외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

Summary

여기에 설명 된 메서드는 exogenous 항 바인딩과 그물 관련 저하 크로스-프레 젠 테이 션에 의해 처리 됩니다 세포질 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다.

Abstract

수지상 세포 (Dc)는 고도의 처리 및 중요 한 조직 적합성 클래스 (MHC)에 따라 내 면된 외 인 항 원 제시의 나 분자 라고 크로스-프레 젠 테이 션 (CP). CP는 중요 한 역할 뿐만 아니라 순진한 CD8 자극⁺ T 세포와 CD8 메모리⁺ T 세포에 대 한 감염 및 self-acting의 비활성화에 뿐만 아니라 종양 면역 naïve T 세포 T 세포 아 또는 T 셀 삭제. CP의 중요 한 분자 메커니즘 해명 될 남아, 비록 축적 증거가 나타냅니다 exogenous 항 저하를 통해 떠다니고 그물 관련 (ERAD) 비 클래식에서 수출 후 endocytic 처리 됩니다. 구획입니다. 최근까지, 외 인 항 원 이외의 아무 특정 분자 마커 있었기 때문에 이러한 endocytic 구획의 characterizations을 제한 했다. 여기에 설명 된 메서드는 이러한 endocytic 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다. 이 순화 microsome 사용 하 여, 우리 재구성 ERAD 같은 전송, ubiquitination, 및 처리는 외 인 항 원에 체 외에, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 수출이 후 외 인 항 원 처리 제안 세포질 구획입니다. 이 프로토콜은 CP의 분자 메커니즘을 명확 하 게 다른 세포 유형에 더 적용할 수 있습니다.

Introduction

MHC I 분자 cytosol¹에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 처리 되는 내 인 성 항에서 파생 하는 짧은 항 원 펩 티 드와 모든 nucleated 세포의 표면에 표현 된다. 처리 후, 항 원 펩 티 드 펩 티 드 운송업 자 탭에 의해 바인딩과 그물 (응급실) 루멘으로 이송 됩니다. ER의 루멘에서 일련의 특정 보호자 펩 티 드 로드 하 고 올바른 접는 MHC의 나 복잡 한 지원 합니다. 분자의이 시리즈는 펩 티 드 로드 복잡 한 (PLC), 응급실 펩 티 드 나²MHC에 적재에 대 한 중앙 구획을 나타내는 이라고 합니다. 후에 펩 티 드, 로드는 MHC I 분자 세포 표면에 수송 하 고 핵심적인 역할을 담당할 적응 면역 시스템에 자기 마커, 그리고 수는 CD8⁺ 세포 독성 T 세포 (Ctl) 암 세포 또는 전염 성 요원을 항 원에 의해 ³비 각자 단백질 펩 티 드.

항 원 제시 세포 (APC), 외 인 항에서 항 원 펩 티 드에서는 또한 내가^4,5,

Protocol

1. 성장 세포와 외 인 항 원 추가

biotin 단백질 라벨을 사용 하 여

1. 준비 bOVA 키트 제조 업체에 따라 ' s 프로토콜.
   참고: 일반적으로, bOVA 포함 2 M biotin 1 M OVA 당 평균.
2. 성장 DC2.4 셀 RPMI-1640 2mm L-글루타민, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산, 100 U/mL 페니실린-스, 55 m m 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5), 및 5에서 37 ° C에서 10% 태아 종 아리 혈 청 (여기서 부터는 RPMI)와 보충 습도 인큐베이터에서 % CO ₂ (이 언급 없이 세포는 인 큐베이 팅이 조건에서). 그것은 또한 DMEM 10% 태아 종 아리 혈 청 RPMI 대신 NaHCO ₃ (여기서 부터는 DMEM) 3.7 g/L 보충을 사용 하 여.
3. 주 정화, 전에 분할 RPMI의 셀 사용 하 여 조직 문화 접시에 1 x 10 ⁵ 셀/ml. Confluent 상태에서 세포를 유지 하지 마십시오. DC2.4 셀 매우 반 confluent 상태로까지 외 인 항 원을 통합할 수 있지만 빠르게 오버 합칠 상태에 도달 후 능력을 잃고.
4. DC2....

Results

CP의 분자 메커니즘을 명료 하 게 그것은 exogenous 항 ERAD와 같은 전송 및 처리를 받아야 세포질 구획을 식별 하는 데 필요한. Immunofluorescent 현미경 또는 전자 현미경 관찰 어디 외 인 항 원^{16,,1718,19, 축적 된 세포질 구획을 확인 하는 동안 30,31,,3233}, exogenous 항의 ERAD 같은 처리에 대 .......

Discussion

CP의 이전 연구에서 통합된 외 인 항 원 immunofluorescent 현미경 검사 법^16,30,,3132에 의해 늦은 endosome 또는 응급실의 제한 된 영역에서 축적 된. 세포질 구획은 자당 또는 iodixanol 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 식별 되는 ERAD와 같은 전송 및 외 인 항 원 처리 수행 됩니다 응급실 또는 늦은 endosome의 이러한 전문된 분야에서 추정 된다 ubiquitinated는 ERAD 같은 처리 마커로 bOVA. 그들의 타고 난 면역 자극 후 CP 효율은 크게 증가, 그리고 높은 밀도 분수 (게시 되지 않은 결과) ubiquitinated bOVA 함께 bOVA의 피크 분수 마이그레이션. 이러한 실험의 목표 응급실 또는 bOVA 또는 ubiquit.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
소 태아 혈청	Equitech bio	SFB30
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
-메르캅토에탄올	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
페니시실린-스렙토마이신	gibco by life technologies	15140-122
DMEM	gibco by life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
비오틴 단백질 라벨링 키트	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz, Biotechnology	, 201270
lactacystin	SIGMA	L6785
Dounce homogenizer	IUCHI	131703
프로테아제 억제제 칵테일	SIGMA	P8340
요오딕산올	Cosmo, bio	1114542
SA-마그네틱 비드	New England Biolabs	201270
제어 마그네틱 비드	Chemagen	M-PVA012
마그네틱 스탠드	BD Biosciences	552311
BCA 단백질 분석 키트	Thermo Fisher Scientific	23225
실버 염색 키트	Cosmo bio	423413
Reticulocyte Lysate	Promega
플래그 태그가 지정된 유비퀴틴	SIGMA	U5382
항 ovalbumin (OVA, 마우스)	항체 상점	HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (마우스)	MBL	D058&마이너스;
안티 플래그(마우스)	SIGMA	F3165
트립신	SIGMA	85450C