외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

Summary

여기에 설명 된 메서드는 exogenous 항 바인딩과 그물 관련 저하 크로스-프레 젠 테이 션에 의해 처리 됩니다 세포질 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다.

Abstract

수지상 세포 (Dc)는 고도의 처리 및 중요 한 조직 적합성 클래스 (MHC)에 따라 내 면된 외 인 항 원 제시의 나 분자 라고 크로스-프레 젠 테이 션 (CP). CP는 중요 한 역할 뿐만 아니라 순진한 CD8 자극⁺ T 세포와 CD8 메모리⁺ T 세포에 대 한 감염 및 self-acting의 비활성화에 뿐만 아니라 종양 면역 naïve T 세포 T 세포 아 또는 T 셀 삭제. CP의 중요 한 분자 메커니즘 해명 될 남아, 비록 축적 증거가 나타냅니다 exogenous 항 저하를 통해 떠다니고 그물 관련 (ERAD) 비 클래식에서 수출 후 endocytic 처리 됩니다. 구획입니다. 최근까지, 외 인 항 원 이외의 아무 특정 분자 마커 있었기 때문에 이러한 endocytic 구획의 characterizations을 제한 했다. 여기에 설명 된 메서드는 이러한 endocytic 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다. 이 순화 microsome 사용 하 여, 우리 재구성 ERAD 같은 전송, ubiquitination, 및 처리는 외 인 항 원에 체 외에, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 수출이 후 외 인 항 원 처리 제안 세포질 구획입니다. 이 프로토콜은 CP의 분자 메커니즘을 명확 하 게 다른 세포 유형에 더 적용할 수 있습니다.

Introduction

MHC I 분자 cytosol¹에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 처리 되는 내 인 성 항에서 파생 하는 짧은 항 원 펩 티 드와 모든 nucleated 세포의 표면에 표현 된다. 처리 후, 항 원 펩 티 드 펩 티 드 운송업 자 탭에 의해 바인딩과 그물 (응급실) 루멘으로 이송 됩니다. ER의 루멘에서 일련의 특정 보호자 펩 티 드 로드 하 고 올바른 접는 MHC의 나 복잡 한 지원 합니다. 분자의이 시리즈는 펩 티 드 로드 복잡 한 (PLC), 응급실 펩 티 드 나²MHC에 적재에 대 한 중앙 구획을 나타내는 이라고 합니다. 후에 펩 티 드, 로드는 MHC I 분자 세포 표면에 수송 하 고 핵심적인 역할을 담당할 적응 면역 시스템에 자기 마커, 그리고 수는 CD8⁺ 세포 독성 T 세포 (Ctl) 암 세포 또는 전염 성 요원을 항 원에 의해 ³비 각자 단백질 펩 티 드.

항 원 제시 세포 (APC), 외 인 항에서 항 원 펩 티 드에서는 또한 내가^4,5,6,,78 통해 CP, 주로 수행 MHC 시 제시 의해 Dc^9,,1011. CP는 필수⁺ T 순진한 CD8의 활성화를 위한 둘 다 세포와 CD8 메모리⁺ T 세포의 비활성화에 의해 안티 전염 성 및 안티-종양 Ctl^12,13, 그리고 면역 관용의 유지 보수에 자기 행동 naïve T 세포^14,15. 그러나 CP CP의 분자 기계 장치는 아직 자세히 설명 될 적합 한 면역 계통에 많은 중요 한 역할을 재생 합니다. CP의 이전 연구 밝혔다 exogenous 항 모두 응급실에는 endosome 현지 했다 ERAD, ERAD 같은 처리 및 펩 티 드^{16 로드에 대 한 응급실에 외 인 항 원은 endosome에서 이송은 제안 처리} . 그러나, 축적 증거가 나타냅니다 응급실에서 아닙니다 그러나 오히려 응급실 (그림 1)^{17,18의 독특한 기능을가지고 아닌 클래식 endocytic 구획 밖으로 CP의 펩 티 드 로드 수행 ,19,,2021}. Aminopeptidase의 높은 활동에 의해 항 원 펩 티 드 선구자의 저하를 방지 하려면²² cytosol, 처리 및 CP에서 로드 하는 펩 티 드에이 아닌 클래식 endocytic 구획 (그림 1)의 인접 지역에서 발생 합니다. 이러한 endocytic 구획의 characterizations 논란이 있지만, 이외에 외 인 항 원이이 구획에 없는 기존 특정 분자 있다.

ERAD는 세포질 통로, 특히 응급실에서 misfolded 단백질을 제거 하는. ERAD 경로에 misfolded 단백질 retrogradely ER 막 세포질을 통해 운반 되며 유비퀴틴-프로테아좀 시스템^23,,2425처리. 큰 분자, 단백질, 등 지질 bilayer를 통해 수송 된다,이 분자를 통과에 복잡 한 복잡 한 Sec61 및 Derlin ER²⁶, 그리고 복잡 한 톰에 복잡 한 팀 같은 translocon 라는 분자 장치는 미토 콘 드리 아²⁷ 것 추가 항 ER 막 통해 수송 된다, 그들은 translocons, Sec61 복합 등으로 복잡 한 지질 bilayer를 관통 하 게 해야 합니다. 여기 설명 하는 방법을 endocytic 구획에 대 한 표식으로이 막 관통 분자를 이용 하 여 타겟된 기를 정화.

여기에 설명 된 방법은 외 인 항 원으로는 DC 같은 셀 선 DC2.4²⁸ 와 biotinylated ovalbumin (bOVA)를 사용 하 여 새로운 기 정화 프로토콜입니다. Endocytic 구획 streptavidin (SA)에 의해 순화 되었다-자석 구슬 메이커로 막 관통 bOVA를 사용 하 여. 이 순화 microsome 일부 것 추가 bOVA 여전히 막 분수에 보존 되었다 하지만 microsome, 및 다음 ubiquitinated의 외부에 이송 되었고 처리²⁹ 생체 외에서. 이 순화 microsome endocytic 구획 특정 단백질 뿐만 아니라 ER-상주 단백질 ERAD 및 펩 티 드 복잡 한; 로드 포함 세포질 구획 CP²⁹에 대 한 예비 endocytic 구획 제안. 이 프로토콜은 exogenous 항 원의 종류에 따라 그리고 다른 DC 하위 집합 및 다른 세포 유형, 대 식 세포, B 세포, 내 피 세포, 등 실력 CP에 대 한 Dc의 정확한 분자 메커니즘을 명확 하 게 적용 됩니다.

Protocol

1. 성장 세포와 외 인 항 원 추가

biotin 단백질 라벨을 사용 하 여

1. 준비 bOVA 키트 제조 업체에 따라 ' s 프로토콜.
   참고: 일반적으로, bOVA 포함 2 M biotin 1 M OVA 당 평균.
2. 성장 DC2.4 셀 RPMI-1640 2mm L-글루타민, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산, 100 U/mL 페니실린-스, 55 m m 2-mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7.5), 및 5에서 37 ° C에서 10% 태아 종 아리 혈 청 (여기서 부터는 RPMI)와 보충 습도 인큐베이터에서 % CO ₂ (이 언급 없이 세포는 인 큐베이 팅이 조건에서). 그것은 또한 DMEM 10% 태아 종 아리 혈 청 RPMI 대신 NaHCO ₃ (여기서 부터는 DMEM) 3.7 g/L 보충을 사용 하 여.
3. 주 정화, 전에 분할 RPMI의 셀 사용 하 여 조직 문화 접시에 1 x 10 ⁵ 셀/ml. Confluent 상태에서 세포를 유지 하지 마십시오. DC2.4 셀 매우 반 confluent 상태로까지 외 인 항 원을 통합할 수 있지만 빠르게 오버 합칠 상태에 도달 후 능력을 잃고.
4. DC2.4 전에 세포는 반 confluent 1 x 10 ⁶ 셀/ml bOVA의 250 µ g/mL을 추가 하 고 2-4 헤에 대 한 품 어
   참고: 다운스트림 실험 동안 모든 버퍼 및 시 약 보관 4 ° C에서 달리 명시 하지 않는 한.

2. Microsomes의 준비

1. 새 50 mL 원뿔 관으로 조직 접시에서 부드러운 pipetting으로 DC2.4 세포를 수확.
2. 5 분, 4 ° C 1000 x g에서 원심 분리기와 포부에 의해 bOVA와 매체를 조심 스럽게 제거.
3. DC2.4 셀 1000 x g 5 분, 4 ° C에서 원심 분리 하 여 PBS 버퍼 (1.37 m m NaCl, 8.1 m 나 ₂ HPO ₄, 2.68 m KCl, 1.47 m m KH ₂ 포 ₄ m m)의 40 mL로 두 번 세척 하 고 상쾌한 포부에 의해 때마다 삭제.
4. Resuspend 단계 2.3에서 1-2에서에서 펠 릿 mL (문화 매체의 1/20-1/10 볼륨) 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 전송 resuspended DC2.4의 1/1000 양으로 균질 매체 (0.25 M 자당, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4])의 세포에 얼음 처럼 차가운 Dounce 균질 화기.
5. 차가운 Dounce 균질 화기와 10-20 스트로크에 의해 resuspended DC2.4 세포를 부드럽게 중단.
   참고: 중단 단계 동안 Dounce 균질 화기는 냉각 얼음에
6. 새 15 mL 원뿔 튜브 셀 중단 중지 전송.
7. 10 ml 총 8-9 mL 균질 매체를 추가 하 고 원뿔 튜브 2000 g x 4에서 10 분 원심 ° c.
8. 새 15 mL 원뿔 튜브 손상 되지 않은 세포와 핵, 제거 하는 상쾌한 전송 및 2000 g x 4에서 10 분 동안 다시 원뿔 튜브 원심 ° c.
9. 새로운 ultracentrifugation 튜브와 g x 100000 및 4에서 45 분 동안 원심 분리기에는 상쾌한 전송 ° c.
10. 는 상쾌한 발음 하 고 다운스트림 실험 microsome 분수를 만들기 위해 여러 번 위아래 솔루션 pipetting으로 펠 릿 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 양으로 균질 매체의 1-2 mL에 신중 하 게 resuspend.
11. 새 5 mL 둥근 바닥 관으로 microsome 분수 전송.
    참고:이 단계 후에 그것은 제조 업체에 따르면 iodixanol 밀도 그라데이션 원심 분리에 의해 객관적인 microsomes을 풍부 하 게 ' s 프로토콜, 일반적인 microsomes를 제거 하려면. 외 인 항 원에 대 한 피크 분수 및 수집한 다음 정화 (3 단계)의 다음 단계로 들어서는.

3. BOVA와 Microsomes의 정화를 받고 ERAD

microsome 분수의 단계 2.11 5 mL

1. 신선한의 추가 1/100 볼륨 SA 자석 구슬 원형 하단 튜브.
   참고:이 단계를 하기 전에 그것은 미리 microsome 분수를 줄이기 위해 일반적인 microsomes의 오염 제어 자석 구슬에 의해 취소.
2. 부드럽게 잘 혼합 하 고 4 시 30 분 동안 천천히 라운드 하단 튜브를 회전 ° c.
3. 라운드 하단 튜브에 총 4 mL에 균질 매체의 2-3 mL를 추가 하 고 부드럽게 잘 섞어.
4. 라운드 하단 튜브 마그네틱 스탠드에 놓고 4 ° c.에서 10 분 동안 품 어 이후는 소포에 바인딩된 구슬 자석에 끌리는, 갈색 마이크로 구슬 점차적으로 자석에 가장 가까운 튜브 벽에 축적 됩니다.
5. 튜브와 함께 신중 하 게 언바운드 소포를 제거 하는 열망에 의해 여 supernatants를 버리고 마그네틱 스탠드에 남아.
6. 자석 구슬 자석에 의해 균질 매체의 5 mL로 두 번 소포에 바인딩된 워시 4 ° C에서 10 분 서 하 고 신중 하 게 열망 하 여는 상쾌한 때마다 삭제.
   참고: 마그네틱 스탠드, 10 분, 2000 x g에서 centrifugations에 의해 정화 없이 4 ° C는 또한 사용할 수.
7. 자석 구슬 몇 번 위아래로 솔루션 pipetting 100 µ L 균질 매체에 신중 하 게 소포를 준수할 resuspend.
8. 다운스트림 실험에 대 한 정화 microsome로 새로운 microtube에 resuspended 소포 전송.
   참고: 일반적으로, 1 x 10 ⁷ 셀에서 5-20 µ g 단백질을 포함 하는 50 µ L microsome 분수 고립 될 수 있다.

4. 순화 Microsomes의 분석

1. Resuspend 자석 구슬에서 소포에 바인딩된 TNE 버퍼의 100-200 µ L 3.8 단계 (20 mM Tris HCl pH 7.4, 150 m m NaCl, 0.5 M EDTA, 1% Nonidet P-40) 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 볼륨 균질 매체 대신.
2. 는 lysate에서 전송 단계 4.1 새로운 1.5 mL microtube.
3. 제조 업체 당 BCA 분석 결과 키트를 사용 하 여 단계 4.2의 단백질 농도 결정 ' s 프로토콜.
   참고: 일반적으로 5-10 µ L 단계 4.2에서에서 lysate 단백질 농도 결정 하기 위해 충분 하다.
4. 는 lysate에서 전송할 단계 (실버 얼룩에 대 한 단백질의 2 µ g 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 위한 단백질의 10 µ g) 4.2 새로운 microtubes.
5. SDS 겔-로딩 버퍼 x 1에서 95 ° C와 종 단백질에서 열 블록에 있는 microtubes를 넣어 (100 mM Tris HCl pH 6.8, 200 m m dithiothreitol, 4 %SDS, 0.2 %bromophenol 블루, 20% 글리세롤) 5 분에 대 한
6. 21500 g x 4에서 10 분 동안 microtubes 원심 ° C. 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtubes에 있는 supernatants 수집.
7. 단계 4.6 (2 µ g) 표준 SD-페이지에서 해결된 단백질 분석.
8. 시각화 실버 얼룩은 얼룩을 사용 하 여 단백질 밴드 키트 제조 업체에 따라 ' s 프로토콜.
9. 표준 SD-페이지와 서 부 럽 4.6 (10 µ g) 단계에서 확인 된 단백질 분석. 시 약 (SA-HRP)를 사용 하 여 제조 업체 당 ' s 프로토콜 및 fluorography에 의해 시각화.

5. 생체 외에서 BOVA 사용 하 여 정화 Microsomes의 ERAD Ubiquitination의 재구성

단계 3.8 reticulocyte lysate (RL)의 50% 볼륨으로 반응 버퍼 (50 mM Tris pH 7.4, 3mm ATP, 0.5 m m MgCl x 1에서에서

1. 이전에 순화 microsomes (5-10 µ g 단백질) ₂), 그리고 새로운 microtube에 플래그 태그 유비퀴틴 오후 0 시 2 분. 이 실험의 최종 볼륨은 20-40 µ L.
2. 품 37에서 2 h microtube ° C.
   참고: 단계 5 월 12 일에서에서 ubiquitinated bOVA 양의 서쪽 blotting에 의해 감지 너무 작으면, 추가 10 µ M의 MG132 또는 proteasomes에 의해 ubiquitinated bOVA의 처리를 억제 하는 lactacystin의 2 µ M.
3. 얼음에 microtube 배치 하 여 반응을 중지
4. 는 microsomes 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 1/1000 양으로 500 µ L TNE 버퍼를 추가 하 여 해결.
5. 21,50에서 10 분 원심 분리기는 microtubeg와 4 x는 0 ° c.에 생체 외에서 ubiquitination 분석 결과 전에 DC2.4에서 ubiquitinated bOVA 포함 하는 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtube는 supernatants 수집.
6. 는 상쾌한 새로운 microtube 전송과 새로운 SA 자석 구슬 (일반적으로 5 µ L supernatants의 500 µ L에 대 한)의 1/100 볼륨 추가.
7. 부드럽게 잘 혼합 하 고 30 분 동안 천천히 microtube 4 회전 ° c.
8. Microtube 21500 g x 4에서 10 분 원심 ° C. 삭제 bOVA 및 ubiquitinated bOVA 열망 하 여 상쾌한 바운드 SA 자석 구슬.
9. TNE 버퍼의 1 mL와 함께 두 번 수집된 사 자석 구슬 21500 g x 4에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 세척 ° C. 삭제 상쾌한 포부에 의해 각 시간.
10. SA 자성 구슬에 의해 순화 된 단백질을 해결 하기 위해 열 블록에 95 ° C에서 5 분에 대 한 버퍼를 로드 하는 SDS 젤 x 1에 SA 자석 구슬 종.
11. Microtube 21500 g x 4에서 10 분 원심 ° C에 불용 성 부분을 제거 하는 새로운 microtube는 supernatants 수집.
12. 분석 표준 SD-페이지 및 서쪽 더 럽 히는 단백질에 준수할 SA 자석 구슬. (안티, 안티-멀티-Ub, 깃발과 반대로 마우스 IgG HRP) 항 체 및 시 약 (SA-HRP)의 사용은 제조 업체 당 ' s 프로토콜 및 fluorography에 의해 시각.

Results

CP의 분자 메커니즘을 명료 하 게 그것은 exogenous 항 ERAD와 같은 전송 및 처리를 받아야 세포질 구획을 식별 하는 데 필요한. Immunofluorescent 현미경 또는 전자 현미경 관찰 어디 외 인 항 원^{16,,1718,19, 축적 된 세포질 구획을 확인 하는 동안 30,31,,3233}, exogenous 항의 ERAD 같은 처리에 대 ...

Discussion

CP의 이전 연구에서 통합된 외 인 항 원 immunofluorescent 현미경 검사 법^16,30,,3132에 의해 늦은 endosome 또는 응급실의 제한 된 영역에서 축적 된. 세포질 구획은 자당 또는 iodixanol 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 식별 되는 ERAD와 같은 전송 및 외 인 항 원 처리 수행 됩니다 응급실 또는 늦은 endosome의 이러한 전문된 분야에서 추정 된다 ubiquitinated는 ERAD 같은 처리 마커로 bOVA. 그들의 타고 난 면역 자극 후 CP 효율은 크게 증가, 그리고 높은 밀도 분수 (게시 되지 않은 결과) ubiquitinated bOVA 함께 bOVA의 피크 분수 마이그레이션. 이러한 실험의 목표 응급실 또는 bOVA 또는 ubiquit...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
소 태아 혈청	Equitech bio	SFB30
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
-메르캅토에탄올	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
페니시실린-스렙토마이신	gibco by life technologies	15140-122
DMEM	gibco by life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
비오틴 단백질 라벨링 키트	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz, Biotechnology	, 201270
lactacystin	SIGMA	L6785
Dounce homogenizer	IUCHI	131703
프로테아제 억제제 칵테일	SIGMA	P8340
요오딕산올	Cosmo, bio	1114542
SA-마그네틱 비드	New England Biolabs	201270
제어 마그네틱 비드	Chemagen	M-PVA012
마그네틱 스탠드	BD Biosciences	552311
BCA 단백질 분석 키트	Thermo Fisher Scientific	23225
실버 염색 키트	Cosmo bio	423413
Reticulocyte Lysate	Promega
플래그 태그가 지정된 유비퀴틴	SIGMA	U5382
항 ovalbumin (OVA, 마우스)	항체 상점	HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (마우스)	MBL	D058&마이너스;
안티 플래그(마우스)	SIGMA	F3165
트립신	SIGMA	85450C