 뇌 조각 실험 실시1했다. Piriform 피2,3 , hippocampal 신경 해 마4, 중 septotemporal 축 transversely 상호는 발견에서 성공적인 생체 외에서 녹음 후 1971 년에는 첫 체 외에 녹음 hippocampal 신경 활동의 달성된5이었다. Vivo에서 그리고 생체 외에서 조건 하에서 뉴런의 신경 생리학 또는 neurostructural 매개 변수의 유사성은 여전히6의 일부 토론 주제 하지만 1975 년에, Schwartzkroin7 표시는 기저 뉴런의 속성은 체 외에서 고 hippocampal 형성에 afferents의 그 높은-주파수 자극 (즉, tetanization)의 시 냅 스 전위8오랫동안 촉진 유도. 신경 활동의 기록 electrophysiological 생체 외에서 크게 확장 활동-종속 시 냅 스가 소성9,10, 블 리스에 의해 1973 년에 발견 했다 세포 메커니즘의 연구 외. 11 vivo에서 토끼로 실험.

신호 경로 뇌 조각, 그리고 급성 hippocampal 조각, 특히 신경 활동의 연구는 이제 표준 도구입니다. 그러나, 의외로, 실험 체 외에 는 아직 표준화 될 준비 및 급성 hippocampal 조각의 유지 보수에 대 한 여전히 존재 하는 여러 방법에 의해 입증. 리드 외. (1988) 12 조각 챔버의 다른 유형과 매체, pH, 온도 및 산소 레벨 목욕의 선택에 급성 뇌 조각의 유지 보수에 대 한 방법론 문제 검토. 이러한 매개 변수는 여전히 조각-녹음 설정 생체 외에서 의 맞춤 요소 때문 녹음 실에서 제어 하기 어렵다. 게시는 설명할 수 있습니다. 극복 하는 데 도움이 방법론 도전과 그의 일부 침수 슬라이스 챔버, 중간 3D microperfusion 시스템13, 향상 된 층 류 및 산소 챔버의 새로운 유형을 찾을 수 있습니다. 14, 컴퓨터 온도 제어15, 시스템 및 다중 챔버 녹음 시스템16공급 한다. 이러한 챔버 구축 하기 쉬운 이므로, 대부분의 과학자 들은 상업적으로 사용 가능한 슬라이스 챔버에 의존 합니다. 이 챔버는 전기 생리학 및 형광 이미징17,,1819의 조합에 대 한 되므로 현미경 시스템에 장착할 수 있습니다. 이 약 실은 뇌 조각 인공 척수 (실제)에 빠져들 계속, 버퍼 솔루션의 높은 유량 필요 유지, 약물 응용 프로그램의 비용을 증가 합니다. 이 위해, 우리는 유출-carbogenation 침수 슬라이스 챔버는 상대적으로 작은 실제 볼륨을 사용 하 여 필드 전위의 장기 기록에 대 한 충분 한 안정성을 제공 하는 재활용 관류 시스템을 통합 했습니다. 또한, 우리는이 실험 carbogenation/관류 시스템의 사용 활동-종속 시 냅 스가 소성10 의 결과 미치는 영향 및 진 핵 신장 요인 2 키 니 아 제 (eEF2K)의 억제 시 냅 스 변조 방법 요약 전송20.

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프로토콜

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동물 동물 보호의 설립된 기준 및 뇌 과학 연구소 및 상태 키 실험실의 의학 신경 생물학의 복 단 대학, 상해, 중국의 절차에 따라 유지 되었다.

1. 솔루션 준비

주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.

  1. 조각화 버퍼 (수정된 Gey 솔루션) 준비: 92 m m NaCl, 2.5 m m KCl, 1.25 m m NaH2포4, 30 mM NaHCO3, 25 mM 포도 당, 20 mM HEPES, 3mm 나+-pyruvate, 10mm MgSO4및 0.5 m m CaCl2.
  2. Carbogenation 없이 1 M NaOH를 사용 하 여 7.6에 pH를 조정 합니다.
  3. 4 ° c.에 버퍼 저장
    참고: 적정 흐린 액체를 명확히. osmolality 305-310 mOsm입니다. Carbogen21 5% 이산화탄소와 95% 산소를 포함합니다.
  4. 실제의 최종 조성 주는 중 탄산염과 포도 당을 포함 하지 않는 실제의 재고 솔루션 x 10를 diluting 하 여 준비: 124 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 2.5 m m CaCl2, 2 mM MgCl2및 1.25 m m KH2포4.
  5. 중 탄산염 및 10 mM 포도 당 및 26 m m NaHCO3에 도달 하는 포도 추가 합니다.
  6. Carbogenate NaHCO3를 추가한 후 즉시 차단 엔드와 천공된 실리콘 튜브를 통해 실제.
  7. Carbogenating (pH 7.3-7.4) 동안 pH를 측정 합니다.
    참고: 버퍼 용량 NaHCO3의 금액을 변경 하 여 약간 조정할 수 있습니다. 결과 pH 온도 의존 하는 때문에, 그것은 작동 온도 (예, 30 ° C)에서 carbogenating 동안 결과 pH를 확인 하는 데 필요한.

2입니다. 급성 Hippocampal 조각의 준비

주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.

  1. 급성 뇌 조각에 대 한 보육 챔버를 슬라이스 잡고 메쉬 장소, 실제, 및 carbogenate (4-6 L/h) 적어도 30 분22 28-30 ° c.에 대 한 챔버를 채우기
  2. 2-4 ° c.까지 수술 도구 쿨
  3. 감기와 carbogenated 버퍼 (2-4 ° C), 유지 하는 vibratome 근처 얼음/물 혼합물을 깔 끔 히 가득 유리 비 커를 놓습니다.
  4. 각 막 반사 (30-50 s) 사라질 때까지 쥐 또는 쥐를 anesthetize 2 L 유리 용기 또는 50 mL 튜브에 12.5 µ L에 500 µ L를 취하여 isoflurane를 사용 하 여.
  5. 설명 및 매 티 스 외 의 간행물에 자세히 시각화 방법을 사용 하 여 뇌를 분리 (2011 년) 23 , Yuanxiang 외. (2014) 24.
  6. 2-4 ° c 뇌 소 뇌를 해 부하 고 반구를 분리 하기 전에 (적어도 2 분)에 대 한 차가운 조각화 버퍼에 멋진.
  7. 차가운 수술 블레이드를 사용 하 여 그림 1C 는 복 부와 해 마의 중간 부분에서 가로 분할 영역을 각 반구25 의 등 쪽 가장자리를 따라 70 ° 각도로 지 피 조각 해 부 그리고 E.
  8. 감기 치과 시멘트 주걱으로 짧게 만든된 표면 (1-2 s) 건조 필터 종이의 조각에 반구를 전송.
  9. 갓 잘라 표면 두 반구 빠른 연기 접착제 접착제;를 사용 하 여 차가운 조각화 플랫폼에 탑재 반구 면 면도날 (그림 1D)의 꼬리 끝을 있다.
  10. vibratome의 냉각 챔버도 조각화 플랫폼을 놓고 조각화 버퍼 (2-4 ° C)와 그 챔버를 입력 합니다. Carbogenate 구멍된 실리콘 튜브를 사용 하 여입니다.
  11. 적절 한 vibratome 설정을 사용 하 여 350 µ m 조각 잘라 (예를 들어, 블레이드 앞으로 속도: 1.2 m m/s, 블레이드 진폭: 1mm).
  12. 분리는 subiculum를 사용 하 여 두 개의 주입 뉼 entorhinal 외피가 hippocampal 형성 (> 28 G)가 위로.
  13. 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 이전 준비 보육 상공의 슬라이스 잡고 메쉬에서 거품을 제거 합니다.
  14. 인큐베이션 챔버의 메쉬에 조각화 플랫폼에서 지층 pyramidale에서 몇 가지 투명도 있는 분할 영역을 전송 합니다. 모든 폴딩, 스트레칭, 중복, 및 큰 입 파스퇴르 피 펫으로 실제와 슬라이스를 발음에 의해 부동 하지 마십시오.
    참고: 모든 절차 (단계 2.5-2.14) 5-10 분; 걸릴 수 있습니다. 따라서, 그것은 4 ° c.에 그것을 유지 하는 시간이 지남에 따라 버퍼 솔루션의 온도 확인 하는 것이 중요
  15. 보육 실에서 적어도 1.5-2 h 30 ° C에서 슬라이스를 품 어 고 carbogen 4-6 L/h에서 제공 합니다.
    참고: 버퍼는 인큐베이터에 순환 하지만 부동에서 슬라이스를 방지 carbogen의 유량을 조정 합니다.

3. 수정은 실제에 대 한 Carbogenation의 작은 저수지의 재활용

  1. 재활용 시스템 (그림 2B)의 유출에 3 방향 튜브 커넥터를 추가 합니다.
  2. Carbogen 공급 튜브 3 방향 튜브 커넥터의 가운데 팔을 연결 하 고 공기 흐름 미터 (3-4 L/h,D 그림 2및 그림 4C) 유량을 조절.
  3. 재활용 시스템의 유입에 두 번째 3-방향 튜브 커넥터를 추가 합니다. 중간 팔 (로우-패스 필터; 저수지에서 유입 튜브를 인라인 히터, 얇은 실리콘 튜브 (10 ㎝ 길이), 상 완 및 더 낮은 팔을 직면 하는 튜브를 연결 그림 4 C)입니다.
  4. 얇은 실리콘 튜브 튜브 압착 기 장소 (OD: 2mm) 튜브 연동 펌프에 의해 생성 된 조각 챔버에 실제의 맥의 최소한은 한 위치에서.
    참고: 유출-carbogenation (유출-수화물.) 수정 실제 저수지, 재활용 율, 실제의 볼륨을 carbogenation 레벨의 감도 감소 시키고 상대 튜브 작은 실제 저수지 내 위치 (< 50 mL; 그림 3)입니다. 로우-패스 필터에 관한 얇은 실리콘 튜브에 공기의 일정 금액의 실제 흐름; 맥 동 감소 따라서, 튜브 공기도 주로 가득 한다.

4입니다.침수 슬라이스 챔버에 시 냅 스의 응답을 기록

주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.

  1. 미리 따뜻한 물 목욕 약 28-30 ° c (이것은 녹음 실에서 거품 형성 방지)에서 실제 솔루션.
  2. 재활용 시스템 (4-5 mL/min)를 시작 하 고 적어도 1 시간을 위한 시스템을 equilibrate 하 인라인 히터를 활성화.
  3. 렌즈 종이 나일론 메쉬 (그림 4) 몇 분 동안 침수 슬라이스 챔버에 U 자 모양의 백 금 철사에 고정을 청소의 작은 조각을 presoak합니다
  4. U 자 모양의 백 금 철사를 제거 합니다.
  5. 재활용 전환 하 고 종이 청소 하는 렌즈에 슬라이스를 놓습니다.
  6. 즉시 조각 위에 슬라이스 잡고 메쉬, 스위치는 펌프를 놓고 슬라이스는 실제 목적은 찍기에 없이 30 분 동안 equilibrate 하자.
  7. 실제와 붕 micropipette (즉, 녹음 전극)를 작성 (저항 팁: 1-2 m ω, 1/3 실제 가득) 피 펫 홀더에 탑재.
  8. NaHCO3 솔루션으로 그것을 배치 하 여 금속 자극 전극의 절연 제를 확인 (> 40 mM). DC 전압 발생기의 부정 극 전극 연결 (1-2 V, 긍정 극: 은색 또는 백 금 선), 해 부 현미경 아래 끝에 거품의 형성을 관찰 하 고 (> 60 배 확대).
  9. 조작 홀더에서 테스트 에폭시 절연 텅스텐 자극 전극을 놓고 슬라이스 챔버에 전선 참조.
  10. 두 번째 참조 전극 챔버를 추가 하 고 기록 전극(그림 4)의 headstage의 참조 소켓에 연결.
  11. 앰프 제어 소프트웨어에서 "제로 클램프 모드" 상자에서 클릭 하 고 "출력 이득 목록" 상자를 두 번 클릭 하 여 진행 합니다. 이득 선택 "100 년"의 "높은 통과 필터 목록 상자 (베셀)"를 두 번 클릭 "0.1 Hz,"를 선택 하 고 "3로"를 선택 하는 "낮은 패스 필터 목록 상자 (AC)"를 두 번 클릭
  12. 클릭 기록 소프트웨어에는에 "취득 | 프로토콜을 엽니다. " 설정이 자동으로 에피소드 stimulations 고 50-100 ms에 대 한 10-20 kHz에서 증폭 된 잠재력의 디지털화에 대 한 허용 하는 프로토콜의 에피소드 녹화 시작 후 10 ms 자극 아이 솔 레이 터를 트리거를 선택 합니다.
  13. 자극 및 기록 전극 선과 평행한 지층 pyramidale의 예 (그림 4B 및 그림 5)에 배치 합니다.
  14. 클릭 "취득 | "프로토콜 편집 하 고 (팝업 창)에서"트리거"탭을 선택 합니다. 트리거 소스 "트리거 소스" 상자 및 선택 "스페이스 바" 클릭 합니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다. 인수를 시작 하 고 트리거 버튼으로 팝업 창에 "기록" 버튼을 클릭 합니다.
  15. 자극 아이 솔 레이 터 소프트웨어에서 "전압 제어" 상자를 클릭 하 고 "0" 입력 "다운로드" 버튼을 클릭 합니다. "소프트웨어"를 녹음 창에 클릭 하 고 스페이스바를 누릅니다. 입력 하 여 순차적으로 값 1에서 8, 예를 들어 "전압 제어" 상자에서 1 mV 단계에이 주기를 반복 합니다.
  16. FEPSP 경사 값 자극 강도 연관 하 고 최대 fEPSP 슬로프의 40%를 얻을 하는 데 필요한 자극 강도 결정 합니다. "전압 제어 상자"를 클릭 하 고 결정된 된 값을 입력 합니다. "다운로드" 버튼을 클릭 합니다.
    참고: 자극 아이 솔 레이 터는 뇌 조직에 간단한 전압 또는 전류 펄스를 적용 하는 데 사용 됩니다. 복 형 펄스 위상 당 100 µs를 가질 수 있습니다.
  17. 레코딩 소프트웨어에서 정지 버튼을 누른 다음 "취득" 메뉴를 클릭 합니다. "편집 프로토콜"에 클릭 하 고 팝업 창에서 "트리거" 탭을 선택 하십시오. 트리거 소스 트리거 소스 상자 및 선택 "내부 타이머" 클릭 합니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다. 모든 30 필드 전위의 자동 녹음 시작 기록 단추를 클릭 예를 들면 s. 30-60 분 후 "정지" 버튼을 클릭 합니다.
  18. "취득" 메뉴에서 클릭, "개방형 프로토콜," 클릭 시 냅 스가 소성의 원하는 유도 프로토콜을 선택 하 고 "확인" 버튼을 클릭 합니다. 자동으로 활성화-고주파 자극 및 기록에 "기록" 버튼을 클릭 합니다. "정지" 버튼을 클릭 합니다.
    참고: 경우 시 냅 스가 소성에 관한 연구, 적용 장기 potentiation 또는 장기간된 초기 녹음 후 장기 불황에 대 한 표준 유도 패러다임 중 하나. 시 냅 시스 전송의 결과 변조의 대표적인 예는 그림 7 과 그림 8에 묘사 된다.
  19. 레코딩 소프트웨어에서 클릭 "취득 | 프로토콜 "열고 단계 4.12는 동일한 프로토콜을 선택 합니다. "확인" 버튼을 클릭 한 다음 "기록 합니다."를 클릭 자동으로 예를 들면 2-4 h에 대 한 필드 잠재적인 녹음을 실행 하십시오. 녹음을 종료 하려면 "stop" 버튼을 클릭 합니다.
  20. 제약 연구 시 적용 화합물 직접는 실제 저수지 영구 복합 관리 경우 원하는 (그림 6).

5. 청소 설치 및 힌트

참고: 일반 팁에 대 한 아래 참조.

  1. 더 이상 20 분, 이온 H2o. 세척 하 여 다음에 대 한 10% H2O2 를 재활용 하 여 매주 시스템 청소
    참고: 에탄올 청소에 대 한 권장 하지 않습니다. 그것은 마찬가지로 바람직하지 몰입할 참조 전선 및 H2O2에 목표.
  2. 렌즈 또는 0.1 N HCl와 다음 물 약 실 주변의 표면에 침전 된 소금을 제거 합니다.
  3. Carbogen bubbler 증류수 또는 0.1 N HCl을 씻어.
  4. 담가 5 분 동안 10% H2O2 에 슬라이스 인큐베이션 챔버 일주일에 한 번 그리고 후 철저 하 게 린스 이온 H2o. 보육 실
  5. 금속 자극 전극의 경우 각 실험 후 이온된 수로 자극 전극 팁을 린스 하 고 잔여 조직을 제거 하는 에탄올과 젖은 면봉으로 자극 전극 팁을 부드럽게 닦아 내십시오.
  6. 샌드 페이퍼로 조심 슬쩍 통해 끝 단을 제거 하 여 상용 금속 자극 전극의 저항을 줄일 수 있습니다.
  7. 소계 튜브 실리콘 튜브를 대체 하 여 튜브를 통해 재활용 하는 동안은 실제에서 carbogen 손실을 줄일.
  8. 양식에 AgCl 와이어 표면에 표 백제 몇 일 동안 기록 전극 및 참조 전극은 전선 유지.

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결과

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프로토콜 섹션에서 우리는 조각의 급성 hippocampal hippocampal 형성 (그림 1)의 복 부와 중간 부분에서 남성 C57BL/6 마우스 및 남성 Wistar 쥐 (5-8 주)의 준비를 설명. 슬라이서 플랫폼에 반구의 위치 그들을 안정적으로 유지 하는 데 도움이 하 고 안정화 한 천 또는 agarose의 필요를 제거 합니다. 관류 시스템 자체 운영 하는 액체의 필요한 유량을 주고 높은 회전에 연동 펌프를 기반으로 합니다. 따라서, 펌프 내에서 표준 튜브의 급속 한 노후화 만든 우리 비 실리콘 튜브를 사용 하 여 극복 하는 상당한 문제 (ID: 1.02 m m). 유출에 대 한 부정적인 압력 2.79 m m 내부 직경 두 병렬 연결 된 관에 의해 만들어집니다. 이 두 관 액체(그림 4)의 열망에 대 한 수 있도록 녹음 실에서...

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토론

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인터페이스 슬라이스 챔버 더 강력한 시 냅 스 응답25,26,,2728전시, 침수 챔버 패치 클램프 기록 및 형광에 대 한 추가 편의 제공 이미지입니다. 따라서, 우리 신경17,18, 형광 프로브의 이미지를 쉽게 확장할 수 있는 상업 잠수 슬라이스 챔버를 사용 하 여 급성 hippocampal 조각에서 필드 잠재적인 녹음의 여러 측면을 설명 했습니다. 19. 조각 준비25, 외 많은 시간 후에 녹음 실에서 지속적인 carbogen 레벨의 유지 보수 장애물의 하나를 나타냅니다. Carbogen ...

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공개 사항

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저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

트 면 실시, 분석, 실험을 설계 하 고 원고를 썼다. D.X. 및 C.P. 그림 준비에서 원조 하 고 실험을 실시. 이 작품은 NSFC (31320103906)에 의해 지원 되었다 결핵을 111 프로젝트 (B16013)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
< 강력 > 시약 필요 < / strong>
NaClSinopharm 화학 시약, 중국10019318
KClSinopharm 화학 시약, 중국10016318
KH 2 < / sub>PO 4 < / sub>Sinopharm 화학 시약, 중국10017618
MgCl2< / sub> &미드닷; 6H < 이하> 2 < / 하>O시노팜 화학 시약, 중국10012818
CaCl2< / sub>Sinopharm 화학 시약, 중국10005861
NaHCO 3< / sub>Sinopharm 화학 시약, 중국10018960
포도당시노팜 화학 시약, 중국10010518
NaH 2< / sub> PO4Sinopharm 화학 시약, 중국20040718
HEPES시그마H3375
피루브산 나트륨시그마A4043
MgSO4Sinopharm 화학 시약, 중국20025118
NaOHSinopharm 화학 시약, 중국10019718
해부
DecapitatorsHarvard 장치55-0012쥐 참수용
붕대 가위SCHREIBER12-4227마우스 참수
양날 블레이드Flying Eagle, 중국74-C
홍채 가위RWD, 중국S12003-09
뼈 RongeursRWD, 중국S22002-14
숟가락Hammacher HSN 152-13
치과 시멘트 주걱Hammacher HSN 016-15
치과 더블 엔드 굴삭기대장장이 외과, 미국BS-415-017
진동 마이크로톰라이카, 독일VT1200S
수술용 칼날 RWD, 중국S31023-02
수술 홀더RWD, 중국S32007-14
<강력>전기생리학 장비 및 재료
수직 피펫 풀러Narishige, 일본PC-10
방진 테이블Meirits, 일본ADZ-A0806
수중형 기록 챔버워너 인스트루먼트RC-26GLP
4축 마이크로매니퓰레이터서터, 미국MP-285, MP-225
플래티넘 와이어세계 정밀 기기PTP406
증폭기분자 장치, 미국Multiclamp 700B
데이터 수집 시스템분자 장치, 미국Digidata 1440A
분석기 소프트웨어분자 장치, 미국Clampex 10.2
형광 현미경Nikon, 일본FN1
LED 광원Lumen Dynamics Group, 캐나다X-cite 120LED
마이크로 피펫하버드 장치GC150TF세포 외 기록
붕규산 마이크로 피펫Sutter, 미국BF150-86패치 클램프
텅스텐 전극AM 시스템, 미국575500
연동 펌프긴, 연동중국 BT00-300T
튜브ISMATEC, Wertheim, 독일SC03091x 유입, ID: 연동 펌프용 1.02mm
튜브ISMATEC, Wertheim, 독일SC0319유출용 2x 튜브, ID: 2.79mm
CCD 카메라PCO, 독일pco.edge sCMOS
렌즈 청소지Kodak
50mL 원추형 원심 분리기 튜브Thermo scientific339652
PrechamberWarner InstrumentsBSC-PC
인라인 히터Warner InstrumentsSF-28
온도 컨트롤러Warner InstrumentsTC-324B
용 도구 및 재료 펌프용

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
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  5. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
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