방법 논문

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

DOI:

10.3791/55955

⸱

2017년 7월 22일

 ,  ,  , 
1London Research and Development Centre, Agriculture & Agri-Food Canada, 2Department of Biology, University of Western Ontario, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Western Ontario

이 논문에서

요약

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기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다.

초록

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복잡한 식물 - 미생물 신호 처리 과정을 묘사하기 위해서는 자연 식물 - 미생물 상호 작용을 모방 한 실험 설계가 매우 중요합니다. 애기 장대 - Agrobacterium tumefaciens 박테리아의 병인 및 식물 상호 작용을 연구하기위한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 식물 - 아그로 박테 리움 상호 작용에 대한 이전의 연구는 주로 식물 세포 현탁 배양, 식물의 인공 상처 또는 합성 화학 물질에 의한 미생물 독성 인자 또는 식물 방제 의 인공 유도에 크게 의존해왔다. 그러나 이러한 방법은 식물과 미생물이 공간적, 시간적 방식으로인지하고 반응하는 식물의 자연 신호 와 구별된다. 이 작품은 손상되지 않은 식물이 금속 메쉬 스크린에 의해지지되고 아그로 박테 리움 과 함께 배양되는 수경 공동 배양 시스템을 제시합니다. 이 공동 배양 시스템에서, 합성 피토 호르몬 또는 micr을 유도하는 화학 물질obial 독성 또는 식물 방어는 보충된다. hydroponic cocultivation 시스템 은 planta의 자연 식물 - 미생물 상호 작용 및 신호 항상성과 매우 유사합니다. 식물 뿌리는 아그로 박테 리움을 함유하는 배지로부터 분리 될 수 있고, 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물의 신호 및 반응은 동시에 체계적으로 조사 될 수있다. 특정 시점 / 간격에서, 식물 조직 또는 박테리아는 다양한 "omics"분석을 위해 별도로 수확 될 수있어이 시스템의 효능과 효과를 입증합니다. 수경 공동 배양 시스템은 1) 다양한 식물 미생물 시스템의 상호 신호 전달, 2) 식물 숙주와 여러 미생물 종 ( 예 : 미생물 협회 또는 미생물) 간의 신호 전달, 3) 영양소와 화학 물질의 관련성 연구 4) 미생물이 식물 숙주와 어떻게 상호 작용하고 생물학적 인 o에 대한 식물 내성에 기여하는지r 비 생물 적 스트레스.

서론

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식물과 관련된 미생물은 생물 지구 화학적 순환, 생물학적 복원, 기후 변화 완화, 식물 성장 및 건강, 생물학적 및 비 생물 적 스트레스에 대한 식물 내성에 중요한 역할을한다. 미생물은 식물 세포 벽 접촉을 통해 간접적으로 화학 분비 및 신호 1 , 2 , 3을 통해 식물과 상호 작용합니다. 침착성 유기체로서 식물은 병원균에 의한 감염을 막기위한 직접 및 간접적 인 기작을 개발해 왔습니다. 직접 방어에는 구조적 방어와 방어 단백질의 발현이 포함되지만 간접 방어에는 2 차 식물 대사 산물 생성 및 침입 병원체에 대항하는 유기체의 인력이 포함됩니다 4 , 5 . 식물에서 추출한 뿌리 삼출물, 분비물, 점액, 점액 및 용 해물은 rhizosphere의 물리 화학적 성질을 변화시켜 끌어들이거나 밀어 낸다.그들의 숙주에 대한 미생물 6 . 뿌리 분비물의 화학적 조성은 종 특이 적이며, 이로 인해 rhizosphere에서 이러한 화합물을 인식 할 수있는 특정 미생물을 허용하는 선택 필터 역....

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프로토콜

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1. 실험 계획법

  1. 실험의 구체적인 목표를 결정하십시오.
  2. 아래의 전체 프로토콜을 읽으십시오. 특정 목표와 관련된 섹션과 수정이 필요한지 여부를 결정하십시오. 예제는 아래를 참조하십시오.
    1. 실험에서 A. thaliana 식물과 A. tumefaciens 박테리아 (아래 참조) 또는 다른 식물 - 미생물 조합을 사용할 것인지 고려하십시오.
      참고 : 다양한 식물 종을 사용할 수 있지만 식물 뿌리의 두께는 다른 크기의 메쉬 (단계 3.3) 및 성장 매개 변수 (단계 3.10-3.11 및 4.4)와 수경 재배 탱크 크기 및 중간 체적 (단계 4.2)도 조정이 필요할 수 있습니다 ( 그림 2 ). 미생물은 순수 배양 물, 혼합 종 (컨소시엄) 또는 환경 시료 (미생물)로 쉽게 접종 할 수 있지만, 변경 사항은 프로토콜, 특히 4.5 단계에 영향을 줄 수 있습니다.
    2. 고려하다샘플을 분석하는 데 사용할 실험 유형
      참고 : 형광 현미경 (단계 5)은 형광 리포터 구조로 분류 된 유기체를 필요로합니다.
  3. 적절한 컨트롤을 디자인하십시오. 제어 박테리아와 박테리아가 접종되지 않은 ....

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결과

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수경 재배 동시 재배 시스템의 성장

A. tumefaciens C58의 성장 곡선은 초기 16 시간의 동시 배양에서 유의 한 지연 단계를 나타내었고, A. thaliana Col-0과 공동 재배 할 때 매우 안정한 성장을 보였으며, 최대 OD 600 은 48 h postinoculation. 대조적으로 A. thaliana가 없는 대조 배양에서는 본질적으로 박테리아 성장이 관찰되지 않았다 ( 그림 4 ). 이러한 결과는 인위적으로 공급되는 추가 영양소없이 식물 뿌리 분비 화합물이 수경법 공동 배양 시스템에서 아그로 박테 리움 성장을 지원할 수 있음을 시사한다. 공동 배양의 초기 16 시간 동안의 유의 한 지연 단계는 병원체와의 공.......

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토론

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뿌리 분비의 점진적인 특성을 감안할 때, planta에서 생산 된 독성 유발 화학 물질의 농도와 역동적 인 식물 - 미생물 상호 작용에 미치는 영향은 공간적 및 시간적 변화에 따라 발생합니다. 이 수경 재성 공동 재배 시스템에는 미생물 독성이나 식물 방어를 유도하는 합성 식물 호르몬이나 화학 물질이 보충되지 않습니다. 대조적으로, 종래의 접근법을 사용하여, 아세토 독 온온 (acetosyringone)과 같은 합성 화학 물질의 첨가는 갑작스러운, 인위적인 농도의 스파이크를 생성한다. 따라서이 수경 공동 배양 시스템은 미생물 및 숙주 식물이 공간적 및 시간적 매너를 인식하고 반응하는 자연 환경을보다 가깝게 모방합니다.

여기에서 Agrobacterium 독성 유전자가 Arabidopsis 와의 공동 배양시에 활성화되었음을 입증 할 수 있었다. 이것은 천연 식물 유래 화학 물질이 아그로 박테 리움 독성.......

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

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그들의 도움과 유용한 토론에 대해 Brian Weselowski와 Alexander W. Eastman에게 감사드립니다. 우리는 또한 Drs. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui, Greg Thorn의 도움을 받았고 유용한 토론과 원고를 읽었습니다. 이 연구는 농업 및 농업 식품 캐나다 (Agriculture and Agri-Food Canada), Growing Forward-AgriFlex (RBPI 번호 2555) 및 Growing Forward II 프로젝트 번호 1670의 자금 지원을 받아 작성되었습니다. 이 연구는 또한 ZC Yuan에게 수여 된 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC) 디스커버리 그랜트 RGPIN-2015-06052에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
식물 씨앗 (Arabidopsis thaliana Col-0)애기장대 생물 자원 센터CS7000https://abrc.osu.edu/order-stocks
박테리아 (Agrobacterium tumefaciens C58)워싱턴 대학교N / A
라벨링 박테리아사내선택 사항, 다운 스트림 분석
소용돌이(다양한)
에 따라 다름마이크로 원심 분리기 튜브(다양한)
마이크로 원심분리기(다양한)
5% 차아염소산나트륨(다양한)
이중 증류수(다양한)
오토클레이브(다양한)
마이크로피펫 (각)
70% 에탄올(각종)
무라시게와 스쿠그(MS) 기저염시그마-알드리치M5524
자당(각종)
MES(각종)
B5 비타민 믹스시그마-알드리치G1019
피토아가르(각종)
깊은 Petri 접시(다양한)
스테인레스 스틸 메쉬Ferrier Wire Goods Company LtdN/A등급: 304; 메쉬 수: 40 × 40; 와이어 DIA: 0.01
micropore tape, 1"3M1530-1
일주일 성장 챔버(다양한)
원통형 유리 탱크, 100 × 80 mm Pyrex3250다른 크기를 사용할 수 있으며, 이 경우 액체 함량 조절이 필요할 수 있습니다
후드(각종)
셉트(각종)
효모 추출물(각종)
트립톤(각종)
MgSO4(각종)
진탕 인큐베이터(각종)
분광 광도계(각종)
NaCl(각종)
셰이커(각종)
가위(각종)옵션, 다운스트림 분석에 따라 다름
형광 현미경(각)옵션, 다운스트림에 따라 다름
현미경 슬라이드 및 커버 슬립(다양함)선택 사항, 다운스트림 분석에 따라 다름
매니큐어(다양함)선택 사항, 다운스트림 분석에 따라 다름
박테리아 RNA 추출 키트(다양함)선택 사항, 다운스트림 분석에 따라 다름
식물 RNA 추출 키트(RNeasy Plant Mini Kit)Qiagen74903 또는 74904선택 사항, 다운스트림 분석에 따라
다름 qRT-PCR용 재료 및 장비선택(다양함),다운스트림 분석
재료 및 마이크로어레이 분석을 위한 장비에(다양함),다운스트림 분석에 따라
다름 액체 질소(다양함)선택 사항, 다운스트림 분석
모르타르 및 유봉(각종)선택 사항, 다운스트림 분석
0.2 µ에 따라 다름; m 기공 필터(다양)옵션, 다운스트림 분석에 따라 다름
50mL 코니컬 튜브(다양)옵션, 다운스트림 분석에 따라 다름
동결 건조기(다양)옵션, 다운스트림 분석에 따라 다름
밀봉 가능한 시험관(다양)옵션, 다운스트림 분석에 따라 다름
에틸 아세테이트(각종)선택 사항, 다운스트림 분석에 따라 다름
질소 가스(다양한)옵션, 다운스트림 분석
재료 및 장비에 따라 HPLC(다양한)옵션, 다운스트림 분석
재료 및 장비에 따라 ESI-TOF-MS용선택, 다운스트림 분석에 따라 다름
.유량 분석 따라 다름에 따라 다름 재료 및 장비

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
  2. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799....

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Agrobacterium TumefaciensArabidopsis Thaliana

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