이 기사에서는 텔로미어 길이의 신속하고 효율적인 직접 측정을 제공하는 수정 된 터미널 제한 단편 분석을 사용하여 텔로미어 길이를 정량화하기위한 자세한 프로토콜을 논의합니다. 이 기술은 텔로미어 길이를 정량화하기 위해 DNA의 다양한 세포 공급원에 적용될 수 있습니다.
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방법 논문
In-gel Hybridization을 이용한 Telomere 길이 정량을위한 수정 된 terminal restriction fragment 분석
이 논문에서
요약
초록
텔로미어 길이를 측정하는 몇 가지 다른 기술이 있습니다. 각각의 장점과 단점이 있습니다. 전통적인 접근 방법 인 Telomere Restriction Fragment (TRF) 분석법은 게놈 DNA 샘플을 제한 효소로 소화시켜 텔로미어 DNA 반복 및 일부 서브 텔로미어 DNA를 남기는 DNA 하이브리드 화 기술을 사용합니다. 이들은 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분리되고, 필터 멤브레인으로 옮겨지고, 화학 발광 또는 방사능으로 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브에 하이브리드 화되어 텔로미어 제한 단편을 시각화한다. 이 접근법은 PCR과 같은 다른 기술보다 많은 양의 DNA를 필요로하지만 세포 집단의 텔로미어 길이 분포를 측정 할 수 있으며 절대 킬로베이스로 표현 된 측정을 허용합니다. 이 원고는 텔로미어 길이를 결정하기위한 수정 된 DNA 하이브리드 화 과정을 보여줍니다. 게놈 DNA는 먼저 제한 효소 (절단하지 않는 게놈텔로미어), 아가 로스 겔 전기 영동으로 분리 하였다. 이어서, 겔을 건조시키고 DNA를 변성시키고 방사성 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브 에 인 시츄 하이브리드 화시킨다. 이 in situ 하이브리드 화는 텔로미어 DNA의 손실을 피하고 신호 강도를 향상시킵니다. 하이브 리다이 제이션 후에, 겔은 형광체 스크린을 이용하여 영상화되고, 텔로미어 길이는 그래프 프로그램을 사용하여 정량화된다. 이 절차는 Drs의 실험실에서 개발되었습니다. Woodring Wright와 Jerry Shay는 텍사스 대학교 남서부 대학교 1 학년 2 학년입니다. 여기에서는 몇 가지 수정 사항을 포함하여이 절차에 대해 자세히 설명합니다.
서론
텔로미어 (telomeres)는 염색체의 말단에 위치하고 있으며, 세포 유전 정보를 보호하는 데 중요한 역할을하는 TTAGGG (인간 염색체상의 서열)의 뉴클레오타이드 반복 서열이다 3 , 4 , 5 . 텔로미어는 수천 개의 염기쌍으로 DNA 복제 중에 나머지 염색체의 무결성을 보호하는 역할을합니다. 염색체 복제가 완벽하지 않아서 염색체의 끝이 완전히 복사되지 않습니다. 이러한 복제의 비효율은 "최종 복제 문제"로 불리고 각 복제 라운드 동안 일부 텔로미어 반복을 잃게됩니다 6 , 7 . 텔로미어 길이는 잃어버린 텔로미어 서열 8 , 9 를 대체하는 효소 인 텔로 머라 아제에 의한 세포 분열 이후에 회복 될 수있다. 그러나, 텔로 머라 아제는결과적으로, 시간이 지남에 따라 텔로미어는 짧아지고 결국 세포 노화가 일어난다. 텔로미어 단축으로 인해 텔로미어는 노화와 노화 관련 질병의 위험성을 나타내는 바이오 마커로 간주됩니....
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프로토콜
1. 게놈 DNA 추출
- 제조 업체의 지침에 따라 상용 DNA 추출 키트를 사용하여 분석 할 세포 (여기, 세포 라인 BJ - hTERT)에서 게놈 DNA 추출을 수행합니다.
- 분광 광도계로 DNA 농도를 측정하십시오. DNA 농도가 100 μg / mL 미만이면 에탄올로 DNA를 침전시키고 TE 완충액 (10 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid), pH 8.0)에 재현 탁하여 DNA 농도를 100-600 μg / mL).
2. DNA 무결성 평가
참고 : 프로토콜의이 부분은 11cm x 14cm 젤이있는 겔 전기 영동 시스템을 사용하여 DNA 무결성 평가를 설명합니다. 다른 시스템 및 젤 크기도 사용할 수 있지만 전압 및 DNA 이동 시간은 다를 수 있습니다.
- 1x TAE 완충액 (40mM Tr) 100mL에 전기 영동 등급 아가로 오스 1g을 혼합하여 1 % 아가 로스 겔을 제조한다.기지 다. 20 mM 아세트산; 2 mM EDTA; pH 8.5) 및 전자 레인지를 사용하여 아가로 오스가 용해되고 용액이 깨끗해질 때까지. 용액이 50 ° C (약 15 - ....
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결과
세포주 BJ-hTERT (telomerase immortalized human foreskin fibroblasts)와 사람 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 분리 된 3 가지 농도의 DNA (1, 2 및 3μg)를 텔로미어 길이에 대해 분석 하였다. 표 1 은 각 DNA 샘플의 레인 할당을 보여줍니다. 그림 1 은 젤의 핵산 형광 얼룩을 보여줍니다. 분자량 표준이 명확하게 나타납니다. 겔 상단에서 각 분자량 표준까지의 거리를 측정했습니다 ( 그림 2 ). 도 3 은 텔로미어 프로브와의 하이브리드 화 후의 겔의 인산 사진을 도시한다. 텔로미어 밴드는 각 차선에 얼룩으로 표시됩니다. 150 레인의 그리드가 각 레인과 배경 레인에 대해 계산되었습니다 (
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토론
전기 영동 후 게놈 DNA 번짐은 800 bp보다 높습니다. 이는 제한 효소가 결함이거나 추가 효소 (위에서 설명한 바와 같음)가 필요한 경우 발생할 수 있습니다. 두 번째 가능한 설명은 단백질이 여전히 DNA에 붙어 있다는 것입니다. 분광 광도계로 DNA 농도를 측정 할 때 260/280 비율은 약 1.8이어야합니다. 이 비율이 <1.5 인 경우 제한 효소 소화를 방해 할 수있는 단백질 오염이 있습니다. DNA 샘플을 재조직해야하거나 proteinase K 분해 및 페놀 : 클로로포름 추출 후 에탄올 침전으로 단백질을 제거해야합니다. 상업적 DNA 단리 키트의 사용은 일상적으로 1.8-2.85의 260/280 비율의 DNA를 생성합니다.
형광체 스크린에 젤이 노출 된 후에는 텔로미어 조각이 검출되지 않습니다. 이것은 가난한 라디오 라벨 텔로미어 프로브, 부적절한 하이브리드 화조건 또는 불충분 한 양의 게놈 DNA 시작. 텔로미어 프로브를 준비 할 때, G-25 컬럼의 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 부분적으로 P30CA047904 상을 수상한 Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral 종양학 공유 시설의 지원을 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Biologics | |||
| Rsa1, 제한 효소 | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, DNA 분해. Cutsmart Buffer (소화 완충액) |
| Hinf1, 제한 효소 | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, DNA 소화가 포함되어 있습니다. Cutsmart Buffer (소화 버퍼) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | 전기영동 등급 아가로스 |
| Optikinase가 포함되어 있습니다 | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 |
| SYBR 녹색 핵산 얼룩 I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber Green |
| exactGene DNA Ladder 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5) | Integrated DNA Technologies | 맞춤형 DNA 올리고뉴클레오티드 | |
| 감마-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | 방사성 동위원 |
| Qiagen 혈액 및 세포 배양 DNA 미니 키트 | Qiagen | 13323 | DNA 추출 키트 |
| GE Illustra Microspin G-25 column | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | readioactive oligo probe |
| Ficoll 400 | 비이온 합성 고분자 | ||
| 정제용Equipment/Software | |||
| Owl A5 Gel 전기영동 시스템(20cm x 25cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | Gel 전기영 |
| Horizon 11.4 Gel 전기영동 시스템(11cm x 14cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Gel 전기영 |
| 나일론 메쉬, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| GE 스토리지 형광체 스크린 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-75 | |
| 형광체 스크린 노출 카세트 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0035-44 | |
| Isotemp 하이브리드화 인큐베이터 | Fisher Scientific | 13-247-20Q | |
| 원통형 하이브리드화 튜브 | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer 오비탈 쉐이커 | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | 오비탈 셰이커 |
| Typhoon 9400 | ABI | 젤 및 형광체 스크린 이미징용 | |
| GraphPad Prism 6 | GraphPad | 버전 6.05 | 그래프 프로그램 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | 스프레드시트 프로그램 |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Nanodrp 2000 | 분광광도계 |
참고문헌
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H.
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재인쇄 및 허가
