In-gel Hybridization을 이용한 Telomere 길이 정량을위한 수정 된 terminal restriction fragment 분석

Summary

이 기사에서는 텔로미어 길이의 신속하고 효율적인 직접 측정을 제공하는 수정 된 터미널 제한 단편 분석을 사용하여 텔로미어 길이를 정량화하기위한 자세한 프로토콜을 논의합니다. 이 기술은 텔로미어 길이를 정량화하기 위해 DNA의 다양한 세포 공급원에 적용될 수 있습니다.

Abstract

텔로미어 길이를 측정하는 몇 가지 다른 기술이 있습니다. 각각의 장점과 단점이 있습니다. 전통적인 접근 방법 인 Telomere Restriction Fragment (TRF) 분석법은 게놈 DNA 샘플을 제한 효소로 소화시켜 텔로미어 DNA 반복 및 일부 서브 텔로미어 DNA를 남기는 DNA 하이브리드 화 기술을 사용합니다. 이들은 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분리되고, 필터 멤브레인으로 옮겨지고, 화학 발광 또는 방사능으로 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브에 하이브리드 화되어 텔로미어 제한 단편을 시각화한다. 이 접근법은 PCR과 같은 다른 기술보다 많은 양의 DNA를 필요로하지만 세포 집단의 텔로미어 길이 분포를 측정 할 수 있으며 절대 킬로베이스로 표현 된 측정을 허용합니다. 이 원고는 텔로미어 길이를 결정하기위한 수정 된 DNA 하이브리드 화 과정을 보여줍니다. 게놈 DNA는 먼저 제한 효소 (절단하지 않는 게놈텔로미어), 아가 로스 겔 전기 영동으로 분리 하였다. 이어서, 겔을 건조시키고 DNA를 변성시키고 방사성 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브 에 인 시츄 하이브리드 화시킨다. 이 in situ 하이브리드 화는 텔로미어 DNA의 손실을 피하고 신호 강도를 향상시킵니다. 하이브 리다이 제이션 후에, 겔은 형광체 스크린을 이용하여 영상화되고, 텔로미어 길이는 그래프 프로그램을 사용하여 정량화된다. 이 절차는 Drs의 실험실에서 개발되었습니다. Woodring Wright와 Jerry Shay는 텍사스 대학교 남서부 대학교 ¹ 학년 2 학년입니다. 여기에서는 몇 가지 수정 사항을 포함하여이 절차에 대해 자세히 설명합니다.

Introduction

텔로미어 (telomeres)는 염색체의 말단에 위치하고 있으며, 세포 유전 정보를 보호하는 데 중요한 역할을하는 TTAGGG (인간 염색체상의 서열)의 뉴클레오타이드 반복 서열이다 ^{3 , 4 , 5} . 텔로미어는 수천 개의 염기쌍으로 DNA 복제 중에 나머지 염색체의 무결성을 보호하는 역할을합니다. 염색체 복제가 완벽하지 않아서 염색체의 끝이 완전히 복사되지 않습니다. 이러한 복제의 비효율은 "최종 복제 문제"로 불리고 각 복제 라운드 동안 일부 텔로미어 반복을 잃게됩니다 ^{6 , 7} . 텔로미어 길이는 잃어버린 텔로미어 서열 ^{8 , 9} 를 대체하는 효소 인 텔로 머라 아제에 의한 세포 분열 이후에 회복 될 수있다. 그러나, 텔로 머라 아제는결과적으로, 시간이 지남에 따라 텔로미어는 짧아지고 결국 세포 노화가 일어난다. 텔로미어 단축으로 인해 텔로미어는 노화와 노화 관련 질병의 위험성을 나타내는 바이오 마커로 간주됩니다 ^11,12 . 또한 텔로미어 길이는 유전 적, 환경 적, 생활 양식의 요인 및 산화 스트레스와 같은 다른 자극에 영향을 받아 텔로미어 길이가 독성학, 역학 및 행동 연구에서 바이오 마커 역할을 할 수 있음을 나타냅니다 ^{13 , 14 , 15} .

이 기사는 Mender and Shay ² 와 Kimura et al.이 채택한 modified terminal restriction fragment (TRF) 분석을 사용하여 텔로미어 길이를 측정하는 기술을 설명합니다 . ¹⁶ , Herbert, Shay 및 Wrig와 비슷하다.ht ¹ 과 Haussmann과 Mauck ¹⁷ . 전통적으로, TRF 분석은 서던 블롯 절차를 포함합니다. 서던 블롯은 텔로미어 길이를 연구하기위한 "금 표준"으로 간주되며 역학 연구에서 백혈구 텔로미어 길이를 검사하는데 적극적으로 사용됩니다 ¹⁸ . 이 TRF 분석은 텔로미어 반복을 남겨두고 소화 된 게놈 DNA를 사용합니다. 그런 다음 DNA 단편을 겔 전기 영동으로 분리하고 변성시키고 니트로 셀룰로오스 막으로 옮긴다. 텔로미어 서열은 텔로미어 올리고 뉴클레오티드 프로브에 하이브리드 화된다. 분리 된 텔로미어를 멤브레인으로 옮기는 대신, 다른 TRF 기술은 DNA 변성의 유무에 관계없이 in-gel hybridization 기술을 사용합니다. 변성의 포함은 일부 종 ¹⁹ 에서보고 된 간질 텔로미어의 검출을 고려할 때 중요합니다. 변성 단계가없는 절차는 th단일 가닥 DNA는 말단 텔로미어에서 오버행하고 간질 텔로미어 서열 ¹⁸ 에는 결합하지 않을 것이다.

TRF 분석 외에도 텔로미어 길이를 측정하는 몇 가지 다른 기술이 있습니다. 각각의 장점과 단점이 있습니다. Flow-FISH 기술은 유동 세포 계측법을 사용하여 별개의 세포 유형의 개별 세포의 평균 텔로미어 길이를 측정 할 수 있습니다 ^{16 , 20} . Flow-FISH는 자동화를 통해 텔로미어에 고도로 특화된 프로브를 정확하게 표기하고 사람의 실수를 줄이는 한편 비용이 많이 들고 효율적이지 않으며 신선한 샘플과 숙련 된 기술자가 필요하기 때문에 전염병 연구에 대한 능력이 제한됩니다 ¹⁶ . 또한,이 방법은 세포 집단의 염색체 수의 잠재적 변화를 설명하지 못한다. 또 다른 기술인 qPCR은 전염병 연구를위한 텔로미어 길이를 측정하는 수단으로 널리 받아 들여지고있다 ^{16은 다른 방법에 비해 적은 양의 DNA에 대한 높은 처리량, 저비용 및 요구 조건 때문에 발생합니다. 그러나, qPCR은 단일 복사 유전자에 비례하여 평균 텔로미어 DNA 함량만을 측정 할 수 있으며, 따라서 평균 텔로미어 길이의 간접적 인 추정치이다. 또한 남부 연구와 비교하여 비교 연구에서 높은 변동 계수를 산출하여 의심스러운 정확도 21로 이어진다.}

재단 절차에는 일부 연구에 대한 사용을 제한하는 자체 결함이 있습니다. TRF 기술은 다른 방법에 비해 많은 양의 DNA가 필요합니다 (시료 당 2 ~ 3 μg). 이것은 충분한 게놈 DNA가 수집 될 수 있고 분해 된 DNA 샘플에는 사용할 수없는 임상 샘플의 텔로미어 길이를 검사하는 기술의 적용을 제한합니다. 또한, TRF 분석은 값 비싸고 노동 집약적이어서 결과를 산출하는 데 4-5 일이 걸립니다. 그러나 TRF는 낮은 변동 계수를 산출합니다.재현성을 부여합니다. 이 프로토콜은 기존의 Southern blot ( in situ gel hybridization을 사용)과 다르지만, 두 기술은 근본적으로 같습니다.

여기에 제시된 기술은 Southern blot과 in-gel hybridization의 조합입니다. Southern blots의 DNA 변성 단계를 in-gel hybridization과 관련 짓습니다. 이 조합은 서던 블롯에 비해 향상된 프로브 신호 강도의 추가 이점을 가지며 우리 연구실 내에서 지속적으로 정량화 가능한 결과를 산출했습니다. 또한 화학 발광 탐침보다 방사능 탐침을 사용하면 신호 강도가 높아지며 phosphorimager로 시각화 및 정량화가 가능하여 사용자 친화적 인 TRF 분석이 가능합니다.

Protocol

1. 게놈 DNA 추출

1. 제조 업체의 지침에 따라 상용 DNA 추출 키트를 사용하여 분석 할 세포 (여기, 세포 라인 BJ - hTERT)에서 게놈 DNA 추출을 수행합니다.
2. 분광 광도계로 DNA 농도를 측정하십시오. DNA 농도가 100 μg / mL 미만이면 에탄올로 DNA를 침전시키고 TE 완충액 (10 mM Tris-Cl, 0.1 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid), pH 8.0)에 재현 탁하여 DNA 농도를 100-600 μg / mL).

2. DNA 무결성 평가

참고 : 프로토콜의이 부분은 11cm x 14cm 젤이있는 겔 전기 영동 시스템을 사용하여 DNA 무결성 평가를 설명합니다. 다른 시스템 및 젤 크기도 사용할 수 있지만 전압 및 DNA 이동 시간은 다를 수 있습니다.

1. 1x TAE 완충액 (40mM Tr) 100mL에 전기 영동 등급 아가로 오스 1g을 혼합하여 1 % 아가 로스 겔을 제조한다.기지 다. 20 mM 아세트산; 2 mM EDTA; pH 8.5) 및 전자 레인지를 사용하여 아가로 오스가 용해되고 용액이 깨끗해질 때까지. 용액이 50 ° C (약 15 - 20 분)에 도달 할 때까지 실온에서 냉각시킵니다.
2. 아가로 오스 용액이 냉각되는 동안 주조 트레이에 주조 종단 게이트를 추가하여 겔 주 조용 트레이를 준비하십시오. 아가로 오스 누출을 방지하기 위해 주조 트레이에 부착하기 전에 4 ° C까지 최종 게이트를 냉각하십시오.
3. 아가로 오스 솔루션이 50 ° C로 냉각되면 에티 디움 브로마이드 (dH ₂ O에 10 MG / ML) 10 μL를 추가하고 겔 주조 트레이에 아가로 오스 솔루션을 부어. 캐스팅 트레이에 빗을 추가하십시오.
4. 실온에서 아가로 오스 솔루션을 45 분 동안 경화시킵니다.
5. 1 μL TE 버퍼를 사용하여 25 ng의 게놈 DNA를 희석하여 9 μL의 최종 부피로 희석하고 10x 로딩 염료 (0.25 % (w / v) 브로 모 페놀 블루, 0.25 % (w / v) 자일 렌) 1 μL를 첨가하여 전기 영동을위한 DNA 샘플을 준비합니다. 시아 놀 FF, 30 % (v / v) 글리세롤). 잘 섞다.
6. 버퍼 레벨이 겔 위의 수 밀리미터가되도록 전기 영동 시스템에 1x TAE 완충액을 채워 DNA 이동을위한 겔 전기 영동 시스템을 준비합니다. DNA 샘플 전체와 함께 겔의 우물을로드하십시오. 하나의 우물에 DNA 사다리 5 μL를 첨가하십시오.
7. 약 2 시간 동안 또는 bromophenol 블루 염료가 젤을 통해 약 절반 방법 때까지 100V에서 DNA 마이 그 레이션을 실행합니다.
8. 이미지는 자외선 transilluminator 또는 동급을 사용하여 젤.
   참고 : 좋은 무결성을 가진 DNA 샘플은 얼룩이없는 고 분자량 밴드를가집니다 (즉, 전단되거나 파손 된 DNA로 인한 것임). DNA 밴드가 얼룩 져 있다면, 그들은 완전성이 낮고 서던 블롯 분석에 적합하지 않으며, DNA는 새로운 세포로 재분석되어야합니다.

3. 게놈 DNA 분해

1. 20 ~ 40 μL의 최종 부피에서 게놈 DNA의 소화를 수행하십시오.
   참고 : 더 큰 볼륨40 μL 이상이 아가로 오스 겔의 우물을 오버 플로우시킵니다.
   1. 마이크로 튜브에서 최종 농도가 1x가되도록 3 μg의 게놈 DNA와 10x DNA 분해 완충액 (제한 효소와 함께 공급)을 합칩니다. RsaI 제한 효소 (10,000 U / mL) 1 μL와 HinfI 제한 효소 (10,000 U / ML) 1 μL를 각 튜브에 첨가한다. 멸균, 탈 이온화 H ₂ O를 사용하여 최종 부피를 조절합니다. 잘 혼합합니다. 모든 구성 요소가 튜브의 바닥에 있는지 확인하기 위해 잠깐 (16,000 xg에서 10-15 초) 원심 분리하십시오.
2. 소화를 37 ° C에서 ≥16 시간 동안 품어 낸다. 소화가 끝나면 소화 한 DNA를 4 ° C 또는 -20 ° C에서 2 일 이상 보관하십시오.

4. 게놈 DNA 겔 전기 영동

참고 : 프로토콜의이 부분은 20cm x 25cm 겔 전기 영동 시스템을 사용하기위한 절차를 설명합니다. 다른 젤 전기포 레이션 시스템이 사용될 수 있지만, 전압, 이동 시간 및 최적의 결과를 산출하기 위해 시스템에 첨가 된 전기 영동 버퍼의 양을 포함하여 여러 변수가 수정 될 필요가있을 수있다.

1. 전기 영동 완충액, 1x TAE 또는 0.5x TBE (110 MM 트리스베이스, 90 MM 붕산, 2.5 MM EDTA, pH 8.3) 375 ML과 겔 전기 영동 학년 아가로 오스 2.25 g을 결합하여 0.6 % 아가로 오스 솔루션을 준비합니다.
   참고 : 8,000 kB 미만의 텔로미어의 경우 0.5 x TBE가 권장되는 반면 텔렉스는 8,000 kB와 20,000 kB ¹ 사이에 1x TAE가 권장됩니다.
2. 아가로 오스가 녹고 용액이 깨끗해질 때까지 마이크로 웨이브하십시오. 실온에서 또는 아가로 오스가 50 ℃에 도달 할 때까지 용액을 15-20 분 동안 냉각시킨다.
3. 아가로 오스 용액이 냉각되는 동안 2.2 단계에서 설명한대로 겔 캐스팅을위한 겔 전기 영동 시스템을 준비하십시오. 아가 로즈 젤 솔루션을 겔 주조 트레이에 붓는다. 빗을 넣으십시오.젤. 상온에서 겔을 45 분 동안 경화 시키십시오.
4. 전기 영동을 위해 소화 된 DNA 샘플을 준비하십시오. 40 uL 반응의 경우, 소화 된 DNA의 각 샘플에 0.4xL의 10x loading dye를 첨가하십시오. 간단히 원심 분리 (10-15 초, 16,000 xg)하여 모든 용액이 튜브의 바닥에 있는지 확인하십시오.
5. DNA 이동을위한 겔 전기 영동 시스템을 준비하십시오. 젤에서 엔드 게이트와 빗을 제거합니다. 겔 전기 영동 시스템을 1x TAE 또는 0.5x TBE로 충전 라인에 채우십시오. 젤이 완충액에 완전히 잠기도록하십시오.
6. 샘플 사이에 빈 우물이 있도록 DNA 샘플로 겔의 우물을로드하십시오. 거품을 발생 시키거나 젤에 구멍을 뚫지 마십시오. 겔의 반대쪽 끝에 우물에 DNA 사다리 10 μL를 추가합니다.
   참고 : DNA 사다리의 유형은 텔로미어의 길이에 따라 달라지며, 사람마다 차이가 있으며 셀 소스마다 다릅니다.
7. 1에서 겔 전기 영동을 실행하십시오.DNA를 겔 속으로 신속하게 이동시키기 위해 30 분 동안 50V; 전압을 57V로 조절하고 18-24 시간 동안 작동시킨다.

5. 겔 형광 이미징 및 하이브리드 화

1. 18-24 시간 후 겔 전기 영동 전원을 끄십시오. 전기 영동 버퍼에서 젤로 겔 주조 트레이를 제거합니다. 젤의 오른쪽 위 모서리를 잘라 젤 방향에 대한 참조로 사용하십시오.
2. 종이를 젤보다 약간 큰 크기로 절단하여 여과지를 준비하십시오. 여과지를 캐스팅 트레이의 젤 위에 올려 놓고 종이가 젤에 과도한 용액을 흡수하도록합니다. 조심스럽게 필터 종이와 젤 사이의 기포를 롤러로 피펫을 사용하여 측면을 통해 밖으로 짜내십시오.
3. 용지가 젤 아래에 있도록 겔과 여과지를 뒤집어 주물 트레이에서 젤을 꺼내십시오. 거름 건조기로 여과지로 젤을 옮기고플라스틱 랩이있는 젤. 피펫을 롤러로 사용하여 플라스틱 랩과 젤 사이의 모든 기포를 제거합니다.
4. 50 ° C에서 2 시간 동안 겔을 건조시킨다.
5. 일단 건조, 플라스틱 포장을 제거하고 탈 이온수 (겔을 커버하기에 충분한) 250 ML을 포함하는 유리 접시에 젤과 여과지를 전송. 조심스럽게 여과지를 꺼내 15 분 동안 실온에서 겔을 배양하십시오. 젤은 얇고 단단하며 쉽게 찢어지지 않고 조작 할 수 있습니다.
6. 탈 이온수에 5x SSC 솔루션 (750 MM NaCl, 75 MM sodium citrate)을 준비합니다.
7. 나일론 메쉬 (12 in x 12 in) 위에 젤을 놓습니다. 나일론 메쉬를 굴려 젤이 스스로 접촉하지 않도록 확인하십시오. 하이브리드 튜브 ( 예 : 직경이 1.5 인 튜브에 12 개)에 메시와 젤을 놓습니다.
   참고 : 제대로 말아 올리면 젤이 양쪽의 나일론 메쉬와 접촉하게됩니다.
8. 5x SSC 100 μL와 녹색 형광 핵산 12 μL를 합칩니다.시드 얼룩을 제거하고 하이브리드 화 튜브에 넣습니다. 빛으로부터 용액을 보호하고 42 ° C에서 30 분 동안 배양하십시오. 회전이있는 혼성화 오븐에서하십시오.
9. 하이브 리다이 제이션 튜브에서 나일론 메쉬 / 겔을 꺼내어 롤을 열고 250mL의 탈 이온수가 들어있는 유리 접시에 평평하게 놓고 부드럽게 나일론 메쉬를 제거합니다. phosphorimager를 사용하여 이미지 젤. 형광등 설정을 사용하십시오 : 520 BP, 40 Blue 및 488 nm. 광전관 증 배관 (PMT)을 375로 설정하고 초점 평면을 +3 mm로 설정하고 감도를 정상으로 설정합니다. 이미지를 파일에 저장하십시오.

6. 하이브리드 화

1. 방사성 텔로미어 탐침을 준비하십시오.
   1. 텔로미어 프로브 (5- (CCC TAA) ₄ 3 ') 2 μL (2 ng), 10x 폴리 뉴클레오타이드 키나아제 반응 완충액 2.5 μL, γ ³² P-dATP (6,000 Ci / mmol) 3 μL, T4 4 μL 폴리 뉴클레오타이드 키나아제 및 DNase를 함유하지 않는 멸균 탈 이온수를 micr원심 분리기 튜브.
      주의 : 방사능을 사용할 때는 시설의 방사능 안전 및 규정을 준수하십시오.
2. 간단히 원심 분리 (16,000 xg에서 10-30 초)하고 37 ° C의 수 욕조에서 1 시간 동안 배양하십시오. 16,000 XG에서 10-30 초 동안 원심 분리하고 반응을 멈추기 위해 65 ° C에서 20 분 동안 품다.
3. G-25 크로마토 그래피 마이크로 스핀 컬럼을 사용하여 볼 텍싱 (vortexing)하여 컬럼의 내용물을 혼합 한 후 실온에서 700 xg에서 1 분간 원심 분리합니다. 여액을 버린다.
4. 방사성 탐침 용액을 G-25 크로마토 그래피 칼럼에 넣고 700 x g에서 2 분간 원심 분리한다. 여과 액을 저장하십시오.
   참고 : 방사성 텔로미어 프로브가 들어 있으므로 여액을 보관하십시오. 방사성 탐침은 필요할 경우 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.
5. 멸균 탈 이온수에서 1.5M NaCl과 0.5M NaOH로 구성된 변성 용액 250mL를 준비한다.
6. 겔을 250 mL의 변성 용액과 배양액이 들어있는 유리 접시에 넣으십시오실온에서 15 분간 먹었다. 변성 용액을 제거하고 멸균 된 탈 이온수 250 mL로 교체하십시오. 실온에서 궤도 진탕 기 (40 - 50 rpm)에서 10 분 동안 품어 낸다.
7. 멸균 탈 이온수에서 1.5 NaCl 및 0.5 M 트리스 - 염산, pH 8.0로 구성된 중화 용액 250 mL를 준비한다.
8. 탈 이온수를 제거하고 250 ML 중화 솔루션으로 교체하고 실온에서 15 분 품어.
9. 중화 용액에서 배양하는 동안 5x SSC, 5x 덴 하르트 용액 (0.1 % 비이 온성 합성 중합체, 0.1 % 폴리 비닐 피 롤리 딘, 0.1 % 소 혈청 알부민), 10 mM 인산이 나트륨 (Na ₂ HPO ₄ ) 및 1 mM 피로 인산 나트륨 ₄ 수화물 10 수화물 (Na ₄ P ₂ O _{7 ·} 10 H ₂ O)을 멸균 탈 이온수에 용해시켰다.
10. 겔을 나일론 메쉬에 넣고 하이브리드 화 튜브에 넣습니다 (단계5.7). 하이브 리다이 제이션 솔루션 20 ML을 추가하고 회전과 함께 10 분 42 ° C에서 하이브 리다이 제이션 오븐에서 품다.
11. 하이브 리다이 제이션 솔루션을 제거하고 신선한 하이브 리다이 제이션 솔루션 20 ML로 바꿉니다. 텔로미어 프로브 전체를 첨가하고 혼성화 오븐에서 42 ° C로 밤새 배양하십시오.

7. 젤 세척, 형광체 스크린 노출 및 라디오 이미징

1. 멸균 탈 이온수에서 2x SSC 솔루션 (300 MM NaCl, 30 MM 나트륨 구연산염) 500 ML을 준비합니다.
2. 탈 이온수에서 0.1x SSC (15mM NaCl, 1.5mM 시트르산 나트륨) 및 0.1 % Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)를 250mL 준비한다.
3. 하이브 리다이 제이션 튜브에서 겔과 메쉬를 제거하고 2x SSC 250 ML을 포함하는 유리 접시에 놓습니다. 접시에서 나일론 메쉬를 풀어 제거합니다. 궤도 진탕 쉐이커 위에 유리 접시를 놓고 실온에서 15 분 동안 품어 라.
4. 2x SSC를 제거하고 250x1x SSC 및 0으로 교체하십시오.1 % SDS 솔루션, 그리고 실내 온도에서 궤도 진탕제에 15 분 동안 품어.
5. 부화 도중, Phosphor 스크린을 이미지 지우개에 15 분간 노출시킵니다.
6. 0.1x SSC 및 0.1 % SDS 솔루션을 제거하고 250x2x SSC로 교체하십시오. 궤도 진탕 기에서 15 분 동안 품어 낸다.
7. 2x SSC 용액에서 겔을 꺼내고 플라스틱 랩으로 젤을 감싸거나 열 밀봉 성 파우치에 넣으십시오. 젤과 플라스틱 랩 또는 플라스틱 주머니 사이의 모든 거품과 공기 포켓을 제거하십시오. Phopshor 화면이있는 노출 카세트에 젤을 넣으십시오. 하룻밤 형광체 화면을 젤에 노출 시키십시오.
8. phosphorimager를 사용하여 노출 된 형광체 화면을 이미지화하십시오.

8. 텔로미어 길이 정량

1. 녹색 형광 핵산으로 염색 된 젤 ( 그림 1 )의 형광 이미지가 들어있는 phosphorimager 파일을 엽니 다.
2. '도구'를 선택한 다음 '픽셀 거리'를 선택하십시오.9; 마우스를 사용하여 겔의 바닥에서 첫 번째 마커 밴드의 중간까지 선을 그린 다음 거리를 기록하십시오. 각 마커 밴드에 대해이 절차를 반복하십시오 ( 그림 2 ). 이 거리는 아래 설명 된 그래프 프로그램에서 사용됩니다.
3. 방사성 표지 된 젤의 phosphorimage를 엽니 다 ( 그림 3 ). 'Object Manager'를 선택한 다음 'Grid'를 선택하십시오. 격자를 1 열 150 행으로 설정하십시오. 격자가 젤의 맨 위에서 젤의 바닥까지 뻗어 지도록 그리드를 조정하십시오. 눈금의 너비를 조정하고 눈금 가장자리를 클릭하고 눈금의 너비를 끌어 레인의 너비와 같게하십시오.
4. 이 격자를 복사하여 (상자의 너비와 높이가 동일하게 유지되도록) 두 번째 격자를 빈 레인으로 이동하십시오 (배경 목적으로). 추가 표 차선을 위해 추가 그리드를 계속 복사하고 이동하십시오.
   참고 : 끝나면 있어야합니다.각 표본 레인에 대한 그리드와 배경에 대한 빈 레인의 한 표 ( 그림 4 ).
5. '분석'을 선택하고 '볼륨 보고서'를 선택한 다음 보고서의 모든 그리드를 선택합니다. 볼륨 보고서가 표시되면 보고서를 두 번 클릭하여 스프레드 시트 프로그램을 활성화하십시오. 스프레드 시트 파일 저장이 파일의 데이터는 'Volume'차선 아래.
6. 적절한 그래프 프로그램을 열고 새로운 데이터와 테이블을 만듭니다. 'Y : 각 점에 대해 하나의 Y 값 입력'을 선택한 다음 '작성'을 선택하십시오.
7. 첫 번째 열 (X 열)을 'Measured Distance'로 표시하고 두 번째 열 (Column Y)을 '분자량'으로 표시합니다. Y 열에 각 마커 밴드의 마커 분자량을 입력하십시오. 각 분자량 마커에 해당하는 8.2 단계에서 얻은 이동 거리를 입력하십시오.
8. '분석'으로 가서 '분석'을 선택한 다음 '비선형 회귀 분석'을 선택하십시오.on (curve fit) '을 선택하고'OK '를 선택하십시오. 다음 화면에서 '지수'를 선택하고 '한 단계 감쇠'를 선택하십시오. '범위'탭을 선택하고 '곡선을 정의하는 점 수'에 '150'을 입력하고 '곡선을 다른 프로그램으로 내보내거나 복사 할 XY 좌표 테이블 만들기'를 선택하십시오.
   참고 : '데이터 1의 비선형 적합'결과에는 Y 행의 각 거리에 대한 분자량이 포함됩니다.
9. 샘플 차선을 분석하려면 실제 텔로미어 밴드 위아래 인 분석 영역을 선택하십시오. 차선의 전체 길이를 사용하지 마십시오 ( 그림 5 ). 각 차선의 분석 영역에 대한 그리드 위치를 결정합니다.
10. '파일', '새로 만들기', '새 표 및 그래프 만들기'를 선택하십시오. 'Y : 각 점에 대해 하나의 Y 값 입력'을 선택한 다음 '작성'을 선택하십시오. 스프레드 시트 파일에서 배경 레인 볼륨 값 (강도 값)을 복사하여 붙여 넣기샘플 레인에서 첫 번째 열 Y 로의 볼륨 값 (강도 값)과 첫 번째 열 (X)에 입력합니다. 여러 샘플 레인이있는 경우 스프레드 시트 파일의 각 볼륨 값 집합을 그래프 프로그램의 추가 Y 열로 복사합니다 파일.
11. 단계 8.8에서 결정한 분석 영역 밖에있는 백그라운드 열 (X) 및 각 샘플 레인 (Y)에서 값을 삭제하십시오.
    참고 : 데이터 테이블에는 분석 영역에 해당하는 그리드 위치의 값만 포함해야합니다.
12. 분석을 선택한 다음 '분석'및 '변환'을 선택하십시오. '확인'을 클릭하십시오. 'Y = YX를 사용하여 Y 값 변환'을 선택하십시오. 그러면 데이터 2의 데이터가 변환됩니다 (변환 된 강도 값 (Y) = 샘플 강도 (Y) - 배경 강도 (X)).
    1. 분석을 선택한 다음 '분석', '열 분석'및 '열 통계'를 선택하십시오. 확인을 선택하십시오. 결과 탭의 Col. 데이터 2 '의 변환 통계'Sum'행 아래, Σ (Int _i ).
13. 'File', 'New', 'Create New Table and Graph'를 선택하십시오. 'Y : 각 점에 대해 하나의 Y 값 입력'을 선택한 다음 '작성'을 선택하십시오. 결과 페이지 'Data 1, Curve Nonlin fit of'의 Y 열 데이터를 복사하여 새 X 열에 붙여 넣습니다. 결과 페이지 '데이터 2의 변환'에서 Y 열 데이터를 복사하여 새로운 Y 열에 붙여 넣습니다. 분석을 선택한 다음 '분석'및 '변환'을 선택하십시오. '확인'을 클릭하십시오. 'Y = Y / X를 사용하여 Y 값 변환'을 선택하십시오.
    1. 분석을 선택한 다음 '분석', '열 분석'및 '열 통계'를 선택하십시오. 확인을 선택하십시오. 결과 탭의 Col. 데이터 3의 변환 통계는 '합'행 아래에 Σ (Int _i / MW _i )를 표시합니다. MW = 분자량.
14. 각 샘플에 대한 평균 텔로미어 길이 (TL)를 계산하려면,수식 TL = Σ (Int _i ) / Σ (Int _i / MW _i ).

Results

세포주 BJ-hTERT (telomerase immortalized human foreskin fibroblasts)와 사람 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 분리 된 3 가지 농도의 DNA (1, 2 및 3μg)를 텔로미어 길이에 대해 분석 하였다. 표 1 은 각 DNA 샘플의 레인 할당을 보여줍니다. 그림 1 은 젤의 핵산 형광 얼룩을 보여줍니다. 분자량 표준이 명확하게 나타납니다. 겔 상단에서 각 분자량 표준까지의 거리를 측정했습니다 ( 그림 2 ). 도 3 은 텔로미어 프로브와의 하이브리드 화 후의 겔의 인산 사진을 도시한다. 텔로미어 밴드는 각 차선에 얼룩으로 표시됩니다. 150 레인의 그리드가 각 레인과 배경 레인에 대해 계산되었습니다 (

Discussion

전기 영동 후 게놈 DNA 번짐은 800 bp보다 높습니다. 이는 제한 효소가 결함이거나 추가 효소 (위에서 설명한 바와 같음)가 필요한 경우 발생할 수 있습니다. 두 번째 가능한 설명은 단백질이 여전히 DNA에 붙어 있다는 것입니다. 분광 광도계로 DNA 농도를 측정 할 때 260/280 비율은 약 1.8이어야합니다. 이 비율이 <1.5 인 경우 제한 효소 소화를 방해 할 수있는 단백질 오염이 있습니다. DNA 샘플을 재조직해야하거나 proteinase K 분해 및 페놀 : 클로로포름 추출 후 에탄올 침전으로 단백질을 제거해야합니다. 상업적 DNA 단리 키트의 사용은 일상적으로 1.8-2.85의 260/280 비율의 DNA를 생성합니다.

형광체 스크린에 젤이 노출 된 후에는 텔로미어 조각이 검출되지 않습니다. 이것은 가난한 라디오 라벨 텔로미어 프로브, 부적절한 하이브리드 화조건 또는 불충분 한 양의 게놈 DNA 시작. 텔로미어 프로브를 준비 할 때, G-25 컬럼의 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biologics
Rsa1, 제한 효소	New England Biolabs, Inc	R0167S	10,000 U/mL, DNA 분해.  Cutsmart Buffer (소화 완충액)
Hinf1, 제한 효소	New England Biolabs, Inc	R0155S	10,000 U/mL, DNA 소화가 포함되어 있습니다. Cutsmart Buffer (소화 버퍼)
Seakem GTG Agarose	Lonza	50071	전기영동 등급 아가로스
Optikinase가 포함되어 있습니다	affymetrix	78334X 500 UN	T4 폴리뉴클레오티드 키나아제
SYBR 녹색 핵산 얼룩 I	ThermoFisher Scientific	S7567	Syber Green
exactGene DNA Ladder 24- kB	Fisher Scientific	BP2580100
C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5)	Integrated DNA Technologies		맞춤형 DNA 올리고뉴클레오티드
감마-ATP-P32	Perkin Elmer	BLU502Z	방사성 동위원
Qiagen 혈액 및 세포 배양 DNA 미니 키트	Qiagen	13323	DNA 추출 키트
GE Illustra Microspin G-25 column	GE Healthcare Life Sciences	27-5325-01	readioactive oligo probe
Ficoll 400			비이온 합성 고분자
정제용Equipment/Software
Owl A5 Gel 전기영동 시스템(20cm x 25cm)	ThermoFisher Scientific	A5	Gel 전기영
Horizon 11.4 Gel 전기영동 시스템(11cm x 14cm)	Corel Life Sciences	11068020	Gel 전기영
나일론 메쉬, 50, 12" x 12"	Ted Pellam, Inc	41-12105
GE 스토리지 형광체 스크린	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-75
형광체 스크린 노출 카세트	GE Healthcare Life Sciences	63-0035-44
Isotemp 하이브리드화 인큐베이터	Fisher Scientific	13-247-20Q
원통형 하이브리드화 튜브	Fisher Scientific	13-247-300
The Belly Dancer 오비탈 쉐이커	Sigma-aldrich	Z768499-1EA	오비탈 셰이커
Typhoon 9400	ABI		젤 및 형광체 스크린 이미징용
GraphPad Prism 6	GraphPad	버전 6.05	그래프 프로그램
Microsoft Excel	Microsoft	Office 365	스프레드시트 프로그램
Nanodrop	Thermo Scientific	Nanodrp 2000	분광광도계