공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

요약

우리 어디 보조 세포 유형 수 더 시드할 수이 microfibrous 구조 vascularized 조직 및 organoids를 생성 하는 틈새 공간으로 microfibrous 혈관 침대 엔지니어링에 대 한 미세 bioprinting 전략에 따라 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다.

초록

엔지니어링 vascularized 조직을 생성 하 고 organoids 역사적으로 도전 하고있다. 여기는 다층 히드로 microfiber 인터레이스는 비 계 생성을 미세 bioprinting에 따라 새로운 방법에 설명 합니다. 부드러운 달성 bioprinting, 복합 bioink 배합 코어 흐름과 칼 흐름에 의해 운반 가교 솔루션에서 돌출을 포함 하는 핵-칼 미세 프린트 헤드 설계 하 고는 bioprinter에 장착. Alginate와 젤라틴 methacryloyl (GelMA)를 혼합 하 여 즉석 이온 가교의 존재를 겪 습 다 당 류 영구 안정화를 달성 하기 위해 GelMA 구성 요소의 보조 photocrosslinking 뒤 divalent 이온을 선택,이 bioprinting 전략을 사용 하 여 microfibrous 비 계를 얻을 수 있었습니다. 중요 한 것은, bioprinted microfiber 안에 캡슐화 된 내 피 세포는 16 일 문화에 걸쳐 있는 맥 관 구조를 닮은 루멘-같은 구조를 형성할 수 있습니다. Endothelialized microfibrous 비 계는 microfiber의 틈새 공간으로 보조 셀 형식의 후속 시드 통해 vascularized 조직을 구성 하 혈관 침대 추가 사용할 수 있습니다. 미세 bioprinting vascularized 조직에 높은 충실도의 편리한 공학 일반화 된 전략을 제공합니다.

서론

조직 공학 목표 생성 기능 조직 대체 대체, 복원, 또는 그 부상 또는 질병 인체^1,2,3,4, 종종 원하는 세포 유형, 생리 활성 분자^5,6및 생체 재료^7,8,,910의 결합을 통해 증대 하는 데 사용할 수 있습니다. 더 최근에, 조직 공학 기술은도 점점 채택 되었습니다 모델을 생성 하 체 외에 조직과 기관 그들의 비보에 대응, 기존의 지나치게 간소화 평면 셀 문화^{11,12,13,14,15,,1617,18,19}의 대체 약물 개발 등 응용 프로그램의 중요 한 기능을 모방 하는. 두 경우에는 복잡 한 마이크로 아키텍처와 인간의 조직의 계층 구조를 정리 하는 능력은 설계 조직¹⁰의 기능 활성화에 중요 한 되며 특히, 설계 조직으로 혈관 네트워크를 통합 하는 방법을 수요의 vascularization 필드^20,21,,2223가장 큰 과제 중 하나 선물 때문.

날짜 하려면, 다양 한 접근법이 점에서 성공⁸의 다양 한 학위와 설계 조직 구조에 혈관 구조를 구축 하기 위해에서 개발 되었습니다. 예를 들어 자기 집합 내 피 세포의 수 microvascular 네트워크²⁴;의 세대에 대 한 신생 성장 인자 전달 유도 지속적인된 neovascularization^25,26; 혈관 조상 세포의 사용 및 pericytes 용이 내 피 세포 성장 및 어셈블리^24,27; vascularization^28,29;의 정확한 조음을 가능 하 게 설계 비 계 속성 그리고 셀 시트 기술은 혈관 레이어 링³⁰의 편리한 조작을 위해. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 전략의 맥 관 구조, 자주는 설계 조직 구조 및 따라서 제한 된 재현성 내 혈관의 무작위 배포로 이어지는 공간 패턴을 제어 하는 능력을 부여 하지 않습니다. 지난 몇 년 동안 bioprinting는 이러한 도전, 높은 충실도 및 재현성에 복잡 한 조직 패턴 자동 또는 반자동 방식으로^31,,3233입금의 그들의 비교할 수 없는 다양성으로 인해 솔루션으로 기술 사용의 클래스로 떠오르고 있다. 희생 bioprinting^{34,35,36,,3738}, 포함된 bioprinting^39,,4041, 그리고 속이 빈 구조 bioprinting/biofabrication^{42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,,5253} 는 모든 혈관 또는 vascularized 조직 생성의 가능성을 보여주었다.

또는, microfibrous 건설 기계를 조작 하는 미세 bioprinting 전략 최근 개발 되었습니다, 그리고 alginate 하이브리드 bioink 구성 및 젤라틴 methacryloyl (GelMA) 동심 프린트 헤드 및 염화 칼슘 (CaCl₂) 솔루션의 코어를 통해 전달 된 프린트 헤드^54,55의 외부 칼 집 흐름을 통해 실시 됐다. 후속 photocrosslinking 멀티 레이어 microfibrous 비 계의 영구 안정화를 보장 하는 동안 마이크로 화이버 형성 있도록 alginate 구성 요소의 즉각적인 물리적 가교에 대 한 허용 하는 두 흐름의 공동 압출. 노트, bioprinted microfiber를 캡슐화 하는 내 피 세포 증식 및 유사 관 침대^54,55루멘-같은 구조를 가정 하는 microfiber의 peripheries 향해 마이그레이션을 발견 했다. 이러한 bioprinted endothelialized 혈관 침대 수 이후에 채울 수 원하는 추가 구성 vascularized 조직⁵⁵보조 세포 유형. 이 프로토콜은 따라서 같은 미세 bioprinting 전략 vascularized 조직의 조직 공학 및 organoid 모델링에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 편리한 제조 보장 동심 노즐 설계로 사용의 상세한 절차를 제공 합니다.

프로토콜

이 프로토콜에 사용 되는 신생아 쥐 cardiomyocytes 잘 설립 절차⁵⁶ 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Brigham와 여자의 병원에 의해 승인에 따라 2 일 된 Sprague-Dawley 쥐에서 분리 했다.

1입니다.는 Bioprinter의 계측

1. 듀얼-레이어, 동심 미세 프린트 헤드; 생성 하 칼 집으로 큰 무딘 바늘 (예를 들어, 18 G, ½ 인치)의 중심으로 핵심으로 (예를 들어, 27 G, 1 인치)의 작은 무뚝뚝한 바늘 삽입 코어 바늘 약간 튀어나온 다는 것을 확인 (~ 1 m m) 외피 (그림 1A) 이상. 맞춤 팁와 동심 맞춤 지원 하기 위해 총 신 옆에 내부/외부 바늘 사이 적절 한 크기의 필요한 스페이서 일시적으로 끼여 경우 될 수 있습니다 하지만 일반적으로 수동으로 조정 됩니다. 에폭시 접착제로 배럴의 봉인 고 때 적용 가능한 팁 사이드에서 맞춤 스페이서를 제거 합니다.
2. 반대 방향에서 중앙 바늘의 배럴에서 다른 바늘 (23 G)를 삽입 합니다.  다음 외부 바늘의 배럴의 측면에 구멍을 생성 하 고 에폭시 접착제 씰링 뒤 구멍에 일치 하는 크기의 금속 커넥터를 삽입.
3. 2 PVC 튜브를 통해 개별적으로, 듀얼-채널 주사기 펌프는 bioink와 가교 솔루션의 주입을 위해 프린트 헤드의 후미를 연결 합니다. Poly(methyl methacrylate) (PMMA)로 만든 플라스틱 홀더를 사용 하 여 bioprinter의 머리에 압출 기를 탑재 합니다.
   참고: Bioprinter 선택 여부에 따라 달라 집니다. 우리의 경우, 여러 상용 bioprinters에이 설치 성공적으로 테스트 했습니다. 그러나, x-y-z 전동된 스테이지는 어떤 bioprinter, 원칙적으로, 설정 해야이 미세 프린트 헤드의 통합 합니다.

2입니다. Bioprinting Microfibrous 혈관 침대

1. Alginate (4 w/v%, 낮은 점도),⁵⁸, 젤라틴의 methacryloyl (GelMA, 1-2 w/v%)^57,및 photoinitiator Irgacure 2959의 혼합물을 사용 하 여 bioink를 확인 (0.2-0.5 wt.%) 25 m m 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl에 녹아] 탄 술 폰 산 (HEPES 버퍼, pH 7.4) 포함 10 vol.% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS).
2. 10 vol.% 가교 캐리어 액체로 FBS를 들어 HEPES 버퍼에 0.3 M CaCl₂ 의 솔루션을 확인 합니다.
3. Bioprinting, 직전 5-10 분, 0.05 w/v% 트립 신에 의해 치료를 사용 하 여 플라스 크에서 인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs) 해리 그리고 셀 5-10 × 10⁶ 셀/mL의 농도에서 bioink에 resuspend. 플라스틱 정지 균일 분포 되도록 천천히 5 ~ 10 배.
4. 5 µ L/mL의 동일한 흐름 속도에서 듀얼 채널 주사기 펌프를 사용 하 여 bioink/가교 액체의 주입을 시작 합니다. 흐름 그들이 안정 될 때까지 최대 1 분 동안 지속적으로 실행 수 수 있습니다. 그 후, bioprinter 약 4 m m/s (그림 1B)의 증 착 속도 제어 하 여 프린트 헤드의 움직임을 시작 합니다. 이러한 속도 잘 할 수 있습니다 최적의 bioprinting를 보장 하기 위해 각각의 새로운 설치와 튜닝. Bioprinting 프로세스는 일반적으로 실내 온도 (21-25 ° C)에서 실시 하지만이 온도 변경 될 수 있습니다. Bioprinting 프로세스 alginate 구성의 빠른 이온 겔 화 및 microfibrous 비 계 (그림 1B)의 증 착에 대 한 허용 해야 합니다.
5. 발판 bioprinted 후에, 20-30 s (그림 1C)에 대 한 추가 photocrosslinking GelMA 구성 요소, 약 5-10 mW/cm² UV 빛 (360-480 nm)에 의해 화학 겔 화를 달성.
6. Bioprinting 고 가교, 인산 염 버퍼 염 분 제거 초과 CaCl₂(PBS)와 비 계를 씻어 부드럽게. 문화 매체와 최대 16 일 동안 37 ° C와 5 vol.% CO₂ 인큐베이터에서 내 피 세포 성장 매체 (EGM) HUVECs-라덴 microfibrous 비 계 매 2 일 변경. 문화 기간 동안 현미경 HUVECs의 형태학을 모니터링 합니다.

3. 건설 Vascularized 조직

1. 일단은 HUVECs 루멘-같은 구조 (그림 1의D)를 비 계에 microfiber의 peripheries 마이그레이션한, 발판을 검색 하 고 부드럽게 소수 성 표면 (예를 들면, polymethylsiloxane [PDMS]의 슬 래 브)의 표면에 놓습니다. 살 균 필터 종이 사용 하 여 조심 스럽게 모 세관 힘으로 발판의 틈새 공간에서 모든 매체를 제거 하.
2. 즉시 1 10 × 10⁶ 셀/mL 비 계 (그림 1E)의 전체 틈새 공간을 침투 한다 발판 위에 밀도에 매체에 보조 세포 유형 (예를들면, cardiomyocytes)의 현 탁 액의 한 방울 (약 20-40 µ L)를 추가 합니다. 인큐베이터에서 (37 ° C, 5 vol.% CO₂, 95% 상대 습도) 0.5-개별 microfiber에 준수를 셀 수 있도록 2 h에 대 한 이러한 구성 품 어. 아니 눈에 띄는 증발 관찰 되도록 기간 동안 작은 물방울 크기를 모니터링 합니다.
3. 부드럽게 원하는 vascularized 조직 형성 될 때까지 관련 매체에서 어떤 비 부착 한 세포 및 문화 구조를 제거 하는 PBS 목욕에 떨고는 건설 기계를 세척.

결과

미세 bioprinting 전략 낮은 점도 bioinks^54,55를 사용 하 여 microfibrous 장비의 직접 압출 bioprinting 수 있습니다. 같이 그림 2A, 한 비 계 6 × 6 × 6 m m의 크기와³ 포함 된 > microfiber의 30 레이어 10 분 이내 bioprinted 수 있습니다. CaCl₂ alginate 구성 요소의 즉각적인 이온 가교 과정에서 bioprinting의 최고 보기 및 사이드 보기 그림 2B와2c에 표시 된 대로 bioprinted microfibrous 발판의 장기적인 안정성을 보장 GelMA 컴포넌트의 이후 실제 photocrosslinking 동안 우수한 ...

토론

동축 프린트 헤드의 코어와 칼 집에서 교차 결합 시키는 대리인에서 두는 bioink의 동시 전달 수 있도록 성공적인 미세 bioprinting 향한 중요 한 단계를 나타냅니다. 이 프로토콜에서 예제 프린트 헤드 포탄으로 핵심 및 18 G 바늘 27g 바늘을 사용 하 여 만든, 동안 다양 한 조합 바늘의 다른 크기를 사용 하 여 쉽게 확장할 수 있습니다. 그러나, 흐름의 변화에서 결과 각 단계에 전달, 바늘 크기에서 변경 모두는 bioink (개별적으로 조절 가능한 듀얼 채널 하나 대신 두 개의 주사기 펌프를 사용 하 여), 교차 결합 시키는 대리인 및 잠재적으로 bioprinter에 의해 발생 한 증 착 속도의 흐름 속도의 더 최적화를 요구할 것 이다.

현재 프로토콜에서 매개 변수 (바늘 크기, 흐름 율 및 증 착 속도)의 조합 증 착, 보통⁵⁵에서 평형 후 대략 150 µ m 팽창 직후 약 120 µ m의 직경을 가진 bioprinte...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
갈조류에서 추출한 알긴산 나트륨 염	Sigma-Aldrich	A0682	BioReagent, 식물 세포 배양 테스트, 저점도, 분말
돼지 껍질에서 추출한 젤라틴 A형	Sigma-Aldrich	G2500	겔 강도 300
Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)Sigma-Aldrich		410896	98%
HEPES 완충액	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7.0 - 7.6, 멸균 필터링, BioReagent, 세포 배양에 적합
태아 소 혈청	Thermo Fisher Scientific	10438026	적격, 열 불활성화, USDA 승인 지역
염화칼슘 이수화물	Sigma-Aldrich	C5080	BioXtra, ≥ 99.0%
산염 완충 식염	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4
인간 제대 정맥 내피 세포	Angio-Proteomie	cAP-0001	인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)
GFP 발현 인간 배꼽 정맥 내피 세포GFP-Proteomie		cAP-0001GFP	GFP 발현 인간 배꼽 정맥 내피 세포(GFPHUVEC)
내피 세포 성장 배지	Lonza	CC-3162	EGM-2 BulletKit
Dulbecco' s 수정된 독수리 미디엄	Thermo Fisher Scientific	12430054	고포도당, HEPES
Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트	Ellsworth 접착제	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	투명 0.5kg 키트
UV 경화 램프 시스템	Excelitas Technologies	OmniCure S2000	Spot UV 광 경화 시스템(지능형 UV 센서 포함