공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

Summary

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

Abstract

엔지니어링 vascularized 조직을 생성 하 고 organoids 역사적으로 도전 하고있다. 여기는 다층 히드로 microfiber 인터레이스는 비 계 생성을 미세 bioprinting에 따라 새로운 방법에 설명 합니다. 부드러운 달성 bioprinting, 복합 bioink 배합 코어 흐름과 칼 흐름에 의해 운반 가교 솔루션에서 돌출을 포함 하는 핵-칼 미세 프린트 헤드 설계 하 고는 bioprinter에 장착. Alginate와 젤라틴 methacryloyl (GelMA)를 혼합 하 여 즉석 이온 가교의 존재를 겪 습 다 당 류 영구 안정화를 달성 하기 위해 GelMA 구성 요소의 보조 photocrosslinking 뒤 divalent 이온을 선택,이 bioprinting 전략을 사용 하 여 microfibrous 비 계를 얻을 수 있었습니다. 중요 한 것은, bioprinted microfiber 안에 캡슐화 된 내 피 세포는 16 일 문화에 걸쳐 있는 맥 관 구조를 닮은 루멘-같은 구조를 형성할 수 있습니다. Endothelialized microfibrous 비 계는 microfiber의 틈새 공간으로 보조 셀 형식의 후속 시드 통해 vascularized 조직을 구성 하 혈관 침대 추가 사용할 수 있습니다. 미세 bioprinting vascularized 조직에 높은 충실도의 편리한 공학 일반화 된 전략을 제공합니다.

Introduction

조직 공학 목표 생성 기능 조직 대체 대체, 복원, 또는 그 부상 또는 질병 인체^1,2,3,4, 종종 원하는 세포 유형, 생리 활성 분자^5,6및 생체 재료^7,8,,910의 결합을 통해 증대 하는 데 사용할 수 있습니다. 더 최근에, 조직 공학 기술은도 점점 채택 되었습니다 모델을 생성 하 체 외에 조직과 기관 그들의 비보에 대응, 기존의 지나치게 간소화 평면 셀 문화^{11,12,13,14<....}

Protocol

이 프로토콜에 사용 되는 신생아 쥐 cardiomyocytes 잘 설립 절차⁵⁶ 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Brigham와 여자의 병원에 의해 승인에 따라 2 일 된 Sprague-Dawley 쥐에서 분리 했다.

1입니다.는 Bioprinter의 계측

1. 듀얼-레이어, 동심 미세 프린트 헤드; 생성 하 칼 집으로 큰 무딘 바늘 (예를 들어, 18 G, ½ 인치)의 중심으로 핵심으로 (예를 들어, 27 G, 1 인치)의 작은 무뚝뚝한 바늘 삽입 코어 바늘 약간 튀어나온 다는 것을 확인 (~ 1 m m) 외피 (그림 1A) 이상. 맞춤 팁와 동심 맞춤 지원 하기 위해 총 신 옆에 내부/외부 바늘 사이 적절 한 크기의 필요한 스페이서 일시적으로 끼여 경우 될 수 있습니다 하지만 일반적으로 수동으로 조정 됩니다. 에폭시 접착제로 배럴의 봉인 고 때 적용 가능한 팁 사이드에서 맞춤 스페이서를 제거 합니다.
2. 반대 방향에서 중앙 바늘의 배럴에서 다른 바늘 (23 G)를 삽입 합니다.  다음 외부 바늘의 배럴의 측면에 구멍을 생성 하 고 에폭시 접착제 씰링 뒤....

Results

미세 bioprinting 전략 낮은 점도 bioinks^54,55를 사용 하 여 microfibrous 장비의 직접 압출 bioprinting 수 있습니다. 같이 그림 2A, 한 비 계 6 × 6 × 6 m m의 크기와³ 포함 된 > microfiber의 30 레이어 10 분 이내 bioprinted 수 있습니다. CaCl₂ alginate 구성 요소의 즉각적인 이온 가교 과정에서 bioprinting의 최고 보기 및 사이드 보기 그림 2B와2c에 표시 된 대로 bioprinted microfibrous 발판의 장기적인 안정성을 보장 GelMA 컴포넌트의 이후 실제 photocrosslinking 동안 우수한 .......

Discussion

동축 프린트 헤드의 코어와 칼 집에서 교차 결합 시키는 대리인에서 두는 bioink의 동시 전달 수 있도록 성공적인 미세 bioprinting 향한 중요 한 단계를 나타냅니다. 이 프로토콜에서 예제 프린트 헤드 포탄으로 핵심 및 18 G 바늘 27g 바늘을 사용 하 여 만든, 동안 다양 한 조합 바늘의 다른 크기를 사용 하 여 쉽게 확장할 수 있습니다. 그러나, 흐름의 변화에서 결과 각 단계에 전달, 바늘 크기에서 변경 모두는 bioink (개별적으로 조절 가능한 듀얼 채널 하나 대신 두 개의 주사기 펌프를 사용 하 여), 교차 결합 시키는 대리인 및 잠재적으로 bioprinter에 의해 발생 한 증 착 속도의 흐름 속도의 더 최적화를 요구할 것 이다.

현재 프로토콜에서 매개 변수 (바늘 크기, 흐름 율 및 증 착 속도)의 조합 증 착, 보통⁵⁵에서 평형 후 대략 150 µ m 팽창 직후 약 120 µ m의 직경을 가진 bioprinte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
갈조류에서 추출한 알긴산 나트륨 염	Sigma-Aldrich	A0682	BioReagent, 식물 세포 배양 테스트, 저점도, 분말
돼지 껍질에서 추출한 젤라틴 A형	Sigma-Aldrich	G2500	겔 강도 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)Sigma-Aldrich		410896	98%
HEPES 완충액	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0 - 7.6, 멸균 필터링, BioReagent, 세포 배양에 적합
태아 소 혈청	Thermo Fisher Scientific	10438026	적격, 열 불활성화, USDA 승인 지역
염화칼슘 이수화물	Sigma-Aldrich	C5080	BioXtra, ≥ 99.0%
산염 완충 식염	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4
인간 제대 정맥 내피 세포	Angio-Proteomie	cAP-0001	인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)
GFP 발현 인간 배꼽 정맥 내피 세포GFP-Proteomie		cAP-0001GFP	GFP 발현 인간 배꼽 정맥 내피 세포(GFPHUVEC)
내피 세포 성장 배지	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit
Dulbecco' s 수정된 독수리 미디엄	Thermo Fisher Scientific	12430054	고포도당, HEPES
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Ellsworth 접착제	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	투명 0.5kg 키트
UV 경화 램프 시스템	Excelitas Technologies	OmniCure S2000	Spot UV 광 경화 시스템(지능형 UV 센서 포함