소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

요약

여기, 비 코딩 DNA 요소의 transposon 중재 무작위 삽입의 힘의 최적의 염색체 위치를 해결 하기 위해 사용 되었다.

초록

특정된 DNA 요소의 최적의 염색체 position(s)는 / transposon 중재 무작위 삽입 휘트니스 선택에 의해 다음에 의해 결정 되었다. 박테리아, 유전적 요소의 기능에 유전 맥락의 영향을 평가 하기 위해 어려울 수 있습니다. 토폴로지 효과, 이웃 유전자 또는 유전자 복제 관련 된 복용량, transcriptional 방해를 포함 하 여 몇 가지 메커니즘 주어진 유전적 요소의 기능 영향을 줄 수 있습니다. 여기, 대장균 및 간단한 성장 경쟁을 사용 하 여 가장 유리한 위치 실험 선택의 염색체에 DNA 요소의 임의의 통합을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 임의의 삽입, 성장 혜택, 실험적인 요구에 쉽게 조절 절차 적자 clone(s)의 선택과 결합의 잘 설명된 transposon-기반 시스템의 활용. 복잡 한 다중 클론 인구에 전체 게놈 시퀀싱 또는 선택 된 클론의 급속 한 식별에 대 한 쉬운 유전자 적자 clone(s)의 성격을 결정할 수 있습니다. 여기, 비 코딩 DNA 영역 DARS2, 대장균의 염색체 복제의 개시를 제어 하는 예제로 사용 되었다. DARS2 의 기능 유전자 복제 관련 된 복용량;에 의해 영향을 받을 것으로 알려져 가까이 DARS2 는 더 활성화 된다 DNA 복제의 기원에 가져옵니다. DARS2 DARS2의 염색체에 무작위로 삽입 된-변형 삭제. 개별 삽입을 포함 하는 결과 클론 풀링된 그리고 세대의 수백을 위해 서로 경쟁 했다. 마지막으로, 적자 클론 특징 되었고 DARS2 원래 DARS2 위치에 가까운 근접에서 삽입 포함 발견.

서론

어떤 유전적 요소의 기능 게놈에 있는 그것의 위치에 따라 달라질 수 있습니다. 박테리아에이 주로 결과 방해에서 인접 유전자, 로컬 DNA 토폴로지 및 복제 관련 유전자 노출량의 전사에 의해. 특히, DNA 복제 및 분리의 프로세스 제어, 적어도 부분에서 비 코딩 염색체 지역별¹, 그리고이 지역의 적절 한 기능에 따라 달라 집니다 genomic 위치/컨텍스트. 대장균, 예제에서는 여동생에 필요한 dif 사이트 염색체 해상도²; KOPS 시퀀스, 염색체 분리³;에 필요한 및 데이터, DARS1및 DARS2 지역, (아래; 적절 한 염색체 복제 제어에 필요한 ⁴). 우리 여기 DARS2 비 코딩 영역의 연구에 의해 exemplified 임의의 이전, 선택, 그리고 어떤 주어진된 유전 요소의 최적의 유전자 맥락의 결정에 대 한 허용 하는 방법 제시.

대장균, DnaA에 시작자 단백질은 DNA 물가는 단일 복제 원점오릭스, 여 helicase DnaB^5,,67의 채용에 대 한 책임. DnaA AAA⁺ (즉, 다양 한 활동과 관련 된 ATPases)에 속하는 단백질 유사한 높은 ATP 그리고 ADP를 바인딩할 수 및 화력⁵. DnaA^ATP 수준 개시⁸, DnaA^ATP 에 multimer를 형성에서 봉우리 오릭스 는 DNA 이중 오프닝⁹트리거합니다. 개시, 후 오릭스 hemimethylated SeqA 단백질의 바인딩을 포함 하는 메커니즘에 의해 격리로 인해 다시 개시에 대 한 일시적으로 사용할 수 없게 만든 오릭스^10,11. 격리, 동안 DnaA^ATP 의 수준을 적어도 두 가지 메커니즘에 의해 감소 된다: DnaA (RIDA)^12,13 및 데이터의 규제 비활성화-종속 DnaA^ATP 가수분해 (DDAH)^{14 ,15}. RIDA와 DDAH 홍보 DnaA^ADPDnaA^ATP 의 변환. 개시의 새로운 라운드 전에 DnaA^ADP 는 특정 DnaA 재가동 시퀀스 (DARS)에 DnaA^ATP 를 재가동: DARS1 및 DARS2^16,17. 염색체 데이터, DARS1및 DARS2는 비 코딩 지역과 DnaA^ATP를 변조 하는 보호자와 같은 방식으로 행동 /DnaA^ADP interconversion. 복제의 근원 밖에이 지역 활성화 DnaA 복잡 한 어셈블리 중 하나에 대 한 비활성화 (데이터, ¹⁴) 또는 활성화 (DARS1 및 DARS2; ¹⁷) DnaA의. DARS2 셀에서 삭제 대량 배로 시간 되지만 비동기 복제 개시^15,,1618변경 되지 않습니다. 그러나, DARS2-결핍 세포는 피트 니스는 풍부한 매체에서 모두 지속적인 성장 경쟁 하는 동안 또는 마우스 내장¹⁸에 있는 식민지의 설립 동안에 그렇지 않으면 isogenic wildtype에 비해 비용. 이 비동기/근원 농도에 사소한 변화 세균성 체력에 부정적인 효과 나타냅니다. 대장균, 선택적 압력 유지 염색체 대칭 (즉, 두 거의 같은 길이의 복제 팔)¹⁹있다. 데이터, DARS1및 DARS2 지역에 동일한 상대 거리는 오릭스 모든 대장균 변종 시퀀싱¹⁸, 염색체 크기에 큰 변화에도 불구 하 고.

여기, 우리가 그것의 기능에 대 한 최적의 염색체 position(s)의 식별에 대 한 예를 들어 대장균 의 DARS2 지역을 사용합니다. DARS2 NKBOR transposon 및 결과 NKBOR에 삽입 되었다: MG1655의 게놈에 무작위로 삽입 이후DARS2 transposon ΔDARS2. 우리는 따라서 셀의 컬렉션을 생성, 각 보유 DARS2 염색체에 다른 위치에 배치 합니다. 생체 외에서 경쟁 실험, 어디는 컬렉션에 있는 모든 셀 풀링된 되었고 약된 700 세대에 대 한 파운드에서 지속적인 성장을 하는 동안 서로 대하여 경쟁, 수행 되었다. 경쟁 실험의 결과 모니터링/결정 했다 남쪽 오 점, 쉬운 유전자 산책, 그리고 전체 게놈 시퀀싱 (WGS;를 사용 하 여 그림 1)입니다. 끝점 클론 쉬운 유전자 걸어서 해결 cytometry 세포 주기 매개 변수를 평가 하 여 특징 이었다. 흐름 cytometric 분석에 많은 수의 셀에 대 한 셀 크기, DNA 콘텐츠 및 개시 synchrony를 측정할 수 있습니다. Cytometry, 하는 동안 단일 셀의 흐름은 다음 동시에 등록 내보낸된 형광 DNA 콘텐츠, 측정을 수집 하는 photomultipliers에 의해 제공, 스테인드 DNA를 자극 하는 적절 한 파장의 광선 전달 합니다 세포는 DNA에 물 들 다. 앞으로 흩어져 빛 셀 대량²⁰의 측정 이다.

생체 외에서 경쟁 실험 선물이 여기 염색체 위치 및 유전 요소의 게놈 맥락의 중요성에 관한 문제를 해결 하는 데 사용 됩니다. 방법은 공평 하 고 사용 하기 쉬운입니다.

프로토콜

1. Transposon 도서관의 컬렉션

참고: 염색체 DARS2 로커 스 미니 테네시 10으로 복제 했다-transposon, NKBOR (pNKBOR)에 ²¹, 결과 기반으로 NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR 온라인 ²² 얻어질 수 있다. pNKBOR 복제 ²³ 시작자 단백질 π를 필요로 하는 R6K 기반 자살 벡터 이다. 플라스 미드 pJFM1는 따라서 pir 유전자의 염색체 복사본을 포함 하는 E. 콜라이 긴장 (예를 들어, Dh5α λ pir)에 복제할 수 있습니다. 그러나, pJFM1은 Pir 불충분 한 wildtype MG1655로 변형 때 pJFM1 복제할 수 없습니다, NKBOR의 임의 삽입에 의해 생성 된 대 저항 클론의 선택에 지도:: 세균성 염색체로 DARS2. 편의상,이 DARS2 삽입 라고 하. 그림 1 방법론의 도식 프레 젠 테이 션을 참조 하십시오.

1. 준비 electrocompetent MG1655 Δ 적극적으로 성장에서 DARS2 Lysogeny 국물 (파운드)에서 37 ° C ²⁴ 성장 세포.
2. Electroporate pJFM1 electrocompetent MG1655 Δ로 DARS2, 곤잘레스 외. 따라 ²⁴ electrocompetent 대장균 MG1655 Δ의
   1. 40 (물 1 µ L)에서 pJFM1의 추가 1 µ g µ L DARS2 미리 냉장, 무 균 0.2 cm 간격 베트에이 혼합물을 전송. Electroporation 챔버에는 베트를 삽입 합니다. 18 Electroporate kV, 500 Ω 및 25 µ F; 시간 상수 ~5.0 ms, 그리고 아무 아크가 발생 한다.
   2. 신속 하 게 미리 데워 파운드 국물과 15 mL 테스트 튜브에 1 mL에 resuspending에 의해 세균성 정지 복구.
   3. 셀 항생제 선택 없이 30 분 동안 37 ° C에서 화난된 성장 조건 하에서 배양 하 여 복구 하자. 50µg/mL 대 보충 파운드 한 천 배지 위에 박테리아 접시 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
3. 는 electroporation에서 식민지를 계산: 한 식민지는 것으로 간주 한 염색체 transposon 삽입.
   참고: 식민지는 식민지 카운터 또는 눈으로 계산 될 수 있습니다. 식민지의 수는 각 클론의 염색체에 위치한 transposons 분리 평균 거리에 반비례 한다.
4. 추가 1 mL 각 파운드 국물의 접시와 모든 식민지를 씻어; 파운드 국물의 1 mL ~ 100000 식민지 씻어 충분 해야 한다. 다시 파운드 국물 세균 농도 증가 동일한 1 mL를 사용 하 여. 같은 50 mL 튜브에 모든 식민지 수영장.
5. 소용돌이 튜브 및 동결 시작 물자 (t = 0). 그것을 고정, 얼음에 50% 글리세롤의 1 mL와 함께 셀 서 스 펜 션의 1 mL를 혼합 한다. 10 분 동안 얼음 건조 튜브를 전송 합니다. 일단 문화, 냉동-80 ° C 냉동 고에 그들을 전송.
   참고:이 단계에서 50000 CFU/mL의 최소의 셀 농도으로 예상 된다.

2. 파운드에 경쟁 실험

1. 녹여 얼음에-80 ° C에서 transposon 라이브러리. Pipetting으로 믹스.
2. Transposon 라이브러리 15 mL 테스트 튜브에 파운드의 10 mL를의 전송 100 µ L.
3. 고정 단계를 37 ° C에서 8 h에 대 한 연속 진동 (250rpm) 의해 화난 세포 성장 (즉, OD ₆₀₀ ~ 4.0 =). 원하는 대로 다른 성장 조건에 이러한 매개 변수를 조정.
4. 신선한 prewarmed 매체에 연속 전송에 의해 세균성 인구 모든 ~ 10 세대를 전파합니다. 이렇게 신선한 파운드의 10 mL를 이전 고정 단계 문화 10 µ L를 전송 하 고 다른 8 h에 대 한 성장 하는 고정 단계로 (즉, OD ₆₀₀ ~ 4.0 =).
   참고: 시작 및 끝 광학 밀도 동일 인으로 빌드하기 희석에 해당 ~ 10 세대의 성장 (2 ¹⁰ = 1024). 세균성 인구 중 신선한 prewarmed 매체에 직접 전파 하거나 저장할 수 0-4 ° C (얼음)에 다음 날을 전파 하 고. 파운드는 여기 많은 휴대폰 doublings에 짧은 가능한 (22 분 가까이 두 배로 시간) 시간을 보장 하기 위해 사용 되었다.
5. 경쟁의 각 100 세대, 이후 저장-80 ° C에서 5 1 mL 샘플 (단계 3.3에서에서 설명).
6. 개별 transposon 삽입을 포함 하는 셀 간의 체력 차이 작은 것으로 예상 된다, 만약 계속 경쟁의 기간 긴, 여기, 700 세대 (t = 700) 사용 되었다.

3. 감시 하는 경쟁 실험 동안 남쪽 오 점 분석

1. 특정 뇌관을 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭을 수행 하 여 오 (1-kb 섹션에서 NKBOR의) 남부에 대 한 조사를 준비: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat 및 NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
2. 품 30 98 ° C에
   초기 변성에 대 한 s. 그런 다음 10 98 ° C에서 35 주기를 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 45 72 ° C s. 마지막 확장에 대 일 분을 위한 72 ° C 사용
   참고: PCR 반응에 대 한 서식 파일은 순화 pNKBOR 플라스 미드 ²¹.
   1. 스미스 ²⁵에 따라 결과 PCR 파편 [α-32 P] dATP 임의의 뇌관 시스템을 사용 하 여 레이블.
3. T Løbner Olesen 및 폰 Freiesleben ²⁶에 따르면 총 세포질 DNA 준비 = 0 및 선택한 시간 포인트 t까지 700 세대 경쟁의 추정 =.
4. 소화 Pvu을 인하 하지 지역에만 한 번 관심 영역을 포함 하는 NKBOR 나 프로브에 의해 보호와 총 세포질 DNA; 1 단위의 Pvu 나 기판 DNA의 완전히 다이제스트 1 µ g를 사용할 수 있습니다.
   참고: 프로브 삽입 사이트에 따라 다양 한 길이의 염색체 DNA 함께 transposon의 일부가 들어 있는 조각 인식 합니다.
5. Løbner Olesen 및 폰 Freiesleben ²⁶에 따라 0.7 %agarose 젤을 사용 하 여 남쪽 오 점 수행.

4. 적자 클론의 식별

1. 사용 쉬운 유전자 걷기, 해리슨 그 외 여러분에 의해 설명 된 대로 ²⁷, 700 예상된 세대 경쟁; 후 단일 클론 (파운드 플레이트에 고립 된)에서 DARS2 삽입 사이트를 식별 하 더 밴드 남쪽 오 점에 더 격리 하는 데 필요한 모든 transposon 삽입 커버.
   1. 격리 PCR 템플릿 genomic DNA 50 µ g/mL 대를 포함 하는 파운드 한 천 격판덮개에 박테리아를 확산 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어. 37 ° C에서 파운드 국물에서 숙박 한 식민지를 성장 한 이후에 압력가 증류수 200 µ L로 20 µ L을 전송 (또는 DNA 정화 단계 3.2에서 사용).
   2. 혼합 소용돌이
      입니다. 위한 10 분 및 5 분에 대 한 최대 속도 원심 분리기 저장 세포 lysate 미래 사용을 위한-20 ° C에서 100 ° C에서 혼합 열.
   3. 선택의 transposon 내 anneal를 3 중첩 된 뇌관 디자인 (PCR 전략의 그래픽 표현에 대 한 그림 2 참조).
      참고: 중첩 된 뇌관 3 알려진된 5에 가장 가까운 거짓말 확인 해야 중첩 된 뇌관 디자인 ' transposon DNA, 중첩 프라이 머 2와 1의 끝. 중첩 된 뇌관 3와 5 사이 간격 ' 알려진된 t의 끝ransposon DNA (사이트를 찾을 수 있는 특정 염색체 transposon 삽입) 알 수 없는 DNA에 알려진된 DNA에서 시퀀스 read-through에 대 한 충분 해야 한다. NKBOR에 대 한 다음 중첩 된 뇌관을 사용 되었다: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg, 및 pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. 알려진된 제한 효소의 인식 사이트를 포함 하는 임의의 뇌관도 사용 됩니다. 결과 보장 하기 위해, 하나는 적어도 두 개의 다른 무작위 뇌관을 사용 해야 합니다. 제한 효소 (e.g.,Sau 3AI 및 힌 dIII)에 대 한 제한 사이트 있어야 3 ' 끝과 앞 10 임의의 기지 그래서 그 5 '-NNNNNNNNNNGATC-3 ' 5 '-NNNNNNNNNNAAGCTT-3 '는 뇌관 포함 된 Sau 3AI 사이트 (GATC) 힌 dIII 사이트 (AAGCTT), 각각, 어디 N = A, T, G, 또는 C.
   4. 20에서 게놈 DNA의 사용 200 ng µ L PCR 반응. 30에 대 한 98 ° C에 품 어 초기 변성에 대 한 s. 30에 대 한 98 ° C에서 25 주기를 수행 15 50 ° C s s, 그리고 4 분 동안 72 ° C. 마지막 확장에 대 한 사용 하 여 72 ° C 10 분 사용 뇌관 쌍 구성 된 중첩 된 뇌관 1 무작위 뇌관 중 하나.
   5. 뇌관 쌍 뇌관 2 중첩 및 두 번째 증폭에서 동일한 무작위 뇌관의 구성 된 그것의 이전 반응의 1 µ L를 사용 하 여 서식 파일로 사용.
   6. 반복 단계 4.1.4 뇌관 3 중첩 된 동일한 임의의 뇌관의 구성 된 뇌관 쌍.
   7. 는 1.5 %agarose 젤에 ethidium 평범한 사람으로 얼룩 최종 PCR 반응에서 제품을 실행합니다. 100-800 bp 범위에서 밴드를 잘라 하 고 어떤 상업적인 DNA 젤 추출 키트 제조 업체에 따르면를 사용 하 여 DNA를 분리 ' s 방향. 물 15 µ L에서 DNA resuspend.
      참고: 주의. Ethidium 평범한 사람 독성 그리고 관리와 처리 해야 합니다.
   8. 생어를 사용 하 여 시퀀싱 뇌관으로 뇌관 3 중첩 (4.1.6 단계) 이전 단계에서 격리 하는 밴드 순서는 상업적인 공급자에서 시퀀싱.
2. WGS 수행.
   1. Frimodt 몰 러 외 ⁴에 설명 된 대로 수행 WGS DNA에서 추출한 총에 경쟁 실험 기간 동안 수집 된 샘플을 선택.
3. 시퀀싱 분석 수행.
   1. 맞춤 짝 간 150을 읽고 NKBOR, AF310136.1 1,904 인접 Ns … 2,204 씨앗 부분 문자열 (S, 1, 1.15)와의 모호한 문자 (L, 0, 0.9) 최대 수 사이 간격 Bowtie2 ²⁸을 사용 하 여.
   2. 정렬 된 읽기를 선택 하 고 다음 다시 두 MG1655 ref를 정렬 | NC_000913.3 및 NKBOR 기가바이트 | AF310136 blastN ²⁹를 사용 하 여
   3. 할당 전위 접합 MG1655 NKBOR에서 삽입 위치.

5. Flow Cytometry

1. cytometry에 대 한 샘플을 수집. 적어도 10 세대를 위한 지 수 성장 단계에 그것을 유지 하 여
   1. 균형 각 문화. OD ₆₀₀을 확인 하 고 그것은 결코 0.3 초과 확인.
   2. 두 가지 유형의 흐름 샘플을 수집합니다.
      1. RIF runout에 대 한 RIF-CEF (300 µ g/mL 리 팜 피신과 36 µ g/mL 세 팔 렉 신 12.5 m m NaOH에에서 녹아 있는)의 30 µ L을 포함 하는 15 mL 튜브에 문화의 1 mL을 전송. 동요의 4 h의 최소 37 ° C에서 그것을 두고.
         참고: 리 팜 피신 직접 차단 하지 복제에의 지속적인 라운드 종료를 계속 하면서 염색체 복제의 개시 합니다. 세 팔 렉 신 세포 분열, 복제 runout (RIF runout)에 완전히 복제 된 염색체를 가진 세포의 축적을 방지 합니다. 리 팜 피신 및 세 팔 렉 신 ²⁰ 치료 시 완전히 복제 된 염색체의 수는 근원의 수.
      2. 특급-샘플, 전송의 기 하 급수적으로 성장 하는 얼음에 1.5 mL 튜브에 문화 1 mL
2. 셀을 다음과 같이 수정. 4에서 5 분 동안 15000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확 ° C. 얼음 10 mM Tris pH 7.5의 100 µ L에 펠 릿을 Resuspend 하 고 차가운 77% 에탄올의 1 mL을 추가. 사용 될 때까지 4 ° C에서 샘플 저장.
3. 셀 다음과 같이 얼룩. 상쾌한 15 분 제거에 대 한 15000 x g에서 원심 분리 하 여 고정된 셀의 100-300 µ L를 수확 하 고 펠 릿의 130 µ L에서 resuspend " DNA 얼룩이 솔루션 " (90 µ g/mL mithramycin, 20 µ g/mL ethidium 평범한 사람, 10 m m MgCl ₂ 그리고 10 mM Tris pH 7.5). 얼음에 샘플을 넣어 하 어두운; 샘플에 대 한 준비가 흐름 cytometry 분석 10 분 후
   참고: 다른 DNA ethidium 평범한 사람 보다 얼룩과 mithramycin 사용된 ^{30 , 31} 수.
4. 흐름 cytometry 분석 셀, 상대 셀 질량 및 상대 DNA 콘텐츠 원본 결정.
5. 수행 cytometry, ³²에서 설명한 대로
   . RIF runout 및 EXP-샘플 교류 cytometer 제조 업체를 사용 하 여 실행 ' s 지침 . Mithramycin-및 ethidium 평범한 사람 얼룩이 진 셀 여기 파장 395 및 440 nm을 사용 하 고 565 위 형광 수집 nm.
   1. 셀 번호 히스토그램 대 단일 매개 변수 앞으로 빛 분산형 및 30000 이벤트의 최소 셀 번호 히스토그램 대 형광 강도 특급 샘플 실행 상대 셀 질량과 상대 DNA 콘텐츠를 결정 하려면
      해당 셀 신호 하.
      1. 사용 앞으로 흩어져 빛 단일 매개 변수 분포를 평균 상대 측정 셀 미사
         참고: 앞으로 흩어져 빛은 평균 셀 대량 ²⁰.
      2. 평균 DNA를 측정 하기 위해 사용 형광 강도 단일 매개 변수 배포판 콘텐츠 ²⁰.
      3. 평균 DNA 콘텐츠 평균 셀 대량 ²⁰의 비율으로 DNA 농도 얻을.
   2. 셀 당 근원의 수를 결정.
      1. 대 단일 매개 변수 형광 강도를 실행 RIF runout 샘플 셀 셀 신호에 해당 하는 30000 이벤트의 최소 숫자 히스토그램.
      2. 각 염색체의 수를 확인 하려면 사용 하 여 형광 강도 단일 매개 변수 배포판 셀 ²⁰.
6. 계산 비동기 인덱스 (Ai).
7. 계산 Ai, Løbner Olesen 외에 설명 된 대로
   ³², RIF runout 샘플 및 수식 Ai의 형광 강도 단일 매개 변수 배포판을 사용 하 여 = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 f4 + f8), fx가 x 완전히 복제 된 염색체의 수와 분수 셀. 식 이라고 때 비동기 고려 A > 0.1.

결과

남쪽 오 점 DARS2 transposon 라이브러리에 염색체에 걸쳐 무작위로 배포 했다 확인 이루어졌다 (t = 0) 적자 클론 시간이 지남에 유지할 것 이다 그. 남쪽 오 점 초기 transposon 풀에서 추출한 DNA에서 수행 되었다 (t = 0)과 경쟁 (그림 3)의 700 세대에서 모든 예상된 100. 여기, 각 시간 점에서 총 세포 DNA가 나 제한 효소, 잘라 transposon NKBOR 알려진 Pvu와 소화::DARS2 한 번 조사에 의해 적용 되지 않는 지역에만. 남쪽 오 점 NKBOR의 부분 보완 방사성 레이블이 DNA 파편으로 조사 되었다. 그림 3, 초기 DARS2 수영장에서에서 본 (t = 0) DARS2 염색체에 걸쳐 무작위로 삽입 된 보여주는 부족된 고유 ...

토론

여기에서 사용 하는 방법론-의 상태--예술 기법 유전적 요소의 최적의 게놈 위치에 대 한 어려운 질문에 대답을 활용 합니다. 유전자 요소 (중재는 transposon)의 임의 삽입 수 클론 다음 조사 유전 요소의 최적의 위치를 위해 선택 하는 서로 대하여 경쟁 하기 위해 만들 수 있는 수천의 신속 하 고 쉽게 컬렉션 (즉 적자 클론).

여기, DARS2 미니-테네시10에 삽입 된-transposon, NKBOR를 기반으로. Transposon의 선택 삽입 사이트의 다운스트림 분석을 위해 중요 하다. 여러 다른 transposons 미니-테네시5Km2³⁴ 등 더 인기 있는 선택, Himar는 transposon 감독 삽입 사이트 시퀀싱 (TraDIS) 실험에서 사용 된 난 마리너 transposon^35,

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고압 클레이브 Mili-Q 물		없음
전기충격 큐벳, 0.1 cm	Thermo Fisher Scientific	P41050
Bio-Rad MicroPulser 전기충격 시스템	Bio-Rad	165-2100
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780029
LB 한천, 분말 (Lennox L 한천)	Thermo Fisher Scientific	22700025
글리세롤	Thermo Fisher Scientific	17904
Fisherbrand  플라스틱 페트리 접시	Fisher Scientific	S33580A
Falcon 50mL 원추형 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL 원뿔형 원심분리기 튜브	Fisher Scientific	14-959-53A
Nunc  CryoTubes	시그마-알드리치	V7634
Phusion High-Fidelity DNA 중합효소(2 U/µ L)	Thermo Fisher Scientific	F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &마이크로; Ci	PerkinElmer	BLU012H250UC
DECAprime II DNA 라벨링 키트	Thermo Fisher Scientific	AM1455
분광광도계  SF/MBV/03.32	Pharmacia
Hermle 원심분리기      SF/MBV/03.46	Hermle
Ole Dich 원심분리기  SF/MBV/03.29	Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL	Sigma-Aldrich	T9661
Eppendorftubes 2.0 mL	Sigma-Aldrich	T2795
염화나트륨	Merck	6404
96% 에탄올	Sigma-Aldrich	16368
Trizma HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
페놀 초순수	BRL	5509UA
클로로포름	Merck	2445
리보 뉴클레아제 A 유형 II 시	그마 - 알드리치	R5000
나트륨 도데 실 황산염 (SDS)	머크	13760
리소자임	시그마 - 알드리치	L 6876
이소프로판올	시그마 - 알드리치	405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0	BRL	5575 UA
카나마이신 설페이트	시그마-알드리치	10106801001
PvuI(10 U/&마이크로; L)	Thermo Fisher Scientific	ER0621
UltraPure Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500500
DNA 겔 로딩 염료(6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611
Tris-Borate-EDTA 완충액	Sigma-Aldrich	T4415
브롬화 에티듐	Sigma-Aldrich	E7637
염산	Sigma-Aldrich	433160
수산화나트륨	Sigma-Aldrich	71687
Whatman  3MM 종이	시그마-알드리치	WHA3030931
SSC 버퍼 20× 집중	시그마-알드리치	S6639
아머샴 하이본드-N+	GE 헬스케어	RPN119B
Ficoll  400	Sigma-Aldrich	F8016
폴리비닐피롤리돈	Sigma-Aldrich	PVP40
소 혈청 알부민 - 분획 V	Sigma-Aldrich	85040C
연어 고환에서 추출한 디옥시리보 핵산 나트륨 염	Sigma-Aldrich	D1626
Carestream Kodak   바이오맥스   라이트 필름	Sigma-Aldrich	Z373494
GenElute   젤 추출 키트	Sigma-Aldrich	NA1111
젠엘루트   PCR 클린업 키트	Sigma-Aldrich	NA1020
T100  Thermal Cycler	Bio-Rad
SmartSpec Plus 분광 광도계	Bio-Rad
리팜피신	서비스	34514.01
세팔렉신	시그마-알드리치	C4895
미트라마이신	서비스	29803.02
염화마그네슘 육수화물	시그마-알드리치	246964
아포지 A10 악기	아포지