Method Article

검색 및 대 식 세포 관련 Murine 창 자 염증의 정량화에 대 한 단층 형광 중재

DOI:

10.3791/55942

⸱

December 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

특정 대상 프로브 질병 (예를 들어, 염증, 감염, 및 tumorigenesis)의 다양 한 종류의 단백질 표정 등의 분자 메커니즘을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 연구에서 우리는 murine 모델 f 4/80 전용 형광 중재 단층 촬영을 사용 하 여 대 장 염의 장 대 식 세포 침투의 양적 차원 단층 평가 설명 합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

질병의 murine 모델은 과학적 연구에 불가결. 그러나, 내 시경 검사 나 컴퓨터 단층 촬영 영상 등 많은 진단 도구는 정기적으로 동물 모델에서 채택 하지. 기존의 실험 판독 자주 내 개별 후속 시험을 방지 하 고 필요한 연구 동물의 수를 증가 하는 사후 고 비보 전 분석에 의존 합니다. 형광-중재 단층 형광 프로브의 비-침략 적, 반복, 양적, 3 차원 평가 수 있습니다. 매우 중요 한 특정 검색 및 고유한 분자 대상의 특성에 대 한 수 있는 분자 제조 업체의 사용 허가 하 고. 특히, 타겟된 프로브 염증, 자가 면역 질환, 감염, 혈관 질환, 셀 마이그레이션, tumorigenesis, 등에서 유전자 활성화 및 단백질 발현을 분석 하기 위한 혁신적인 도구를 나타냅니다. 이 문서에서는, 우리 단계별 지침을 제공이 정교한 이미징 기술에 vivo에서 탐지 및 (즉, f 4/80-긍정적인 대 식 세포 침투)의 널리 murine 모델에서 염증의 특성에 대 한 장 염증입니다. 이 기술은 또한 면역 세포 또는 줄기 세포 추적 같은 다른 연구 분야에서 사용할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물 모델 연구에서 널리 이용 된다 그리고 모니터 질병 활동과 활력, 몸 무게 변경의 정량화 등 혈액, 소변, 배설물의 분석에 많은 비-침략 적 절차 존재 한다. 그러나, 이들은 또한 간 개별 다양성에 적용 되는 간접 대리 매개 변수만 있습니다. 그들은 자주 조직 표본, 반복 시간 지점에서 직렬 관찰 방지의 사후 분석으로 보완 해야 한다 고 에 비보를 처리 하는 생리 적 또는 병 적인 관찰. 정교한 이미징 기술에 작은 동물 등장, 교차 단면 영상, 광학 이미징 및 내 시경, 이러한 프로세스의 직접적인 시각화를 가능 하 게 하 고 또한 같은 동물1 의 반복적인 분석에 대 한 허용을 포함 한 , 2 , 3. 또한, 반복적으로 같은 동물에 있는 질병의 다양 한 상태 모니터링에 동물 윤리의 관점에서 것 필요한 하는 동물의 수 저하 될 수 있습니다.

여러 다른 광학 이미징 기술을 형광 이미징 vivo에서 존재 한다. 원래, confocal 영상 표면과 표면 아래 형광 이벤트4,5공부를 고용 했다. 그러나 최근에,, 양적 3 차원 조직 평가 대 한 허용 하는 단층 촬영 시스템 개발된6되었습니다. 이 낮은 흡수, 민감한 탐지기와 단색 광원7근처-적외선 (NIR) 스펙트럼에서 빛을 방출 하는 형광 프로브 개발을 통해 성취 되었습니다. 전통적인 에칭한 이미징 기술을, 동안 같은 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 자기 공명 영상 (MRI) 또는 초음파 (미국), 물리적에 주로 의존 하 고 시각화 형태학, 광학 이미징 제공할 수 있습니다 추가 정보 기본 분자 프로세스에8을프로브 생 또는 외 인 형광을 사용 합니다.

분자 생물학에서의 발전 목표의 증가 수에 대 한 스마트 하 고 타겟 형광 분자 프로브의 생성을 촉진 하기 위하여 왔다. 예를 들어 수용 체-중재 통풍 관 및 지정된 대상 지역에 배포 수 구상 될 carbocyanine 파생 표시 된 항 체9를 사용 하 여. 신체의 그렇지 않으면 액세스할 수 없는 영역에 특정 추적기 기능을 붙일 수는 사용 가능한 항 체의 풍부한 tumorigenesis, 신경의 모델에서 분자 및 세포 프로세스에 전례 없는 통찰력을 제공 심혈 관, 면 역학적, 그리고 염증 성 질병7.

이 연구에서 우리는 murine 모델 colitis의 단층 형광 중재를 사용 하 여를 설명합니다. Dextran 황산 나트륨 (DSS)-유도 대 장 염은 선 동적인 장 질병 (IBD)10유사한 창 자 염증의 화학적으로 유도 된 마우스 표준형. 특히 창 자 염증11의 개발에 타고 난 면역 체계의 기여를 평가 하기 위해 유용 합니다. 모집, 활성화, 및 monocytes 그리고 대 식 세포의 침투 IBD의 병 인에 중요 한 단계를 나타냅니다, 이후 그들의 신규 모집의 시각화 및 침투의 활동 모니터링, 예를 들어의 효과에 필수적입니다. 전 임상 설정12에 잠재적인 치료 물질. 우리는 DSS colitis의 유도 설명 하 고 monocyte/대 식 세포 마커 F4/80의 특정 시각화에 대 한 형광 분자 단층 촬영을 사용 하 여 창 자 점 막으로 대 식 세포 침투의 단층 촬영-중재 특성을 보여 13. 또한, 우리는 항 체 라벨; 등 보조 및 보완 절차를 설명 실험적인 체제; 그리고 분석 및 질병 활동 지 수 등 기존의 판독 상관 관계에서 얻은 이미지의 해석을 cytometry 및 조직학 분석과 immunohistochemistry 흐름. 우리는이 기술과 다른 이미지 형식에 대 한 비교의 한계를 논의.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 실험 Landesamt 위한 Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) 노르 트 베스트 팔 렌 독일 동물 보호 법률 (Tierschutzgesetz)에 의해 승인 되었다.

1. 재료 및 실험 설치

  1. 동물 케어입니다.
    1. (예를 들어, C57BL/6) 어떤 DSS 취약 긴장의 성별 및 나이 일치 마우스를 사용 하 여 20 ~ 25 g bodyweight에.
    2. 현지 동물 보호 지침에 따라 마우스 실험 그룹과 집 당 적어도 5 개 이상의 마우스를 계획 합니다.
    3. 다이어트 및 압력가 음료수 광고 libitum표준 설치류 차를 제공 합니다.
    4. 표준 차를 제거 하 고 파 무료 차 우와 최소 3 일 전에 endoluminal 자동 형광을 줄이기 위해 검색 합니다.
  2. DSS 유발 급성 대 장 염의 감 응 작용입니다.
    1. DSS의 2 세대 분해 (분자량 40000 ~ 다)의 2% (w/v 솔루션)를 얻기 위해 압력가 마로 소독 식 수 100 ml.
    2. DSS 솔루션으로 독점적으로 쥐의 마시는 공급을 마우스 하루 당 액체의 5 mL을 추정. 컨트롤 마우스10DSS 없이 같은 식 수를 제공 합니다.
      참고: 실험의 끝까지 매일 쥐를 모니터링 합니다. 하는 그들의 초기 체중의 20% 보다 큰 잃거나 죽어가는 되는 마우스를 안락사 (즉, 자세, 운동 감소를 지속적으로 hunched, 보람 호흡, 현저 하 게 코트를 세우 다) 동물에 로컬 해당 지침에 따라 복지입니다.
  3. 형광-중재 단층 촬영의 준비입니다.
    1. 형광 염료와 원하는 항 체 (예: 쥐 반대로 마우스 f 4/80) 레이블 (예: Cyanine7, λ여기: 750 nm, λ방출: 776 nm) 제조 업체의 프로토콜에 설명 된 대로. 적절 한 투 석 막에 순화 된 항 체를 dialyze (기 공 크기 < 50-100 kDa) 0.15 M 이상 2 시간 또는 하룻밤에 대 한 염화 나트륨의 1 L에 대 한.
      1. 0.1 m M NaHCO3 의 1 L에 항 체를 전송 하 고 적어도 2 시간에 대 한 dialyze.
      2. 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 형광 염료의 필요한 금액을 해산 (항 체의 10.8 µ L/mg) 항 체 솔루션에 추가. 20-fold 어 금 니 과잉에 형광 염료를 사용 하 여 1: 3의 염료 단백질 비율을 달성 하기 위해.
      3. 1 헤 0.15 M 나트륨의 1 L에 대 한 투 석 또는 PD-10 염 열을 사용 하 여 레이블이 없는 항 체 제거에 4 ° C에서 어둠 속에서 incubate 고 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 해결 합니다.
      4. 분 광 광도 법에 의해 최종 항 체 농도 및 라벨 비율을 결정 합니다.
      5. 250-330 nm의 흡수에서 단백질 농도 측정 하 고 염료에 의해 추가 흡수를 고려. 280에서 최대 흡수를 수정 nm (단백질) 750에서 최대 흡수의 11 %nm (다음 단계) Cyanine7 라벨에 대 한.
      6. 250-800 nm에 화합물 (일반적으로 1:10)의 희석을 측정 하 고 750에서 Cyanine7의 농도 추출 nm.
      7. 염료-단백질 비율을 결정: 염료/항 체 = 750에서 최대 흡수 nm / 200000 / (280에서 최대 흡수 nm-750에서 최대 흡수 x 0.11 nm) / 170000.
      8. 4 ° C에서 항 체 솔루션을 유지 하 고 주입 하기 전에 표백 피하기 위해 빛에서 그것을 보호.
    2. 그것은 사용 될 때까지 주입 및 빛에서 방패 직전 무 균 주사기에 필요한 항 체 솔루션 볼륨을 로드 합니다.
    3. 프로브 주입의 최적의 타이밍 및 트레이 서 약 동학에 따라 스캐닝 절차를 결정 합니다.
    4. 산소에서 흡입 1.5-2.5 %isoflurane 사용 하 여 마우스를 anesthetize 또는 레이블이 지정 된 항 체의 꼬리 정 맥 주사에 대 한 전용된 restrainer에 안전 하 게 넣어.
    5. 전체 길이 항 체에 대 한 분류 항 체 이상 24 h 검색, 이전 murine colitis에 반대로 마우스 F4/80 macrophage 시각화 등을 주입. 마우스를 정 맥 주사 (i.v.) 꼬리를 통해 염료의 2.0 nmol에 해당 하는 금액에 레이블이 지정 된 항 체와 정 맥.
    6. 사용 동일 하 게 표시 난다 항 체 (예: 쥐 IgG 또는 해당 기본 항 체 유산 하 다른 isotype) 복용량에 isotype 컨트롤로 특정 조사에 해당.
      참고: vivo에서 의 결과 검색 후 주입 제어 화합물의 특정 조사 데이터 이미징의 해석에 대 한 참조로 사용할 수 있습니다.
    7. 전기 면도기를 사용 하 여 빛의 반사와 흡수를 최소화 하기 위해 복 부에 동물 모피를 면도.

2. 기술 장비

  1. 수의 형광 중재 단층 (FMT) 장치를 사용 하 여 작은 동물 형광 ( 그림 4)에 대 한.
  2. "새로운 연구 결과"를 클릭 하 여 각 프로젝트에 대 한 새로운 연구를 만듭니다 단추 및 이미징 매개 변수 및 나중에 참조할 수에 대 한 복용량을 포함 하 여 관련 추적기 연구 설명에 포함 됩니다.
  3. 이 연구에서 "새로운 연구 그룹"을 클릭 하 여 각각 연구 설계 (예를 들어, 특정 추적 프로그램 및 불특정 isotype 제어에 대 한)에 따르면 연구 그룹 만들기 버튼. 동물의 각 번호와 각 연구 그룹을 장비.
  4. 추적 프로그램 구문에 대 한 시스템 보정.
    1. 라벨에 변화에 대 한 정상화 하 고 오이 데이터에서 양적 측정을 가능 하 게 하는 추적기의 각 일괄 처리에 대 한 보정을 수행 합니다.
    2. 각 개별 시스템의 교정에 대 한 악기 제조 업체의 지침에 따라 "추가 새 추적 프로그램"을 선택, 시스템 단계를 통해 가이드를 제공 합니다. 적용 된 항 체 솔루션의 희석 및 프로브에 추적 프로그램의 계산 된 절대 농도 제공 합니다.
    3. FMT, 정의 된 두께 및 흡수 특성 (중요 한 조직 닮은)의 조직 흉내 낸 팬텀을 사용 하 여 및 사용 되는 항 체 솔루션의 특정 볼륨 작성. FMT 장치에 이것을 측정 합니다.
      참고: 시스템 미래 vivo에서 측정에서 절대 추적 농도 계산 하 주어진된 농도 함께 제공 조사의 기준 측정을 사용 합니다.
  5. 42 ° C의 온도 heatable 시험 카세트를 사용 하 여
    참고:이 시험 기간 동안 저체온증이 되기에서 쥐를 방지할 수 있습니다.

3. 동물 마 취

  1. 1.5-2% vol %isoflurane ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane])와 anesthetize는 마우스를 1.5 L O2/min의 지속적인 흐름을 사용 하 여.
쥐 취 (isoflurane 기화 기)에 대 한 특별히 설계 된 흡입 시스템을 사용 하 여 쉽게 마 취 깊이 제어 하 고 직원 노출을 최소화 하기 위해.
  • 누출 방지 유도 챔버에 마우스를 놓고 isoflurane 공급 (100% (v/v), 산소, 3 L/min에서에서 5 vol %)을 위한 기화 기에 설정 합니다. 그것은 휴식 하 고 의식이 될 때까지 마우스를 모니터링 합니다.
  • 100 %v / v, 산소, 검사 하는 동안 운동 유물을 최소화 하기 위해 1.5 L/분에에서 1.5 vol %의 복용량에 원뿔을 통해 지속적인 isoflurane 흡입으로 단층에 대 한 시험 카세트에 그것을 배치 합니다. 5 분 이상 지속 되는 절차에 대 한 각 막 손상을 방지 하기 위해 마우스 눈에 눈 연 고를 적용 합니다.
  • 반사를 확인 하 여 마 취 깊이 평가 합니다. 마우스의 뒷면;에 누워 충분 한 마 취 이면 마우스 안 돌아서 한다. 그것의 발가락; 사이 부드럽게 마우스를 꼬집어 충분 한 마 취 인 경우는 다리 수술 관용의 철회 (단계) 수 없습니다.

    • 4. 형광 중재 단층 촬영 검사

    참고: 적응이 사용 되는 FMT 시스템 관련 다음과 같은 세부 사항이 필요에 따라 대체 형광 반사율 이미징 장치 또는 FMT 시스템에 대 한 참조 테이블의 재료연구.

    1. 시험 카세트에 그것의 뒤에 마 취 마우스를 놓습니다.
    2. 스캐닝 절차를 수행 합니다.
      1. 이미징 시스템에는 카세트 삽입 하 고 즉시 연속 마 취를 위해 그것을 닫습니다. 이전에 만든 연구 그룹에서 적절 한 샘플을 선택 합니다. 추적 프로그램 농도 대 한 값이 제대로 계산 되도록 드롭다운 메뉴에서 관리 추적 프로그램을 선택 합니다.
      2. 적절 한 파장에서 형광 반사율 이미지 획득 (720 Cyanine7에 대 한 nm) 검사 계획 및 개요 "이미지 획득" 버튼을 클릭 하 여 검색 필드에 대 한.
      3. 검색 필드에 형광 반사율 이미지 오버레이로 나타납니다를 참조 하십시오. (예를 들어, 콜론 또는 복 부), 관심 영역을 조정 공기 또는 나머지 모피의 영역을 피하고. 이미지 대상에 따라 이미지의 숫자 데이터 요소 내 설정 검색 필드 오른쪽에 있는 메뉴에서 중간 및 스캔-필드 해상도 거친에서 선택 하 여.
        참고: 명심 좋은 검색 필드 이상 크게 스캔 시간 비용 더 나은 공간적 해상도 제공할 수 있습니다.
      4. "검색."를 클릭 하 여 선택 된 파장에서 데이터/이미지 수집 시작
        참고: 전체 복 부의 중간 벌금 스캔에 대 한 검색 시간 약 5 분; 수 있습니다. 이 시간에서 각 데이터 요소는 별도로 여기 레이저 조명 하 고 결과 형광 기록 됩니다.
      5. 스캔의 끝에 이미징 카세트에서 동물을 제거 하 고 케이지에 다시 배치 하기 전에 완전히 복구할 수 동물 허용.
      6. 실험 기간 동안 다양 한 시간 지점에서 필요 하다 고 인정 하는 경우는 FMT를 반복 (예를 들어, 0, 5, 9-10 일 (실험의 끝)), 따라서 배경 형광 신호를 증가 하는 본문에 항 체의 축적을 고려 하지만.

    5입니다. 사후 검사

    1. 레드 라이트 지구 온난화 램프 아래 종이 타월에 별도 장에 마우스를 놓고 전체 복구까지 고민 또는 불편의 흔적에 대 한 마우스를 모니터링 합니다. 다시으로 그것의 각각 완전히 깨어 있을 때 마우스를 놓습니다.
    2. 100% (v/v)의 복용량에 아이 솔 레이 터에 CO2 의 전달에 의해 실험의 끝에 쥐, 100 vol %, 그리고 3 L/min를 안락사. 마십시오 하지 미리 채울 챔버 CO2 로 CO2 의 높은 농도에 갑자기 노출 조 난을 일으킬 수 있습니다. 마우스 안락사 급속 한 자 궁 경관 탈 구 등의 후속 보조 모드에 의해 호흡을 멈춘 후 죽음을 확인 합니다.
    3. 복 부 개복 술에 의해 결 explant 고 단계 4.2.1-4.2.4에에서 설명 된 대로 explanted 콜론의 비보 전 검사를 수행 합니다. 각 대 장 경도 Metzenbaum 수술가 위를 사용 하 여 열고 염 추가 분석을 위해 그것을 준비 하기 전에 철저 하 게 린스.
    4. 메스를 사용 하 여 원심 결에서 0.5 cm 조각 잘라내어 즉시 극저온 1.5 mL 튜브에. 액체 질소와-70 ° C에서 저장소에 추가 사용 (예:myeloperoxidase (MPO) 측정)까지 동결.
    5. 나무 막대기를 사용 하 고 조직학 분석에 대 한 점 막 바깥쪽 ("스위스 롤 기법")와 함께 근 위 끝에는 원심에서 나머지 경도 열린된 콜론을 롤. 준비는 정착 액에 장소 ( 테이블의 자료를 참조)-80 ° C14에 고정 하 고.

    6. 데이터 재구성 및 해석

    1. 각각 이미징 소프트웨어의 재구성 도구를 사용 하 여 원시 이미지 데이터; 형광 분포의 3 차원 지도 만들 검사 때 검사 시 재구성 도구에 자동으로 추가 됩니다, 함수 "대기열에 추가 개조" 선택 됩니다.
      1. 그렇지 않으면 스캔 각각 연구 아래에 있는 드롭다운 메뉴에서 및 연구 선택 그룹, 검색을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "재건에 추가 합니다." 선택
    2. 추가 분석을 위해 분석 소프트웨어를 데이터 집합을 로드 합니다. 메뉴 표시줄의 드롭다운 메뉴에서 각각 연구 선택한 후 연구 그룹 및 개별 동물; 오른쪽에 있는 메뉴에서 이 동물에 대 한 수행 하는 모든 검사 표시 됩니다. 정확한 검사를 선택 하 고 "로드." 클릭
      참고: 추적 프로그램 배포의 3D 개조 왼쪽에 처음 인수 형광 반사율 이미지의 오버레이로 표시 됩니다. 모델 회전 고 쉽게 분석을 위해 확대 될 수 있습니다.
    3. 재건축된 3D 지도에 난다 레이블 축적 (예를 들어, 간 또는 소변 방광)의 포커스를 식별 하 고 대상 조직 (예: 창 자 또는 창 자)에서 차별화 합니다.
    4. 상단 바에서 대상에 대 한 가장 적절 한 투자 수익 모양을 선택 합니다. (ROI) 분석 소프트웨어;에서 각각 측정 도구를 배치 하 여 관심의 영역으로 레이블 대상 조직 소프트웨어 제공할 것입니다 형광 강도 투자 수익로 (피코-)에 대 한 어 금 니 양의 추적 프로그램을 스캔에 대 한 조정 되었습니다.
    5. 질병 활동 (조직학) 선 동적인 침투와 상관 관계에서의 평가 대 한 가장 적합 한 상응 ROI 크기에 대 한 정규화 된 적절 한 투자 수익에 추적 프로그램의 총 금액을 선택 합니다.
      참고: 경우 특정 모델의 대표로 서 적절 한 투자 수익의 다른 기능을 선택할 수 있습니다.

    7입니다.전 비보 분석

    1. 되며 오신 얼룩과 면역 형광 염색 법입니다.
      1. 2 분;에 대 한 70% 에탄올 (EtOH)에 배치 하 여 섹션을 deparaffinize 증류수로 씻어 나중. 5 분 동안 되며 솔루션 stain 그리고 그 후 10 분 동안 따뜻한 수돗물으로 씻어.
      2. 증류수, 2 분, 오신 솔루션 counterstain와 헹 구 고 다시 증류수로 씻어.
      3. 70 %EtOH, 96 %EtOH, 99 %EtOH, 및 크 실 렌 (2 회) 2 분 각각 탈수와 섹션의 선택을 취소. 수 지 장착 매체와 탑재 합니다.
    2. 면역 형광 검사 얼룩입니다.
      1. 면역 형광 염색 법에 대 한 이전 획득된 조직 단면도 ("스위스 롤")를 사용 하 고 7 µ m의 cryo 컷 섹션을 준비.
      2. 10 분 동안 5.0% 쥐 혈 청에서 아세톤 고정 및 냉동 콜론 섹션을 차단 하 고 희석된 (1/500 v/v) biotinylated 주 쥐 반대로 마우스 F4/80 항 체와 함께 밤새 품 어. 섹션 Tris 버퍼 염 분 (TBS)에 세 번 세척 하 고 PBS/BSA에 Streptavidin FITC (1: 100 v/v)와 품 어 (0.1 %w / v) 4 ° c.에서 하룻밤
      3. TBS에 섹션을 세척 하 고 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000 v/v) 대비 달성 하기와 얼룩. Confocal 현미경 형광 이미지 분석 ( 테이블의 재료; 40 x 확대 필터 큐브 N2.1 여기 필터 515-560 참조)와 고 전력 분야 당 F4/80-긍정적인 세포.
        참고: vivo에서 FMT 및 사후 조직학 분석 immunohistochemistry 또는 의도 된 대상에 따라 면역 형광 염색 등을 결합 하는 때 동일한 복제 및 서식의 항 체를 사용 하 여 보십시오. F4/80-긍정적인 세포에서 vivo에서 와 ex vivo의검출에 대 한 다른 형식은 사용 했다.
    3. 콜론 샘플에서 MPO 측량입니다.
      1. 콜론 샘플 PBS 씻어 서 또는 MPO 측정에 대 한 해 동된 견본 취득 갓을 사용 합니다. 모든 샘플 무게와 균질 조직 세포의 용 해 버퍼는 ELISA에 제공에서 키트 ( 재료의 표참조) 조직의 mg 당 세포의 용 해 버퍼의 20 µ L의 볼륨에서.
      2. 15 sonicate s (쥡니다 주파수: 20khz, 전력: 70 W)와 g와 4 ° C x 200에서 10 분에 대 한 샘플을 원심
      3. 상용 ELISA 키트 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 제조 설명에 따르면. 중복에 테스트를 실시 합니다.

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    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Colitis의 평가:

    DSS 유도 colitis 인간의 IBD를 닮 고 체중 감소, 직장 출혈, 표면 궤, 그리고 취약 쥐15점 막 손상에 이르게 하는 창 자 염증의 화학적으로 유도 된 murine 모델입니다. 타고 난 면역 체계가 장내 염증10,11의 발전에의 기여를 연구 특히 유용 합니다. Potently colitic 염증 유도, 쥐 들이 지속적으로 실험 통해 DSS를 관리. 체중 감소와 지저분한 신비로운 혈액 염증의 임상 색인으로 사용 되었다. 그림 1A에서 같이, 마우스 제어 동물 물 혼자 받고 몸 무게에 중요 한 변경 보여...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    의료 이미징 기술을 최근 몇 년 동안에서 급속 하 게 진화, 비록 우리는 여전히 개발의 그들의 초기 단계에서 염증 성 프로세스 또는 종양, 뿐만 아니라 다른 질병을 감지 하는 우리의 능력에 제한 됩니다. 그러나, 이것은 이해 종양 성장, 침략, 또는 전이 개발 및 염증 성 질환 및 퇴행 성, 심장 혈관과 면역 질병의 발달에서 세포 프로세스에 매우 중요. 전통적인 이미징 기술을 신체적 또는 생리 적 매개 변수에 의존, 분자 이미징 vivo에서특정 분자 마커20의 시각화 수 있습니다.

    작은 동물 이미징, 방사성 핵 종 기반 접근 (예를 들어, s잉 글-광자 방출 계산 된 단층 촬영 (SPECT)과 양전자 방출 단층 촬영 (PET)), 초음파, 및 중재 하는 형광 이미징을 사용할 수 있는 특정 시각화 대상 분자 구조입니다. 대부분의 사용 가능한 추적 백본으로 전장 항 체를 사용 하 여 오랫동안 레이블을, 긴 순...

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    저자는 공개 없다.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    우리는 우수한 기술 지원에 대 한 양 소냐 Dufentester, 양 Elke 웨버와 부인 Klaudia Niepagenkämper 감사합니다.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Reagents
    Alfalfa-free dietHarlan Laboritories, Madison, USA2014
    Bepanthen eye ointmentBayer, Leverkusen, Germany80469764
    Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, 웁살라, 스웨덴DB001
    EosinSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 4382
    에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)                                                 시그마 - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
    Florene 100V/VAbbott, Wiesbaden, GermanyB506
    Haematoxylin                                                                                                       Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyHHS32-1L
    O.C.T. Tissue Tek compound                                                                 Sakura, Zoeterwonde, 네덜란드4583조직학적 분석을 위한 고정제
    인산염 완충 식염수, PBSLonza, Verviers, Belgium4629
    염화나트륨 0,9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
    중탄산나트륨 분말Sigma Aldrich Deisenhofen, GermanyS5761
    Standard dietAltromin, Lage, Germany1320
    Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Netherlands4566
    Hemoccult (guaiac paper test)Beckmann Coulter, Germany3060
    Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibodySerotec, Oxford, UKMCA497B
    Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 BD Pharmingen, 하이델베르크독일 553125
    Streptavidin-Alexa546Molecular Probes, Darmstadt, GermanyS-11225excitation/emission maximum:  556/573nm
    anti-CD11b rat-anti-mouse 항체 TCCalteg, Burlingame, USAR2b06
    Purified anti-mouse F4/80 antibodyBioLegend, London, UK123102
    DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyD9542
    FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse 항체BD Pharmingen, Heidelberg, Germany553104
    FACS bufferBD Pharmingen, Heidelberg, Germany342003
    Cy7 NHS EsterGE Healthcare  유럽, 프라이부르크, 독일PA17104
    MPO ELISAImmundiagnostik AG, Bensheim, GermanyK 6631B
    Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80antibody BioLegend, London, UK123127 ready to use labelled Antibodies (alternative)
    Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5eBioscience, Waltham, USA45-4801-80ready to use labelled Antibodies (alternative)
    DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany67-68-5
    IsofluraneSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany792632
    에탄올Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany64-17-5
    소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyA4612
    Tris Buffered Saline Solution (TBS)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanySRE0032
    NameCompany카탈로그 번호Comments
    Equipment
    FACS Calibur 유세포 분석 시스템BD Biosciences GmbH, 하이델베르크, 독일
    FMT 2000 In Vivo 이미징 시스템PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAFMT2000
    True Quant 3.1 이미징 분석 소프트웨어PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USAFMT2000
    Leica DMLB 형광 현미경Leica,  35578 Wetzlar, Germany DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 베를린, 독일HD 2070초음파 균질기
    일회용 메스 No 10Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, 독일Z692395-10EA
    Metzenbaum 가위 14cmEhrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, 독일22398330
    루어 잠금 주사기 5mlSigma-Aldrich, Deisenhoffen, 독일Z248010
    주사기 바늘Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, GermanyZ192368 
    Falcon Tube 50mlBD Biosciences, Erembodegem, 벨기에352070
    에 포함됨

    References

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